郭慧蓮，鄭圣坤，陳志穎，黃紹梅

1.廣州市胸科醫(yī)院兒科住院部，廣東廣州 510095；2.廣州市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510095

結(jié)核病是嚴(yán)重危害全球兒童健康的傳染病，2021 年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）全球結(jié)核病報(bào)告，估算2020 年全球新發(fā)結(jié)核病例990 萬(wàn)，其中約109 萬(wàn)兒童，約20 萬(wàn)兒童死亡[1-2]。研究表明，結(jié)核性腦膜炎（tuberculous meningitis, TBM）是兒童結(jié)核病死亡的重要原因[3]。結(jié)核分枝桿菌主要存在于感染者肉芽腫巨噬細(xì)胞中，細(xì)胞介導(dǎo)免疫的活化巨噬細(xì)胞吞噬、滅殺結(jié)核菌，CD4+細(xì)胞在該免疫過(guò)程中具有重要作用[4]。TBM的發(fā)生及預(yù)后與T 淋巴細(xì)胞功能息息相關(guān)[5]。針對(duì)結(jié)核菌侵入人體產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)，臨床常用細(xì)胞免疫診斷方法有結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（tuberculin skin testing, TST）及γ-干擾素釋放試驗(yàn)（interferon gamma release assays, IGRAs）[6-7]。當(dāng)前，少 有研究比較TBM 患兒血IGRAs、TST 情況。本研究擬比較廣州市胸科醫(yī)院2018 年1 月—2021 年10 月共51 例外周血CD4+細(xì)胞數(shù)正常的TBM 患兒IGRAs 及TST陽(yáng)性率，協(xié)助了解患兒細(xì)胞免疫反應(yīng)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取于本院住院診斷為T(mén)BM 的51 例患者為研究對(duì)象，其中男27 例，女24 例；年齡2 個(gè)月～14 歲；其中嬰兒4 例，幼兒7 例，學(xué)齡前11 例，學(xué)齡期29例。根據(jù)TBM 的改良的英國(guó)醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)分期標(biāo)準(zhǔn)（British Medical Research Council， MRC）其中格拉斯哥昏迷評(píng)分（Glasgow Coma Scale, GCS）15 分且無(wú)局灶性神經(jīng)損傷（MRC Ⅰ期）36 例，GCS 11～14分或GCS 為15 分伴局灶神經(jīng)損傷表現(xiàn)（MRC Ⅱ期）11 例，GCS≤10 分（MRC Ⅲ期）4 例。研究對(duì)象監(jiān)護(hù)人均已簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)TBM 評(píng)分系統(tǒng)，頭顱MRI 檢查結(jié)果，評(píng)分≥12 分的患兒，以及有TBM 臨床表現(xiàn)，CT、MRI 或彩超提示存在頭顱以外其他部位結(jié)核依據(jù)并且痰、胃液、肺泡灌洗液、淋巴結(jié)、大小便、血清抗酸染色、結(jié)核分枝桿菌核酸或結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性者，并符合以下任何一項(xiàng)的患兒：①腦脊液抗酸染色陽(yáng)性；②腦脊液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性；③腦脊液中結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)陽(yáng)性；④腦或脊髓組織病理學(xué)檢查符合結(jié)核病病理學(xué)改變，且抗酸染色陽(yáng)性或病理分子生物學(xué)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。排除標(biāo)準(zhǔn)：①反復(fù)住院的同一患兒；②未同時(shí)進(jìn)行兩項(xiàng)檢測(cè)方法患兒；③HIV 陽(yáng)性；④先天免疫缺陷病患兒；⑤長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑患兒；⑥無(wú)卡介苗接種史患兒[8-9]。

1.3 方法

IGRAs：嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，抽取患兒靜脈血3～6 mL，使用酶聯(lián)免疫法的試劑盒，在空白對(duì)照管（N）、結(jié)核抗原管（T）及陽(yáng)性對(duì)照管（M）中各加入受檢血液1 mL 后立刻充分振搖10 次，采血16 h 內(nèi)37℃進(jìn)行孵育，孵育結(jié)束后離心收集血漿，血漿放置在2～8℃，12 h 內(nèi)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果錄入QFT 分析軟件進(jìn)行計(jì)算來(lái)確定每個(gè)檢測(cè)血漿樣本中γ-干擾素(interferon-γ, IFN-γ)濃度。

TST：吸取5 IU 結(jié)核菌素純蛋白衍化物在患兒左前臂掌側(cè)中下1/3 進(jìn)行皮內(nèi)注射，至出現(xiàn)6～10 mm 圓皮丘，皮試后禁止抓撓及摩擦注射部位，72 h 后觀察皮膚反應(yīng)情況，以測(cè)量硬結(jié)的縱橫徑來(lái)記錄反應(yīng)范圍，取兩者平均值來(lái)判斷反應(yīng)強(qiáng)度。

1.4 觀察指標(biāo)

IGRAs 結(jié) 果 判 定：①當(dāng)N≤8.0 IU/mL，T-N≥0.35 IU/mL 和≥25%N，M-N 任何值，結(jié)果為陽(yáng)性，提示可能存在結(jié)核感染T 細(xì)胞免疫反應(yīng)；②當(dāng)N≤8.0 IU/mL，T-N≥0.35 IU/mL 和＜25%N，M-N≥0.5，結(jié)果為陰性，提示可能不存在結(jié)核感染的T 細(xì)胞免疫 反 應(yīng)；③當(dāng)N≤8.0 IU/mL，T-N≥0.35 IU/mL 和＜25%N 或T-N＜0.35，M-N＜0.5，以及當(dāng)N＞8.0，T-N 及M-N 為任何值結(jié)果均為不確定，代表不能確定是否存在結(jié)核感染的T 細(xì)胞免疫反應(yīng)。

TST 結(jié)果判讀：①（橫徑+縱徑）/2≥5 mm 或皮試部位周?chē)霈F(xiàn)雙圈、水泡、壞死、淋巴管炎為陽(yáng)性，提示存在結(jié)核分枝桿菌感染或接種過(guò)卡介苗；②（橫徑+縱徑）/2＜5 mm 為陰性，除外重癥結(jié)核、免疫缺陷性疾病、長(zhǎng)期使用免疫抑制劑等因素所致假陰性，提示可能不存在結(jié)核分枝桿菌感染。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和百分比（%）表示。

2 結(jié)果

IGRAs 陰性5 例，占比9.8%，陽(yáng)性46 例，占比90.2%，TST 陰性30 例，占比58.8%，陽(yáng)性21 例，占比41.2%。

3 討論

TBM 是最嚴(yán)重的一種肺外結(jié)核，兒童發(fā)病率較成人高，病死率高，存活者易遺留神經(jīng)后遺癥[10]。TBM 主要通過(guò)血行播散引起，CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群在結(jié)核分枝桿菌的免疫中發(fā)揮非常重要的作用?；罨腃D4+T 淋巴細(xì)胞通過(guò)分泌腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IFN-γ 并激活巨噬細(xì)胞等方式遏制結(jié)核分枝桿菌的擴(kuò)散[4]。臨床上最常用于診斷結(jié)核感染的IGRAs 與TST 也需要CD4+T淋巴細(xì)胞功能正常。關(guān)于CD4+T 淋巴細(xì)胞與兒童TBM，目前多數(shù)研究主要集中在兒童TBM 的CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)的變化，但臨床上部分TBM 患兒CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)正常范圍，本研究通過(guò)對(duì)比CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)正常的TBM 患兒IGRAs 與TST 的陽(yáng)性率，發(fā)現(xiàn)TBM 患兒IGRAs 陽(yáng)性率顯著高于TST，IGRAs 陰性患兒的TST 均陰性。

結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體后，釋放出結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶（early secretary antigenic target,ESAT-6）、培養(yǎng)濾液蛋白10（10-kDa culture filtrate protein, CFP-10）等特異性抗原，被加工呈遞給特異性T 淋巴細(xì)胞形成特異的記憶T 細(xì)胞。IGRAs 檢測(cè)該特異性T 淋巴細(xì)胞再次遇到結(jié)核抗原刺激時(shí)釋放的IFN-γ 數(shù)值[6]。而TST 是皮下注射結(jié)核桿菌相關(guān)抗原，使得致敏的淋巴細(xì)胞釋放可溶性淋巴因子，增加了血管壁通透性，同時(shí)巨噬細(xì)胞在局部皮膚聚集、浸潤(rùn)，最終檢測(cè)局部形成紅腫硬結(jié)大小及是否水泡等反應(yīng)。從原理上可知,兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性結(jié)果均能反映機(jī)體抗結(jié)核的細(xì)胞免疫狀態(tài)。在本研究中，TBM 患兒IGRAs 陽(yáng)性占比90.2%，TST陽(yáng)性占比41.2%，這提示CD4+淋巴細(xì)胞數(shù)正常的情況下IGRAs 更能顯示出機(jī)體抗結(jié)核的細(xì)胞免疫狀態(tài)。

排除CD 細(xì)胞數(shù)影響的情況，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)TBM 患者IGRAs 陽(yáng)性率高于TST[2,12-14]，這可能是由于TST 不僅要求致敏CD4+細(xì)胞免疫功能正常，同時(shí)需要其有效地找到注射部位[10]。如薛紅超[11]、朱海妹等[12]研究發(fā)現(xiàn)在肺結(jié)核病、結(jié)核病中IGRAs 的陽(yáng)性率分別為90.7%、90.4%，TST 的陽(yáng)性率分別為47.02%、76.7%，而張春艷等[13]對(duì)比非TBM 患者發(fā)現(xiàn)TBM 患者的IGRAs 陽(yáng)性率為90.2%，PPD 的陽(yáng)性率為64.5%，母發(fā)光等[14]亦研究發(fā)現(xiàn)TBM 患兒IGRAs陽(yáng)性率為87.50%，而PPD 陽(yáng)性率僅為56.25%，這與本研究中患兒的IGRAs 陽(yáng)性率90.2%、TST 陽(yáng)性率41.2%的結(jié)果相符。

臨床上，TBM 患者多存在細(xì)胞免疫功能抑制的狀態(tài)，主要包括CD4+細(xì)胞數(shù)降低及其功能異常[15]。賀瑩等[16]發(fā)現(xiàn)外周血CD4+細(xì)胞低于正常健康者，同時(shí)楊碩等[17]研究亦發(fā)現(xiàn)結(jié)核組CD4+細(xì)胞顯著低于健康對(duì)照組，其中包括TBM 在內(nèi)的肺外組比肺內(nèi)組明顯，且年齡越小越明顯，而經(jīng)有效抗結(jié)核治療后外周血CD4+細(xì)胞顯著升高[18]。在CD4淋巴細(xì)胞減少的結(jié)核病患者中，IGRAs 比，TST 仍更能檢測(cè)到結(jié)核感染后的特異性免疫反應(yīng)[19]。同時(shí)，研究表明TST 較IGRAs 更易受CD4+淋巴細(xì)胞數(shù)的影響[20]。本研究結(jié)果提示IGRAs 較TST 更有能力檢測(cè)到結(jié)核細(xì)胞免疫反應(yīng)，故對(duì)于IGRAs 陰性的TBM 患兒，可能需要考慮到存在細(xì)胞免疫功能受損的情況。

綜上所述，IGRAs 在反映結(jié)核細(xì)胞免疫反應(yīng)方面更有優(yōu)勢(shì)。IGRAs 陰性的TBM 患兒更傾向于存在細(xì)胞免疫功能受損的可能，可結(jié)合臨床情況選擇合適的提高細(xì)胞免疫功能的治療。