合成微生物群落構(gòu)建技術(shù)在藥用植物栽培領(lǐng)域的應(yīng)用

穆 朋，金 橋，劉政波，鄧云澤，劉 寧*

·綜 述·

合成微生物群落構(gòu)建技術(shù)在藥用植物栽培領(lǐng)域的應(yīng)用

穆 朋1，金 橋1，劉政波1，鄧云澤2，劉 寧1*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 藥用植物栽培實驗室，吉林 長春 130112 2. 吉林省科技創(chuàng)新平臺管理中心，吉林 長春 130112

合成微生物群落（synthetic microbial communities，SynComs）是人為地將多個種類、功能等明確的不同微生物，在特定條件下以確定的比例進(jìn)行混合，獲得穩(wěn)定且功能明確的微生物群落，在促進(jìn)植物生長、養(yǎng)分吸收、抵御逆境脅迫等方面具有重要作用。對SynComs技術(shù)的發(fā)展歷程、構(gòu)建依據(jù)和方法，以及SynComs技術(shù)在促進(jìn)植物養(yǎng)分吸收、抵抗生物脅迫和緩解連作障礙中的作用進(jìn)行綜述，以期為藥用植物提質(zhì)增效、產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

合成微生物群落；藥用植物；構(gòu)建依據(jù)；養(yǎng)分吸收；生物脅迫；連作障礙

“一帶一路”倡議的提出，加強(qiáng)了中醫(yī)藥在世界范圍的影響力，中藥材是這一產(chǎn)業(yè)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。藥用植物是中藥材的重要組成部分，約占總量的90%，而80%藥用植物為野生資源[2]。隨著市場需求的不斷擴(kuò)大，野生藥用植物遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求，人工栽培藥用植物迎來巨大機(jī)遇與挑戰(zhàn)。然而，我國藥用植物栽培過程中仍存在諸多問題，如生產(chǎn)技術(shù)不規(guī)范，過量施用化肥、農(nóng)藥以及生長調(diào)節(jié)劑等，導(dǎo)致以塊根類入藥的藥用植物品質(zhì)下降[3]，嚴(yán)重制約了藥用植物栽培產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

根際微生物是植物整個生命周期不可或缺的組成部分，擁有的基因數(shù)量遠(yuǎn)多于植物基因組，被譽(yù)為植物的“第二基因組”[4]，其對植物生長和健康發(fā)揮重要作用[5]。近年來，隨著微生物組學(xué)、計算生物學(xué)、合成生物學(xué)等研究的快速發(fā)展，利用合成生物學(xué)的方法，人工構(gòu)建高效、穩(wěn)定的合成微生物群落（synthetic microbial communities，SynComs），已逐漸成為新的研究領(lǐng)域[6]。目前，SynComs技術(shù)在擬南芥[7]、水稻[8]、玉米[9]、番茄[10]等植物生長、養(yǎng)分吸收和病害防控上已展開廣泛的研究。SynComs能實現(xiàn)比單一菌株更高效、更穩(wěn)定的功能[11-12]，利用SynComs技術(shù)不僅能解析微生物與微生物間的相互作用，而且能闡明微生物群落與植物養(yǎng)分吸收、抵抗逆境脅迫等方面的互作機(jī)制。本文主要介紹SynComs技術(shù)的發(fā)展歷程、構(gòu)建依據(jù)和方法，以及SynComs技術(shù)在促進(jìn)植物養(yǎng)分吸收、抵抗生物脅迫和緩解連作障礙中的作用，以期為藥用植物提質(zhì)增效、產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 發(fā)展歷程

合成微生物群落的報道始見于2007年，Shou等[13]通過遺傳雜交對酵母菌(Desm.) Meyen進(jìn)行基因改造，獲得了2個代謝能力不同的非交配菌株R和Y，R合成賴氨酸但生長需要腺嘌呤，Y合成腺嘌呤但生長需要賴氨酸，將兩者共培養(yǎng)后形成穩(wěn)定持續(xù)的合作關(guān)系，為以后合成群落的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。合成菌群的研究證明了相互作用、空間結(jié)構(gòu)、代謝產(chǎn)物以及外源因素等對合成菌群的穩(wěn)定至關(guān)重要[14-17]。2014年，Grosskopf等[18]明確提出SynComs的概念，將SynComs定義為由2種或2種以上微生物在成分明確的基質(zhì)中建立的共培養(yǎng)體系。隨后，進(jìn)一步揭示了宿主基因型以及核心微生物對于構(gòu)建SynComs的重要性[7-9]。以上研究成果極大地推動和促進(jìn)了SynComs技術(shù)的發(fā)展，為利用SynComs技術(shù)揭示根際微生物群落功能及其與植物相互作用機(jī)制奠定了堅實的基礎(chǔ)（圖1）。

圖1 合成微生物群落的發(fā)展歷程

2 構(gòu)建依據(jù)和方法

SynComs是已知的具有明確功能的微生物組成的群落系統(tǒng)，具有復(fù)雜性低、功能強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點。SynComs的構(gòu)建并不是菌株之間簡單的隨機(jī)組合，而是需要考慮其內(nèi)在聯(lián)系。

2.1 構(gòu)建依據(jù)

SynComs構(gòu)建過程受微生物自身、植物宿主以及環(huán)境等多因素調(diào)控，其中微生物自身的影響包括物種相互作用關(guān)系、代謝作用以及空間結(jié)構(gòu)[30]。乳酸乳球菌(Lister) Schleifer經(jīng)基因改造得到3個不同的菌株Cα、Cβ和Ks，三者之間的作用關(guān)系和強(qiáng)弱與相對豐度值的變化有關(guān)：當(dāng)Cα與Cβ比值接近1∶1時，Cα和Cβ共生作用最強(qiáng)，Ks與Cα和Cβ的競爭相對穩(wěn)定；當(dāng)Cα與Cβ比值為30∶1時，Cα和Cβ共生作用最弱，Ks與Cα和Cβ的競爭處于優(yōu)勢。這一研究證明了物種間相互作用關(guān)系影響SynComs構(gòu)建的穩(wěn)定性[31]。物種通過不同的代謝作用如營養(yǎng)互補(bǔ)、代謝分工影響彼此之間的相互作用進(jìn)而影響SynComs的功能[32-33]。Mee等[34]將14種必需氨基酸的營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌，進(jìn)行兩兩配對混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不同營養(yǎng)缺陷型物種之間可通過營養(yǎng)互補(bǔ)方式建立互利共生關(guān)系。物種之間也可通過代謝分工的方式影響SynComs的穩(wěn)定性。斯特拉米梭菌Kato菌株CSK1能在厭氧條件下將纖維素降解為糖，梭狀菌屬Prazmowski菌株FG4消耗糖產(chǎn)生醋酸和乙醇，假黃單胞菌屬Finkmann菌株M1-3、博德特菌屬Shida菌株M1-6、短芽孢桿菌屬Moreno-Lopez菌株M1-5具備消耗氧氣和醋酸等特性，由這5種不同特性的細(xì)菌組成的混合群落，菌株之間通過代謝分工維持群落穩(wěn)定，提高纖維素降解功能[35]。微生物細(xì)胞會分泌小分子物質(zhì)如多肽、抗生素等，這些物質(zhì)的擴(kuò)散速度和距離不同，使微生物之間形成特定的時間和空間結(jié)構(gòu)，影響物種之間局部作用的強(qiáng)弱[36]。秈稻內(nèi)生菌［(Sav. Verma, Aj. Varma, Rexer, G. Kost & P. Franken) M. Weiss, F. Waller, Zuccaro & Selosse］為硫胺營養(yǎng)缺陷型，土壤枯草芽孢桿菌(Ehrenberg) Cohn可為其補(bǔ)充硫胺素，將兩者直接混合培養(yǎng)時沒有產(chǎn)生偏利共生的相互作用，而將秈稻內(nèi)生菌孢子與枯草芽孢桿菌在空間上隔開培養(yǎng)，或先接種秈稻內(nèi)生菌孢子一段時間后再與枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)，可產(chǎn)生明顯的偏利共生作用，證明物種之間特定的時間和空間結(jié)構(gòu)會影響SynComs的穩(wěn)定性[37]。

因此，SynComs構(gòu)建需綜合考慮物種間的相互作用關(guān)系、代謝作用和空間結(jié)構(gòu)，其是保障SynComs具有穩(wěn)定性的前提。

2.2 組裝

研究表明，圍繞設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)4步為1個循環(huán)的方法可用于SynComs的組裝[6,38]。

2.2.1 設(shè)計 SynComs可采用“自上而下”和“自下而上”的設(shè)計（design）?！白陨隙隆蓖ǔＪ遣捎脗鹘y(tǒng)微生物工程的方法，利用可控的環(huán)境變量使微生物群落通過生態(tài)系統(tǒng)（物理、化學(xué)和生物等）選擇過程獲得所需特定功能[39]。如大腸桿菌和惡臭假單胞菌(Trevisan) Migula適應(yīng)生存的溫度范圍不同，相對于惡臭假單胞菌，大腸桿菌可在更高的溫度下實現(xiàn)最大生長速率，通過調(diào)節(jié)溫度觀測群落組成變化，當(dāng)溫度達(dá)到35.5～39 ℃時可使大腸桿菌和惡臭假單胞菌共存，證明溫度能有效地調(diào)控SynComs的組成[40]。然而，此類方法忽略了微生物的原位代謝網(wǎng)絡(luò)和物種之間的相互作用，很難在分子層面對SynComs功能進(jìn)行解析。隨著宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組、宏蛋白組和宏代謝組等多組學(xué)的發(fā)展，微生物組功能、代謝網(wǎng)絡(luò)和物種之間錯綜復(fù)雜的互作關(guān)系被進(jìn)一步揭示，“自下而上”的方法得以建立，該方法通過多組學(xué)獲取微生物組中物種成員的功能基因信息[41]、RNA和蛋白質(zhì)豐度[42-43]、代謝方式[44]等相關(guān)信息，利用數(shù)學(xué)模型或網(wǎng)絡(luò)分析等方法預(yù)測微生物群落的潛在功能、代謝網(wǎng)絡(luò)和相互作用關(guān)系，進(jìn)一步通過表型篩選構(gòu)建某種特定功能的SynComs[45-46]（圖2）。Moronta-Barrios等[47]利用“自下而上”的方法構(gòu)建了一個結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且能分泌生長素來促進(jìn)水稻生長的簡化SynComs。

2.2.2 構(gòu)建 微生物組可培養(yǎng)是構(gòu)建SynComs最基本的要求和基礎(chǔ)，傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)技術(shù)僅能獲得自然界中1%～10%的微生物[48]，制約了微生物組的發(fā)展。而高通量培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)使SynComs的組裝成為可能。高通量培養(yǎng)組學(xué)常用的分離培養(yǎng)方法有微流控芯片培養(yǎng)技術(shù)和高通量培養(yǎng)技術(shù)。微流控芯片培養(yǎng)技術(shù)是指將微生物培養(yǎng)、分選等基本操作單元集成到芯片上，通過相互隔開的腔室或液滴分離微生物，控制微流體通道對微生物在不同營養(yǎng)因子下的生長條件、培養(yǎng)時間等進(jìn)行精確調(diào)控，實時監(jiān)測微生物的形態(tài)變化，最終完成微生物培養(yǎng)、鑒定等功能[49]。該技術(shù)具有自動化、高通量、低消耗等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域[50]。高通量培養(yǎng)技術(shù)是建立在稀釋培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上，將稀釋后的樣品置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，利用細(xì)胞分選和菌落挑選對微生物進(jìn)行篩選，結(jié)合雙重條形碼標(biāo)記對微生物進(jìn)行測序鑒定，在短時間內(nèi)即可檢測出大量微生物，極大提高微生物的培養(yǎng)效率和分離新物種的可能性[51]。通過高通量培養(yǎng)技術(shù)可鑒定擬南芥64%根際微生物和54%葉際微生物[19]。

圖2 “自下而上”的方法構(gòu)建合成微生物群落的技術(shù)流程圖

2.2.3 測試 測試是指對SynComs的動態(tài)變化和植物的表型特征進(jìn)行監(jiān)測和數(shù)據(jù)采集[52]。該階段需要采集的數(shù)據(jù)包括微生物組的動態(tài)特征如生長速度、代謝通量等；宿主植物表型特征如養(yǎng)分含量、生物量積累等[38]；無菌系統(tǒng)的物理化學(xué)特性如pH、化學(xué)成分濃度等。熒光成像技術(shù)可以實現(xiàn)對微生物的原位觀察，主要包括通過化學(xué)修飾的方法對特定微生物進(jìn)行代謝標(biāo)記和基于16S rRNA的熒光原位雜交技術(shù)[53-54]。對微生物進(jìn)行標(biāo)記的熒光蛋白和代謝成像，可以實時監(jiān)測微生物在時空上的動態(tài)變化如生長速率、代謝通量[53,55]。熒光原位雜交技術(shù)可定位微生物在微米尺度上的生物分布，有助于充分理解微生物群落的定殖、生理生態(tài)和相互作用[54]。植物表型特征是評估SynComs有效性的重要因素，由于微生物會影響宿主植物的生理狀態(tài)如養(yǎng)分含量、激素含量等，因此，觀測植物表型并采集相關(guān)數(shù)據(jù)是衡量SynComs功能是否穩(wěn)定的重要手段[56]。

2.2.4 學(xué)習(xí) 學(xué)習(xí)是對測試階段所獲得的微生物生長速率和代謝通量等數(shù)據(jù)進(jìn)行信息整合的過程，對SynComs的穩(wěn)定性以及成員之間的代謝網(wǎng)絡(luò)等進(jìn)行數(shù)學(xué)建模分析，評估SynComs是否可以達(dá)到預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)學(xué)模型是Learn階段驗證測試結(jié)果的有效手段，通過分析數(shù)學(xué)預(yù)測模型和試驗數(shù)據(jù)判斷SynComs的構(gòu)建是否需要進(jìn)一步優(yōu)化。較為常用的數(shù)學(xué)模型分析主要有通量平衡分析（flux balance analysis，F(xiàn)BA）和動力學(xué)模型[57]。FBA通過識別和優(yōu)化給定目標(biāo)函數(shù)（如生物量）的可用代謝通量，對細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)通量、代謝物消耗、生產(chǎn)速率以及細(xì)胞生長速率進(jìn)行定量預(yù)測，作用主要是重構(gòu)微生物群落的代謝網(wǎng)絡(luò)，模擬微生物之間的代謝水平[58]。動力學(xué)模型包括Monod方程、Lotka-Volterra模型等可有效預(yù)測SynComs群落隨時間發(fā)展的動態(tài)特征和穩(wěn)定性，其中Lotka-Volterra模型利用種群內(nèi)物種的生長速率和不同物種的相對豐度等指標(biāo)預(yù)測SynComs的穩(wěn)定性[59]。

通常，根據(jù)植物表型特征需進(jìn)行一輪或多輪“DBTL”循環(huán)來優(yōu)化SynComs的設(shè)計和功能，達(dá)到模擬生態(tài)系統(tǒng)的過程。目前，“自下而上”的設(shè)計方法都是基于簡單群落，而將具有數(shù)十至數(shù)百種不同物種的復(fù)雜群落應(yīng)用到非模式植物上時，應(yīng)綜合考慮“自上而下”與“自下而上”的設(shè)計方法。同時，高通量測序技術(shù)的發(fā)展也有助于進(jìn)一步深入了解不同生態(tài)環(huán)境下微生物群落的功能以及控制它們相互作用的原則，構(gòu)建穩(wěn)定且具備特定功能的SynComs，揭示微生物組與植物之間的相互作用關(guān)系，闡明微生物組在促進(jìn)植物生長、養(yǎng)分吸收以及生物脅迫等方面發(fā)揮的重要作用。

3 應(yīng)用

與其他作物不同，大多數(shù)藥用植物為多年生宿根植物，生長周期達(dá)幾年甚至幾十年，但在栽培過程中為了提高產(chǎn)量大量使用化肥、農(nóng)藥，不僅造成土壤環(huán)境惡化，而且嚴(yán)重影響了藥用植物品質(zhì)，不利于藥用植物栽培產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。根際微生物在促進(jìn)植物養(yǎng)分吸收、抵御病蟲害、緩解連作障礙等方面有著顯著的效果，且綠色環(huán)保。SynComs有利于從微生物群落水平上探討微生物種群內(nèi)部關(guān)系以及根際微生物群落與植物根系的互作機(jī)制。

3.1 促進(jìn)養(yǎng)分吸收

利用根際微生物促進(jìn)土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化是提高植物養(yǎng)分吸收的關(guān)鍵驅(qū)動因素[60]。根際微生物通過分泌溶解酶、產(chǎn)生鐵載體、分泌激素等直接或間接促進(jìn)土壤養(yǎng)分活化[61]。祝英等[62]發(fā)現(xiàn)由蘇云金芽孢桿菌Berliner、解淀粉芽孢桿菌(ex Fukumoto) Priest、蠟狀芽孢桿菌Frankland & Frankland等8種有益細(xì)菌混合而成的復(fù)合菌劑，能夠顯著增加當(dāng)歸根際土壤有效磷和有效鉀的含量。鷹嘴豆根際分離出的根際細(xì)菌如褐球固氮菌Beijerinck、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌(Schroeter) Migula和短小芽孢桿菌Meyer & Gottheil組成復(fù)合菌劑，能顯著增加土壤中有效磷含量[63]。假單胞菌能通過分泌有機(jī)酸的形式溶解土壤中的難溶性無機(jī)磷[64]，將8種假單胞菌根據(jù)成員數(shù)量組成不同的SynComs，發(fā)現(xiàn)隨著SynComs物種多樣性的提高，假單胞菌的存活能力、鐵載體的產(chǎn)生量、有效磷含量、番茄磷含量以及生物量的積累顯著增加[10]。根際微生物組能通過調(diào)控植物基因的轉(zhuǎn)錄水平，影響植物對養(yǎng)分的吸收利用[22]。Wang等[28]將大豆根際分離的12種菌株組成SynComs，發(fā)現(xiàn)其能上調(diào)氮轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因（等）和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因（等）的轉(zhuǎn)錄水平，增加大豆對氮、磷養(yǎng)分的協(xié)同吸收。Castrillo等[22]研究發(fā)現(xiàn)，一個由35種細(xì)菌組成的SynComs，能激活植物磷饑餓反應(yīng)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PHR1的表達(dá)，促進(jìn)植物低磷脅迫下磷的吸收。擬南芥根系內(nèi)皮層木栓化與根際微生物群落之間的協(xié)同作用對礦質(zhì)營養(yǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的研究表明，41種不同細(xì)菌組成的SynComs抑制脫落酸轉(zhuǎn)錄信號通路關(guān)鍵基因和的表達(dá)，下調(diào)脫落酸含量，減輕內(nèi)皮層木栓化，增強(qiáng)植物對養(yǎng)分脅迫的適應(yīng)性，從而揭示了根部擴(kuò)散屏障與根際微生物群落之間的協(xié)調(diào)作用能有效控制植物養(yǎng)分平衡[27]。

在長期連續(xù)地種植過程中，藥用植物特定地吸收土壤中的礦質(zhì)元素，造成根際礦質(zhì)養(yǎng)分下降，影響藥用植物的生長與有效成分累積[65]。研究表明，集約栽培的黃芩[66]、西洋參[67]根際土壤銨態(tài)氮、速效磷、速效鉀等養(yǎng)分含量降低。瑞香狼毒[68]、九味一枝蒿[69]等根際存在多種生理功能的細(xì)菌如固氮細(xì)菌、解磷細(xì)菌、解鉀細(xì)菌以及鐵載體細(xì)菌，它們分布于α變形菌門（α-Proteobacteria）、γ-變形菌門（γ-Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）以及放線菌門（Actinobacteria），這些高多樣性的菌群有助于藥用植物對礦質(zhì)元素的協(xié)同吸收，促進(jìn)藥用植物的生長[70]。而集約栽培的藥用植物隨著種植年限增加，土壤中細(xì)菌多樣性降低，有益細(xì)菌如放線菌、厚壁菌的種類和數(shù)量明顯減少[71]，降低了植物對土壤養(yǎng)分的利用效率。SynComs技術(shù)可根據(jù)不同功能調(diào)節(jié)群落物種組成，如利用固氮菌、溶磷菌、叢枝菌根真菌等構(gòu)建SynComs實現(xiàn)不同物種之間的代謝分工，在修復(fù)土壤微生物結(jié)構(gòu)的同時促進(jìn)藥用植物對氮、磷、鐵等多種養(yǎng)分的協(xié)同吸收和高效利用，從而提高藥用植物品質(zhì)。

3.2 緩解生物脅迫

微生物群落的多樣性與植物的抗病能力密切相關(guān)，微生物多樣性程度高的菌群更能有效抵御病原菌的入侵[72]。白曉麗[26]通過比較黃芪健康植株和患病植株根際微生物群落組成的差異，發(fā)現(xiàn)患病根匯合桿菌屬Park、細(xì)桿菌屬Orla-Jensen、土地桿菌屬Steyn等13種細(xì)菌的豐度顯著上調(diào)，疣微菌屬Schlesner、短桿菌屬Collins、柄桿菌屬Henrici & Johnson等12種細(xì)菌顯著下降，利用13種上調(diào)細(xì)菌組成的SynComs能有效防治尖孢鐮刀菌HQ-16引起的根腐病，且防控效果比單一菌株貝萊斯芽孢桿菌Ruiz-Garcia更好。吳林坤等[73]發(fā)現(xiàn)由伯克氏菌屬Yabuuchi、芽孢桿菌屬Cohn等組成的復(fù)合菌劑能同時降低太子參根際病原菌尖孢鐮刀菌Schltdl、踝節(jié)霉菌(Raper & Fennell) C. R. Benj、科薩科尼亞氏菌(Zhu) Gu的絕對含量。假單胞菌能通過分泌抗生素如2,4-二乙酰基間苯三酚、吩嗪-1-羧酸等抑制病原菌的生長[64]，Hu等[21]在田間生長的番茄根際加入由8種假單胞菌組成的SynComs，與單一假單胞菌相比，SynComs抑制青枯雷爾氏菌(Smith) Yabuuchi的效果更好。高度多樣性菌群所表現(xiàn)出的這種能力可能是因為不同微生物之間形成相互作用共同抵御病原菌入侵[74-75]。Santhanam等[24,76]將5種細(xì)菌組成SynComs，發(fā)現(xiàn)在田間條件下，只有當(dāng)SynComs成員全部存在的情況下才能顯著降低鐮刀菌的發(fā)病率，而單個分離株或其他較小組合的效果并不理想。SynComs抵御病原菌的機(jī)制之一是與其形成競爭，抑制病原菌對植物的侵染。Wei等[20]發(fā)現(xiàn)由5種細(xì)菌組成的SynComs能夠與青枯雷爾氏菌形成營養(yǎng)競爭，進(jìn)而抑制番茄青枯病的發(fā)生。Durán等[23]將擬南芥根際分離的148個細(xì)菌、34個真菌和8個卵菌組成SynComs，發(fā)現(xiàn)不同界之間存在競爭作用，細(xì)菌群落能保護(hù)擬南芥免受絲狀真菌和卵菌的侵染。此外，群落內(nèi)部的相互作用也能影響病原菌對植物的侵染。Li等[25]利用6種不同屬的細(xì)菌建立SynComs，研究不同菌群中菌株相互關(guān)系對青枯雷爾氏菌侵染的影響，發(fā)現(xiàn)存在拮抗作用的菌群比存在協(xié)同作用的菌群能夠更好地抵御青枯雷爾氏菌。根際微生物群落除了直接作用于土壤病原菌，還可以調(diào)控植物免疫相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)其免疫反應(yīng)。Ma等[29]將擬南芥根際分離的細(xì)菌組成不同的SynComs，通過調(diào)控免疫相關(guān)基因和的表達(dá)來抑制或誘導(dǎo)植物根際免疫反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)宿主對病原菌假單胞菌屬Migula的抗性。

病蟲害頻發(fā)是藥用植物集約化栽培過程中導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降的關(guān)鍵因素。具體表現(xiàn)為土壤有益微生物如芽孢桿菌[77]、固氮菌[78]、放線菌[79]等大量減少，病原菌如銹腐菌(Zinssm.) Rossman, L. Lombard & Crous、根腐菌(Mart.) Sacc.以及病原生物線蟲(Zimmemann) Filipjev & Schuurmans Stekhoven[80-82]大量積累，導(dǎo)致病蟲害頻發(fā)。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，人參銹腐病是由土赤殼屬P. Chaverri & C. Salgado、類土赤殼屬-like和尾孢菌屬U. Braun組成的復(fù)合真菌引起的[83]，利用復(fù)合菌劑能很好控制病害的發(fā)生。木霉菌Rifai和弗氏鏈霉菌Waksman & Curtis 2種拮抗菌組成的菌劑，木霉菌產(chǎn)孢量大可以與銹腐病菌(Zinssm.) Scholten、立枯病菌J. G. Kühn競爭生存空間，弗氏鏈霉菌一方面分泌多種抗生素抑制病原菌生長，另一方面分泌激素、有機(jī)酸等次生代謝產(chǎn)物促進(jìn)植物根系生長，兩者協(xié)同作用能有效防治西洋參立枯病和銹腐病[84]。未來通過SynComs技術(shù)進(jìn)行生物防治可提高藥用植物對病原菌的抵抗能力，提升藥用植物產(chǎn)量和品質(zhì)。

3.3 緩解連作障礙

連作障礙是限制藥用植物集約化栽培的重要科學(xué)問題。土壤微生物群落失衡是導(dǎo)致連作障礙的關(guān)鍵因素之一[85]。人參連作會導(dǎo)致土壤中有益細(xì)菌如芽孢桿菌屬Cohn、硝化螺菌屬Garrity & Holt、嗜熱油菌屬Suzuki and Whitman和有益真菌如被孢霉屬E. Coemans、附球菌屬Link、青霉菌屬Link的豐度降低，而潛在的致病真菌土赤殼屬P. Chaverri & C. Salgado、四枝孢屬De Wild.和細(xì)齒屬de Hoog的豐度上升[86]。三七連作后，細(xì)菌、放線菌、亞硝化細(xì)菌、芳香族分解菌、固氮菌和鉀細(xì)菌的數(shù)量減少[87]，土壤中的有益真菌粘頭目屬G. Weber, Spaaij & Oberw.和曲霉菌屬P. Micheli ex Haller的豐富度呈現(xiàn)下降趨勢，而病原真菌鏈格孢屬Nees、柱孢屬Wollenw、鐮刀菌屬Link和擬盤多毛孢屬Steyaert呈上升趨勢[88]。地黃連作會引起根際、根圍土壤細(xì)菌多樣性降低，數(shù)量大幅降低，而長枝木霉Rifai、黃曲霉Link等真菌數(shù)量顯著增加[89-90]。在不同的藥用植物連作土壤中，都存在共同的現(xiàn)象即藥用植物有益菌種數(shù)量下降或消失，而病原菌數(shù)量增加，土壤微生物群落組成逐漸轉(zhuǎn)向不利于植物生長的方向，但群落產(chǎn)生這一變化的調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。通過SynComs技術(shù)中的微生物培養(yǎng)組學(xué)方法可以構(gòu)建和還原正常土壤和連作土壤核心功能群落，將進(jìn)一步揭示連作土壤群落失衡的成因。

微生物群落的多樣性、結(jié)構(gòu)與功能影響著植物的整體健康以及對不利環(huán)境的響應(yīng)。叢枝菌根真菌可將菌絲延伸到植物根系外，一方面可幫助植物獲取額外的養(yǎng)分和水分，另一方面可以富集根際土壤中的有益微生物假節(jié)桿菌屬Busse、鏈霉菌屬Waksman & Henrici和細(xì)長孢霉Linnem，抑制尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌(Mart.) Sacc生長，在緩解藥用植物連作障礙上起著重要的作用[71]。從人參根際篩選出的醋酸鈣不動桿菌(Beijerinck) Baumann、鮑氏不動桿菌Bouvet & Grimont等5種細(xì)菌能夠有效降解苯甲酸、棕櫚酸等化感物質(zhì)，有利于緩解人參連作障礙[91]。于彥琳等[92]使用由22種菌種混合而成的菌劑處理連作蘭州百合，發(fā)現(xiàn)土壤中細(xì)菌數(shù)量增多，真菌數(shù)量減少，有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀含量顯著上升，有效緩解了百合連作障礙。以上研究表明，通過在土壤中加入特定菌株或菌群，能夠明顯改善連作問題，然而這些菌株往往只是復(fù)雜群落中承載單一功能的菌株，它們是否對整個群落的功能和群落中菌株的生存趨勢有積極影響尚缺乏相應(yīng)的研究。SynComs技術(shù)通過構(gòu)建群落中每個菌株的代謝通量數(shù)學(xué)模型，對種群的核心功能和發(fā)展趨勢進(jìn)行預(yù)測，從而為核心菌群的研究提供更快捷準(zhǔn)確的分析、構(gòu)建以及預(yù)測方法。

SynComs技術(shù)的應(yīng)用將有助于連作土壤微生物群落失衡過程的動態(tài)模擬，分析和預(yù)測核心群落的構(gòu)成和演化趨勢，進(jìn)而揭示群落失衡的原因。同時，利用SynComs技術(shù)將功能明確（如固氮、溶磷、產(chǎn)生長素和鐵載體等）且具有互補(bǔ)性、相容性和協(xié)調(diào)性的微生物構(gòu)建成穩(wěn)定菌群，使其發(fā)揮促進(jìn)藥用植物養(yǎng)分吸收、根系生長、抵抗病害等綜合作用，進(jìn)而緩解連作問題。SynComs技術(shù)有助于明確藥用植物土壤-根系-微生物群落之間的互作關(guān)系，從土壤微生物的角度詮釋連作障礙成因、緩解連作障礙，對藥用植物栽培產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

4 結(jié)語與展望

近年來，隨著宏基因組學(xué)、微流控技術(shù)、高通量培養(yǎng)組學(xué)以及生物信息學(xué)等技術(shù)的結(jié)合，藥用植物微生物群落組成、結(jié)構(gòu)和功能的研究已取得了一些重要進(jìn)展[93-94]，但對其功能特性的了解還相對較少。而SynComs技術(shù)在藥用植物栽培領(lǐng)域的研究尚處于起步階段，其在促進(jìn)藥用植物有效成分積累、提高抗逆性以及緩解連作障礙等方面的調(diào)控機(jī)制尚需深入研究。未來，除了需要探討群落菌種的選擇、構(gòu)建方法和條件等技術(shù)手段，還應(yīng)考慮更多實際應(yīng)用問題。

4.1 SynComs與藥用植物次生代謝物的關(guān)系

次生代謝物是藥用植物品質(zhì)和藥效的基礎(chǔ)，植物根際土壤微生物群落與次生代謝物之間存在強(qiáng)耦合性。根際微生物群落可以誘導(dǎo)植物分泌次生代謝物來滿足自身對底物的需求，而植物也可以通過分泌不同的次生代謝產(chǎn)物來招募自身需要的功能群落[95]，如擬南芥根系三萜化合物可調(diào)控根系微生物群落組成，同時微生物群落可對三萜化合物進(jìn)行特異性修飾[96]。因此，闡明SynComs與藥用植物次生代謝物的調(diào)控關(guān)系是必要的，既有助于提升藥用植物品質(zhì)，又可以促進(jìn)SynComs穩(wěn)定定殖，是實現(xiàn)藥用植物野生環(huán)境與集約環(huán)境同質(zhì)化栽培技術(shù)的關(guān)鍵。

4.2 SynComs與土壤理化性狀的關(guān)系

土壤是藥用植物生長發(fā)育的根本，特定的土壤環(huán)境形成特定的土壤微生物群落，從而對藥用植物品質(zhì)產(chǎn)生特定的影響。隨著土壤“微生物暗物質(zhì)”被逐漸揭示，研究者獲得了大量微生物信息，但由于無法大規(guī)模、精準(zhǔn)還原這些土壤微生物，所以難以解答不同理化性質(zhì)下微生物結(jié)構(gòu)差異性的關(guān)鍵問題。因此，亟需對土壤微生物核心群落進(jìn)行構(gòu)建和還原。SynComs技術(shù)提供了從功能設(shè)計到精準(zhǔn)還原的有效途徑，為理解不同土壤環(huán)境下的微生物系統(tǒng)提供了可能，從而揭示不同栽培環(huán)境下微生物群落和土壤理化性狀之間的關(guān)聯(lián)性，為藥用植物擬境栽培提供理論支撐。

4.3 SynComs推動新型生物肥料的研發(fā)

在藥用植物栽培領(lǐng)域，由化肥農(nóng)藥不合理使用引發(fā)的土壤酸化、連作障礙等問題，嚴(yán)重阻礙了藥用植物產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，急需尋求一種高效環(huán)保的替代方案來保障藥用植物的生長和健康。與植物根際微生物有關(guān)的功能菌如枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌Migula、哈茨木霉Rifai等被廣泛應(yīng)用于微生物肥料和生物防治劑，而單一微生物菌劑在復(fù)雜田間土壤環(huán)境下的定殖效果不穩(wěn)定。通過SynComs技術(shù)設(shè)計出來的微生物群落，天然就具備高適應(yīng)性、高可靠性、高穩(wěn)定性的特點，可以有效彌補(bǔ)單一生物菌劑在定殖方面的不足。因此，利用SynComs研發(fā)新型生物有機(jī)肥，挖掘出根際微生物的巨大潛力，為藥用植物栽培產(chǎn)業(yè)在化肥農(nóng)藥減施背景下的綠色轉(zhuǎn)型提供新思路與新策略。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Application on construction technology of synthetic microbial communities in field of medicinal plant cultivation

MU Peng1, JIN Qiao1, LIU Zheng-bo1, DENG Yun-ze2, LIU Ning1

1. Laboratory of Medical Plant Cultivation, Institute of Special Animal and Plant Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130112, China 2. Jilin Science and Technology Innovation Platform Management Center, Changchun 130112, China

Synthetic microbial communities (SynComs) are artificial combinations of two or more different microorganisms with known categorical status and definite functional characteristics. The Synthetized microbial communities play an important role in promoting plant growth, nutrient absorption, and resistance to stress. Development history, construction basis and method of SynComs, and the effects on promoting plant nutrient absorption, resistance to biological stress and alleviating continuous cropping obstacles of SynComs were reviewed in this paper, in order to provide theoretical basis and technical support for the health of medicinal plant rhizosphere soil and green and sustainable development of agriculture.

synthetic microbial communities; medicinal plants; construction basis; nutrient absorption; biological stress; continuous cropping obstacles

R282.2

A

0253 - 2670(2022)08 - 2506 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.028

2021-10-29

吉林省科技發(fā)展計劃重點研發(fā)項目（20200404013YY）；吉林省科技發(fā)展計劃項目（20191008001TC，20200702106NC，20210202095NC）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項目（CAAS-ASTIP-ISAPS-2021-012，CAAS-ASTIP-ISAPS-2021-020）

穆 朋（1995—），男，碩士研究生，研究方向為藥用植物與根際微生物互作研究。E-mail: mp15638835679@163.com

劉 寧，副研究員，研究方向為藥用植物與根際微生物互作研究。E-mail: liuning198219@163.com

[責(zé)任編輯 崔艷麗]