趙翠，賈利敏，王自強(qiáng)，房曉芳，魏迪，郭鐵標(biāo)，陳保春

滄州市人民醫(yī)院 醫(yī)專腫瘤院區(qū)， 腎病內(nèi)科， 河北 滄州 061000

膜性腎病依據(jù)發(fā)病機(jī)制可分為不典型膜性腎病、 原發(fā)性膜性腎病、 繼發(fā)性膜性腎病等， 臨床表現(xiàn)為腎病綜合征(大量蛋白尿、 低蛋白血癥、 高度水腫、 高脂血癥)， 或無(wú)癥狀、 非腎病范圍的蛋白尿， 病程中可出現(xiàn)腎功能不全、 高血壓等． 不典型膜性腎病是指病因不明確的膜性腎病， 且患者患病率明顯升高[1]．Klotho基因是一種與衰老有關(guān)的基因， 研究顯示其與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、 轉(zhuǎn)移、 凋亡等均有一定關(guān)系， 但其對(duì)腎病患者的作用機(jī)制尚不清楚[2]． 血清骨橋蛋白(OPN)可由人體內(nèi)多種細(xì)胞合成分泌， 可積極調(diào)節(jié)機(jī)體器官組織的發(fā)育[3]． 此外， 腎病綜合征患者常見(jiàn)血液高凝狀態(tài)， 血栓彈力圖指標(biāo)可準(zhǔn)確檢測(cè)患者凝血因素異常情況[4]． 本研究利用免疫組織化學(xué)法對(duì)Klotho基因mRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)， 并探討其對(duì)患者OPN、 血栓彈力圖的影響．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

設(shè)2018年1月至2020年1月滄州市人民醫(yī)院醫(yī)專腫瘤院區(qū)腎內(nèi)科收治的100例腎穿刺活檢標(biāo)本診斷為不典型膜性腎病患者為觀察組， 同時(shí)納入30例尸解未出現(xiàn)明顯腎臟病變的腎組織標(biāo)本為對(duì)照組． 觀察組標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定， 行石蠟包埋切片； 對(duì)照組標(biāo)本經(jīng)2.5%戊二醛進(jìn)行固定， 使用Epon包埋． 本研究已獲滄州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)(倫批2017025)．

1.2 方法

1.2.1 染色

Klotho免疫組化染色試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾， 對(duì)照組使用PBS溶液代替一抗． 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色： ①脫蠟至水； ②使用蒸餾水配制3%甲醇過(guò)氧化氫(H2O2)20 mL， 并使用蒸餾水洗3次； ③使用微波抗原修復(fù)； ④滴加兔抗人一抗， 4 ℃下過(guò)夜， 使用PBS溶液洗3次； 滴加生物素化山羊抗兔IgG， 室溫下反應(yīng)1 h， 使用PBS溶液洗3次； ⑤滴加SABC復(fù)合物， 室溫下反應(yīng)1 h； ⑥加入DAB試劑， 使用蘇木素復(fù)染， 脫水封片．

Klotho基因mRNA原位雜交試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾， 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作： ①石蠟切片后經(jīng)酒精脫蠟入水， 加入3% H2O2室溫下反應(yīng)10 min， 使用蒸餾水洗2次； ②滴加3%檸檬酸1 mL及2滴濃縮胃蛋白酶， 于37 ℃下反應(yīng)15 min， 使用PBS溶液進(jìn)行清洗， 共3次， 5 min/次， 蒸餾水清洗1次； ③滴加預(yù)雜交液， 于37 ℃下反應(yīng)3 h， 滴加雜交液， 于37 ℃下反應(yīng)過(guò)夜， 使用SSC進(jìn)行清洗； ④于37 ℃下滴加封閉液， 30 min后甩去多余液體， 并滴加SABC溶液， 37 ℃下反應(yīng)30 min， 使用PBS溶液洗4次， 5 min/次； ⑤滴加生物素化過(guò)氧化物酶， 37 ℃下反應(yīng)30 min， 使用PBS溶液清洗4次， 5 min/次； ⑥D(zhuǎn)AB顯色10 min， 加入蘇木素復(fù)染， 脫水封片．

1.2.2 圖像分析

對(duì)兩組患者免疫組化染色切片及雜交染色切片進(jìn)行檢測(cè)， 檢測(cè)范圍為腎小管及腎小球． 每張切片隨機(jī)選取3～5個(gè)腎小球， 并選取3個(gè)視野進(jìn)行檢測(cè)， 分別檢測(cè)腎小球及腎小管的吸光度值， 并以平均值進(jìn)行計(jì)算．

1.2.3 分組

根據(jù)觀察組細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行計(jì)分， 染色強(qiáng)度可以分為0～3分， 0分為陰性； 1分為淡黃色顆粒； 2分為棕黃色顆粒； 3分為褐色顆粒． 陽(yáng)性細(xì)胞水平評(píng)分： 0分： 陽(yáng)性細(xì)胞R≤5%； 1分： 5%75%． 將兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)相乘得到分組標(biāo)準(zhǔn)， 將乘積M≤4分記為陰性組， 其余記為陽(yáng)性組．

1.2.4 OPN水平及血栓彈力圖

使用3%H2O210 mL， 高壓鍋抗原修復(fù)3～5 min， 使用4 ℃一抗孵育過(guò)夜， 加入二抗進(jìn)行37 ℃孵育15 min， 加入氧化物酶液-鏈霉素抗生物素進(jìn)行37 ℃孵育15 min． 加入DAB顯色， 使用蘇木素染色1 min， 加入0.5%～1.0%鹽酸乙醇進(jìn)行分化， 脫水封片．

使用WITEYE T10000血栓彈力圖分析儀(武漢中科和信生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)陰性組、 陽(yáng)性組血栓彈力， 檢測(cè)指標(biāo)包括凝血時(shí)間、 凝血指數(shù)、 最大血栓彈力度、 凝固角．

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組Klotho基因蛋白量比較

對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞僅為微弱陽(yáng)性反應(yīng)， 陽(yáng)性顆粒僅見(jiàn)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)； 腎小球?yàn)殛幮苑磻?yīng)， 腎小球間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)明顯陽(yáng)性反應(yīng)． 觀察組患者Klotho基因呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)， 與對(duì)照組相比， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)， 見(jiàn)表1．

表1 兩組Klotho基因蛋白量比較

2.2 兩組Klotho基因mRNA原位雜交染色比較

對(duì)照組腎小球未見(jiàn)Klotho基因mRNA陽(yáng)性表達(dá)， 腎小管見(jiàn)極弱陽(yáng)性表達(dá)． 觀察組腎小管上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(p<0.05)， 腎小球與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)， 見(jiàn)表2．

表2 兩組Klotho基因 mRNA原位雜交染色比較

2.3 陰性組及陽(yáng)性組OPN蛋白表達(dá)情況比較

陽(yáng)性組有82例， 陰性組有18例． OPN主要在血管內(nèi)皮、 血管平滑肌、 腎小管粘膜上皮等上表達(dá)． 陽(yáng)性組OPN蛋白表達(dá)水平遠(yuǎn)高于陰性組， 組間數(shù)據(jù)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)， 見(jiàn)表3．

表3 陰性組及陽(yáng)性組OPN蛋白表達(dá)情況比較

2.4 陰性組及陽(yáng)性組血栓彈力圖檢測(cè)結(jié)果比較

陽(yáng)性組凝血指數(shù)、 最大血栓彈力度、 凝固角顯著高于陰性組， 凝血時(shí)間顯著低于陰性組， 組間數(shù)據(jù)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)， 見(jiàn)表4．

表4 陰性組及陽(yáng)性組血栓彈力圖檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

不典型膜性腎病常為隱匿起病， 患者主要病理表現(xiàn)為腎小球基底膜增厚伴有上皮細(xì)胞下免疫復(fù)合物沉積， 主要表現(xiàn)為高血壓、 腎功能不全等． 患者常處于血液高凝狀態(tài)， 因此血栓栓塞是其常見(jiàn)并發(fā)癥[5-6]． 目前臨床上發(fā)現(xiàn)不典型膜性腎病患者治療效果較差， 因此積極探討其發(fā)病機(jī)制及臨床生理特點(diǎn)是研究的重點(diǎn)所在．

本研究共收集100例不典型膜性腎病患者腎穿刺活檢標(biāo)本， 并對(duì)其Klotho基因進(jìn)行研究．Klotho基因是一種與衰老有關(guān)的基因， 有研究指出， 小鼠缺乏Klotho基因后會(huì)出現(xiàn)骨質(zhì)疏松、 肺氣腫、 動(dòng)脈硬化等綜合征[7]． 李莉等[8]研究指出， 大鼠心、 腎組織Klotho基因表達(dá)水平降低， 會(huì)影響其內(nèi)皮功能， 從而影響腎臟功能． 鄒新蓉等[9]研究發(fā)現(xiàn)， 大鼠腎損害氧化應(yīng)激反應(yīng)與Klotho基因水平有關(guān)， 通過(guò)使用抗氧化藥物可有效上調(diào)Klotho基因的表達(dá)水平， 從而減輕大鼠的臨床癥狀． 同時(shí)， 許多研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Klotho基因蛋白表達(dá)水平升高時(shí)可保護(hù)腎臟[10]． 邵齊等[11]在培養(yǎng)的腎小球細(xì)胞中加入Klotho基因后， 發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞合成纖維連接蛋白明顯增多， 提示Klotho基因可刺激腎小球上皮細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)． 本研究結(jié)果顯示， 對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞僅為微弱陽(yáng)性反應(yīng)， 陽(yáng)性顆粒僅見(jiàn)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)， 腎小球?yàn)殛幮苑磻?yīng)， 腎小球間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)明顯陽(yáng)性反應(yīng)， 觀察組患者Klotho基因mRNA表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性(p<0.05)． 此外，Klotho基因蛋白表達(dá)不僅在腎小球， 同時(shí)在腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)也有表達(dá)， 提示Klotho基因?qū)δI小管、 腎小球均有一定影響[12]． 同時(shí)， 本研究結(jié)果顯示Klotho基因mRNA表達(dá)水平在腎小管內(nèi)表達(dá)水平較腎小球內(nèi)更明顯， 與王健富等[13]研究結(jié)果一致． 有研究表明[14]， 對(duì)腎病患者腎臟中Klotho基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)， mRNA表達(dá)水平主要分布于人腎小管及集合管上皮細(xì)胞內(nèi)， 且陽(yáng)性信號(hào)高于腎小球． 本研究結(jié)果提示患者出現(xiàn)腎小管的改變可能對(duì)腎間質(zhì)纖維化起到重要作用． 董照瀛等[15]研究發(fā)現(xiàn)自發(fā)性高血壓大鼠體內(nèi)Klotho基因mRNA表達(dá)水平上調(diào)， 可導(dǎo)致大鼠心肌膠原纖維化水平、 心肌細(xì)胞厚度、 高血壓腎損害明顯減少， 提示Klotho基因還可減緩心臟損害．

OPN是一種位于常染色體上的蛋白質(zhì)， 且存在于人體內(nèi)不同組織及不同細(xì)胞中． 邢艷陽(yáng)等[16]指出， OPN表達(dá)受到雌激素及孕酮的影響． 龐春艷等[17]指出， 表皮生長(zhǎng)因子可通過(guò)特定的信號(hào)途徑調(diào)控OPN mRNA表達(dá)． OPN主要通過(guò)依賴特定序列與細(xì)胞表面特異受體進(jìn)行結(jié)合， 從而直接或間接促進(jìn)淋巴細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞的趨化作用， 從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化IL-12等． 黃雨茅等[18]通過(guò)建立不典型膜性腎病模型發(fā)現(xiàn)， OPN在腎小管間質(zhì)受損區(qū)域表達(dá)上調(diào)， 同時(shí)有大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)． 孔繁達(dá)等[19]通過(guò)動(dòng)物研究證實(shí)， 腎小管間質(zhì)中OPN表達(dá)增加可促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)， 從而加快腎小管損傷， 加重體內(nèi)炎癥反應(yīng)． 本研究根據(jù)Klotho基因mRNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度將觀察組分為陽(yáng)性組(82例)和陰性組(18例)， 結(jié)果顯示OPN主要表達(dá)于血管內(nèi)皮、 血管平滑肌、 腎小管粘膜上皮等， 陽(yáng)性組OPN蛋白表達(dá)水平遠(yuǎn)高于陰性組(p<0.05)． 此外， 有研究[20]指出， OPN水平與腫瘤的轉(zhuǎn)移與發(fā)展有重要關(guān)系， OPN在腎臟腫瘤患者中表達(dá)明顯增加． 但OPN與腎臟腫瘤患者中的表達(dá)水平尚無(wú)足夠臨床研究． 但劉明等[21]指出， OPN與MMP-2因子的表達(dá)有一定關(guān)系， 且對(duì)腫瘤良惡性有一定指征反應(yīng)， 因此可使用OPN水平初步對(duì)腎臟腫瘤患者進(jìn)行篩選等．

腎病綜合征患者常見(jiàn)血液高凝， 因此臨床上常使用血栓彈力圖對(duì)血凝狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)， 從而動(dòng)態(tài)評(píng)估血液凝塊、 纖維蛋白的形成， 并積極反應(yīng)血凝塊的動(dòng)態(tài)變化[22]． 本研究顯示， 陽(yáng)性組凝血指數(shù)、 最大血栓彈力度、 凝固角顯著高于陰性組， 凝血時(shí)間顯著低于陰性組(p<0.05)， 提示Klotho基因陽(yáng)性表達(dá)組患者凝血狀態(tài)較陰性組異常程度更高． 血管內(nèi)皮細(xì)胞在受損狀態(tài)下會(huì)合成并分泌一種叫內(nèi)皮素的物質(zhì)， 從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的縮血管反應(yīng)， 引起動(dòng)脈收縮、 腎功能受損、 高凝狀態(tài)等， 而Klotho基因mRNA此時(shí)在腎的表達(dá)減少， 而內(nèi)皮素蛋白表達(dá)增加， 從而加劇了病情的發(fā)展[23-24]．

本研究由于條件有限， 樣本數(shù)較小， 同時(shí)觀察組患者進(jìn)行腎穿刺活檢時(shí)可能由于時(shí)機(jī)不同對(duì)結(jié)果產(chǎn)生了一定的影響． 因此， 進(jìn)一步研究還需加強(qiáng)對(duì)患者的隨訪， 密切關(guān)注患者Klotho基因表達(dá)情況與治療效果的關(guān)系， 從而增加對(duì)疾病機(jī)制的認(rèn)知， 改善患者預(yù)后效果． 綜上所述，Klotho基因mRNA表達(dá)水平在不典型膜性腎病患者中顯著升高， 且會(huì)升高患者OPN水平， 并影響血液凝固狀態(tài)．