鐘繼昌 謝金濤

(1皖北衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院；2宿州市第一人民醫(yī)院,宿州 234000)

脂肪肝(fatty liver,FL)動物模型在探索FL發(fā)病機制、篩選預(yù)防和治療藥物等方面具有重要作用。高脂飲食可誘導(dǎo)FL動物模型，實驗動物的品系和性別、高脂飼料的成分和造模時間不同，復(fù)制的模型病變程度和病理類型也不同[1]。在相同的實驗條件下，SD大鼠對高脂飲食更為敏感[2]，雄性大鼠更容易發(fā)生肝細胞脂肪變性[3]，但這種模型復(fù)制方法耗時較長，肝纖維化和炎癥的變化較輕。注射CCl4復(fù)制FL模型簡便、能快速引起FL，但其發(fā)病機制、病程演變及組織學(xué)改變與人類FL有很大不同。此外，高濃度CCl4毒性大，會造成早期和嚴(yán)重的肝細胞壞死、炎癥和纖維化及動物高死亡率[4]。理想的FL動物模型應(yīng)符合人類疾病的特點；病變有發(fā)展過程，與人的發(fā)病機制密切相關(guān)；形成率高，死亡率低，重復(fù)性好；模型復(fù)制方法簡單易行[5-6]。本研究采用脂肪乳劑、30%白酒灌胃與皮下注射CCl4的復(fù)合造模方法成功制備了大鼠FL模型?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 健康雄性SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量(160±10)g，購于安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，實驗動物許可證號：SYK(皖)2019-008，實驗前將大鼠在動物房正常飼養(yǎng)1周。所有動物實驗符合倫理學(xué)要求。

1.1.2試劑 膽固醇、膽酸鈉(上海西寶公司)，白酒(安徽文王釀酒股份有限公司)，四氯化碳(廣東汕頭市西隴化工廠)，花生油(萊陽魯花濃香花生油有限公司)，吐溫80(天津光復(fù)精細化工研究所)，丙二醇(上海東姿化學(xué)試劑公司)，ALT、AST試劑盒(南京建成生物工程研究所)，HDL、LDL、TC、TG、FFA試劑盒(長春匯力生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3主要儀器 BS-110S精密天平(北京塞多利斯天平有限公司)，MP6001電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)，TDL-5型臺式低速大容量離心機、TGL-16G型離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，752P紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，HH-S2系列恒溫水浴鍋(常州市金壇區(qū)環(huán)宇科學(xué)儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1脂肪乳劑制備[7-8]取豬油25g置200ml燒杯內(nèi)，磁力攪拌器上加熱至100℃后加10g膽固醇充分混勻，加25ml吐溫80，得油相。取20ml丙二醇、30ml純化水置200ml燒杯內(nèi)，磁力攪拌器加熱至60℃，加2g膽酸鈉，完全溶解后得水相。將水相加入油相，充分混勻，得脂肪乳劑，冷卻至室溫，14℃保存?zhèn)溆?。臨用前水浴融化，冷卻至室溫后灌胃。

1.2.2模型制備 大鼠隨機分為正常對照組10只，模型組18只。模型組每日灌胃脂肪乳劑(1mL/100g)和30%白酒(1ml/100g)，2次/周皮下注射40%CCl4花生油溶液(0.3ml/100g)。對照組灌胃等量純化水，皮下注射等量生理鹽水，方法同模型組。每周稱重1次，根據(jù)體重變化調(diào)整劑量。

1.2.3一般情況觀察 每日觀察大鼠毛色、精神、進食和二便等情況。4周末，肉眼觀察肝臟質(zhì)地、顏色、邊緣厚度及表面和切面光滑度；計算肝指數(shù)，肝指數(shù)=肝濕重/末次體重×100%。

1.2.4肝臟病理觀察 第2周末、第3周末分別隨機抽取模型組4只大鼠，第4周末抽取模型組剩余大鼠，肉眼觀察肝臟變化，保留肝臟進行病理檢查，將正常對照組作為模型組0周的數(shù)據(jù)，觀察模型組動態(tài)變化過程。每只大鼠肝臟左葉相同部位取小塊肝組織，10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色。光鏡觀察肝臟病理學(xué)變化，并評估脂肪變性程度[9]：重度(脂變肝細胞超過肝小葉2/3)，中度(脂變肝細胞占肝小葉1/3～2/3)，輕度(脂變肝細胞呈散在小灶分布)，無(肝小葉結(jié)構(gòu)完好，基本無脂變)。脂肝變超過1/3，提示FL模型制備成功。

1.2.5血清生化指標(biāo)檢測 4周末，隔夜禁食不禁水，水合氯醛麻醉后腹主動脈采血，3000rpm，離心15min，分離血清，-20℃保存。按照試劑盒說明書，分別采用賴氏法測定ALT、AST水平；直接法測定HDL水平；沉淀法測定LDL水平；4-AAP法測定TC、TG含量；酶比色法測定FFA含量。

1.2.6肝組織TC、TG、FFA含量測定 采血后，迅速取出肝臟，取每只大鼠相同部位肝組織1g，剪碎，4℃，3000rpm，勻漿1min，制備肝勻漿，加入氯仿∶甲醇(1∶1，V/V)提取脂質(zhì)，靜置12h，3000rpm，離心15min，取上清液，-20℃保存。根據(jù)試劑盒說明書檢測肝臟TC、TG和FFA含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

正常對照組毛色光滑，活動積極，精神振奮，食量和二便正常。造模初期，模型組出現(xiàn)厭食、活動減少、大便稀軟，部分大鼠腹瀉，隨著試驗進展逐漸消失；灌胃白酒后少數(shù)有嗜睡現(xiàn)象，數(shù)小時后逐漸清醒。造模后期，模型組毛色灰暗，無光澤，活動遲緩。

4周末，模型組體重明顯低于正常對照組(P<0.05)。肉眼觀察，正常對照組肝臟顏色鮮紅，有光澤，被膜光滑，邊緣銳利，切面光潔；模型組肝臟明顯腫脹，黃褐色，被膜致密，邊緣鈍，觸之有油膩感(圖1)。肝指數(shù)與正常對照組相比有顯著差異(P<0.05)。見表1。

注：A.正常對照組；B.模型組

表1 兩組大鼠肝指數(shù)比較

2.2 肝臟組織學(xué)改變

鏡下觀察，正常對照組肝細胞無脂肪變性，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細胞索排列整齊，肝竇正常，肝細胞無病變，細胞核結(jié)構(gòu)清晰(圖2A)。模型復(fù)制2周末，脂肪顆粒增大、緊密相連，細胞核數(shù)量減少(圖2B)；模型復(fù)制3周末，細胞核數(shù)量少，肝細胞體積增大，部分細胞內(nèi)見空泡結(jié)構(gòu)，脂變肝細胞占肝小葉1/3～1/2，達到輕度脂肪肝變性(圖2C)；模型復(fù)制4周末，肝細胞結(jié)構(gòu)大部分破壞，小葉邊界不清，細胞索紊亂，大部分肝竇消失，肝細胞廣泛脂肪變性，呈大泡狀改變，由中央小靜脈向周圍逐漸擴散和延伸，細胞腫脹，細胞質(zhì)疏松，含有較大脂肪滴，脂變肝細胞占肝小葉1/2～2/3(圖2D)，提示第4周末模型組大鼠FL模型復(fù)制成功，中度脂肪肝占100%。

注：A.0周;B.2周;C.3周;D.4周

2.3 兩組血清生化指標(biāo)

與正常對照組相比，模型組血清ALT、AST、LDL、TC、TG含量升高(P<0.05)，HDL含量降低(P<0.05)，F(xiàn)FA含量升高(P<0.05)。見表2。

表2 兩組大鼠血清生化指標(biāo)比較

2.4 兩組肝組織TC、TG、FFA含量

模型組肝組織中TC、TG和FFA含量高于正常對照組(P<0.001)。見表3。

表3 兩組大鼠組織TC、TG、FFA含量比較

3 討論

我國FL的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，并呈現(xiàn)年輕化趨勢。關(guān)于FL的相關(guān)研究報道也成為研究熱點之一，而復(fù)制與人類FL發(fā)生、發(fā)展過程相似的FL動物模型更是其重要研究基礎(chǔ)。本次研究我們采用灌胃適度濃度白酒和脂肪乳劑的方法接近我們?nèi)粘Ｉ钪蠪L病程發(fā)展的實際情況，白酒灌胃可以掌握固定的酒精濃度，符合人類飲酒的方式；附加皮下注射適宜濃度的CCl4則有助于縮短動物模型復(fù)制周期。

本文結(jié)果顯示模型組與對照組相比SD大鼠的體重、肝指數(shù)有顯著性差異；血清中與脂肪代謝相關(guān)的指標(biāo)ALT、AST、LDL、TC、TG含量顯著升高，HDL含量顯著降低，F(xiàn)FA含量顯著升高；肝組織中TC、TG和FFA含量顯著高于正常對照組； 肝臟病理切片顯示模型組大鼠在試驗4周末出現(xiàn)肝細胞脂肪變性，肝臟脂變程度已達1/3，提示已經(jīng)成功復(fù)制FL模型。

在前期多次預(yù)試驗基礎(chǔ)上，我們確定了每日灌胃脂肪乳劑(1ml/100g)和30%白酒(1ml/100g)，2次/周皮下注射40%CCl4花生油溶液(0.3ml/100g)的配方具體用量。該方法復(fù)制的FL模型，成功率高，周期短，重復(fù)性好；模型符合人類FL病理演變的過程，灌胃脂肪乳劑和白酒接近人類日常飲食與飲酒導(dǎo)致的FL，注射適宜濃度的CCl4能夠縮短常規(guī)方法模型復(fù)制周期。但脂肪乳劑較黏稠，灌胃時不宜抽取，這是復(fù)制模型的不利因素；關(guān)于CCl4濃度的高低對模型復(fù)制的影響以及本模型的發(fā)病機制有待于進一步深入研究。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。