載脂蛋白E4基因與阿爾茨海默病伴睡眠障礙患者血脂、炎癥因子及抑郁相關(guān)因子的關(guān)系*

肖英，閆麗敏，陳斌

（海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，海南?？?70311）

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease,AD）屬于神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，又稱(chēng)老年癡呆癥，起病緩慢，隨著時(shí)間延長(zhǎng)病情可持續(xù)進(jìn)展或惡化[1]。睡眠障礙是AD 患者較常見(jiàn)的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及身心健康。目前AD 伴睡眠障礙病變機(jī)制較為復(fù)雜，且尚未明確。既往研究表明，AD 患者睡眠質(zhì)量降低與血脂代謝紊亂、炎癥及抑郁有一定關(guān)系[2-3]。載脂蛋白E（apolipoprotein E,ApoE）由299 個(gè)氨基酸構(gòu)成，其基因多態(tài)性，尤其是ApoE4與AD 病變關(guān)系密切。近年來(lái)研究表明，ApoE4可促進(jìn)血脂代謝紊亂，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生認(rèn)知損傷而影響患者精神狀態(tài)[4-6]。目前AD 伴睡眠障礙相關(guān)研究較少。因此，本研究通過(guò)分析AD 伴睡眠障礙患者ApoE等位基因分布，探究ApoE4與AD 伴睡眠障礙患者炎癥因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor,BNDF）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年6月—2020年7月在海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院就診的78 例AD 患者，根據(jù)匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)（Pittsburgh sleep quality index,PSQI）量表[7]將患者分為伴有睡眠障礙組（42 例，PSQI >7 分）及未伴有睡眠障礙組（36 例，PSQI ≤7 分）。其中伴有睡眠障礙組男性25 例，女性17 例；年齡60～85 歲，平均（72.19±10.04）歲；文化程度：高中以下29 例、高中及以上13 例。未伴有睡眠障礙組男性20 例，女性16 例；年齡62～88 歲，平均（72.51±12.03）歲；文化程度：高中以下25 例、高中及以上11 例。另取50 例同期該院健康體檢者作為健康組，男性27 例，女性23 例；年齡58～86 歲，平均（72.61±9.60）歲；文化程度：高中以下32 例、高中及以上18 例。3 組患者性別、年齡、文化程度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，受試者均知情同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)①符合《2018 中國(guó)癡呆與認(rèn)知障礙診治指南（一）：癡呆及其分類(lèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)》AD 診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②年齡<90 歲；③臨床資料完整。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)①在本實(shí)驗(yàn)前3 個(gè)月內(nèi)服用過(guò)抗精神類(lèi)、安眠類(lèi)藥物治療者；②心、肝、腎等臟器嚴(yán)重病變者；③胃食管反流、藥物濫用及慢性阻塞性肺疾病者，除AD 以外造成患者睡眠障礙的疾??；④內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，如糖尿病、多囊卵巢綜合征、甲狀腺疾病等。

1.3 主要儀器及試劑

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR）儀（上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，型號(hào)CG-05），全自動(dòng)生化分析儀（江西特康科技有限公司，型號(hào)TC6090L）。 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 ApoE 等位基因分布從所有受試者靜脈血標(biāo)本中提取DNA，設(shè)計(jì)及合成ApoE引物。ApoE正向引物：5′-CCTCTGCCC CGTTCCTTC-3′，反向引物：5′-CGCCACCTGCTCCTTCAC-3′，引物長(zhǎng)度20 bp，由日本TaKaRa 公司設(shè)計(jì)合成。qRT-PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，94℃變性30 s，55℃退火2 min，65℃延伸45 s，共45 個(gè)循環(huán)。然后采用PCR 擴(kuò)增其產(chǎn)物99℃、5 min，冰浴5 min，與基因芯片上特異性核酸探針進(jìn)行雜交，測(cè)定基因位點(diǎn)序列。

1.4.2 血脂采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)AD 伴睡眠障礙ApoE4 攜帶組及未攜帶組患者血脂水平，包括總膽固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol,LDL-C）。

1.4.3 血清炎癥因子采用ELISA 檢測(cè)AD 伴睡眠障礙ApoE4 攜帶組及未攜帶組患者血清炎癥因子水平，包括腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白細(xì)胞介素6（Interleukin-6,IL-6）、白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）。

1.4.4 抑郁相關(guān)因子采用ELISA 檢測(cè)AD 伴睡眠障礙ApoE4 攜帶組及未攜帶組患者抑郁相關(guān)因子水平，包括BNDF、5-HT。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組ApoE等位基因分布

健康組、伴有睡眠障礙組、未伴有睡眠障礙組ApoE2、ApoE3 攜帶者占比比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

健康組、伴有睡眠障礙組、未伴有睡眠障礙組ApoE4攜帶者占比比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中伴有睡眠障礙組ApoE4攜帶者占比高于健康組和未伴有睡眠障礙組（P<0.05），而健康組與未伴有睡眠障礙組ApoE4攜帶者占比比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 ApoE等位基因的分布 例（%）

2.2 ApoE4攜帶組與未攜帶組患者血脂水平

由結(jié)果2.1 中可知AD 伴睡眠障礙患者中，14 例攜帶ApoE4基因（ApoE4 攜帶組），28 例未攜帶ApoE4基因（ApoE4 未攜帶組）。ApoE4 攜帶組與未攜帶組TC、TG 及LDL-C 水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），ApoE4 攜帶組高于未攜帶組。見(jiàn)表2。

表2 ApoE4攜帶組與未攜帶組患者血脂水平比較（mmol/L，x±s）

2.3 ApoE4 攜帶組與未攜帶組患者血清炎癥因子水平

ApoE4 攜帶組與未攜帶組血清TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），ApoE4 攜帶組高于未攜帶組。見(jiàn)表3。

表3 ApoE4攜帶組與未攜帶組患者血清炎癥因子水平比較（ng/mL，±s）

表3 ApoE4攜帶組與未攜帶組患者血清炎癥因子水平比較（ng/mL，±s）

組別ApoE4攜帶組ApoE4未攜帶組t 值P 值n 14 28 TNF-α 213.76±52.60 124.75±38.02 6.197 0.000 IL-6 122.41±30.05 72.49±12.38 7.655 0.000 IL-1β 57.11±10.24 32.39±6.54 9.519 0.000

2.4 ApoE4 攜帶組與未攜帶組患者抑郁相關(guān)因子水平

ApoE4 攜帶組與未攜帶組BNDF、5-HT 水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），ApoE4 攜帶組低于未攜帶組。見(jiàn)表4。

表4 ApoE4攜帶組與未攜帶組患者抑郁相關(guān)因子水平比較（ng/mL，x±s）

3 討論

睡眠障礙是AD 常見(jiàn)并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者治療及生活質(zhì)量[9]。ApoE 是一種通過(guò)介導(dǎo)膽固醇代謝的載脂蛋白，在動(dòng)脈粥樣硬化及神經(jīng)細(xì)胞功能中發(fā)揮重要生物學(xué)作用。本研究結(jié)果表明，伴有睡眠障礙組ApoE4攜帶者占比高于健康組及未伴有睡眠障礙組，而健康組及未伴有睡眠障礙組之間ApoE4分布無(wú)顯著差異。提示攜帶ApoE4的AD 患者更容易并發(fā)睡眠障礙，即ApoE4不僅是AD 致病的危險(xiǎn)因素，而且可能增加AD 患者睡眠障礙發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。分析其原因可能為：①ApoE4致病機(jī)制與大腦中β 淀粉樣蛋白沉積有關(guān)，而β 淀粉樣蛋白沉積會(huì)對(duì)睡眠產(chǎn)生一定影響[10-11]；②可能與ApoE4對(duì)AD 患者血脂、炎癥因子及情緒相關(guān)因子的調(diào)節(jié)作用相關(guān)[12-14]。然而現(xiàn)階段ApoE4誘發(fā)AD 患者睡眠障礙的具體作用機(jī)制尚未明確。

胡雨亭等[15]研究報(bào)道，血脂水平異常對(duì)老年人認(rèn)知功能有不利影響，TC、TG 及LDL-C 水平越高，認(rèn)知能力越弱。且有報(bào)道證實(shí)，認(rèn)知功能對(duì)患者睡眠障礙影響顯著，兩者相互作用[16-17]。為進(jìn)一步探究血脂水平與睡眠的關(guān)系，馬愛(ài)娟等[2]研究發(fā)現(xiàn)北京人存在睡眠問(wèn)題，認(rèn)為其與TC、TG 及LDL-C 水平呈正相關(guān)。本研究結(jié)果表明，ApoE4 攜帶組TC、TG 及LDL-C 水平顯著高于ApoE4 未攜帶組。這一結(jié)果與賈新等[4]的研究結(jié)果類(lèi)似，其發(fā)現(xiàn)攜帶ApoE4的AD 或輕度認(rèn)知障礙患者血脂表達(dá)較未攜帶者更異常，認(rèn)為ApoE基因的多態(tài)性與血脂水平密切相關(guān)。分析原因可能是ApoE4作為血漿中脂蛋白重要組分，參與脂蛋白代謝及膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)患者血脂水平起到一定的調(diào)節(jié)作用，因而推測(cè)ApoE4通過(guò)調(diào)節(jié)患者血脂代謝來(lái)影響睡眠。

睡眠調(diào)節(jié)不僅與心理、神經(jīng)及內(nèi)分泌等因素有關(guān)，而且受細(xì)胞因子的影響。TNF-α、IL-1β 雖然是與免疫密切相關(guān)的炎癥因子，但是其受體也廣泛存在于腦干、海馬、下丘腦等與睡眠覺(jué)醒周期調(diào)節(jié)相關(guān)的大腦組織中，被認(rèn)為與機(jī)體的生理性非眼球快速運(yùn)動(dòng)睡眠調(diào)節(jié)相關(guān)。有研究表明，TNF-α、IL-6、IL-1β 等炎癥因子表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)睡眠障礙[18]。低劑量TNF-α、IL-1β 可促進(jìn)睡眠，高劑量則相反，可能是由于TNF-α、IL-1β 及其產(chǎn)物可以激活NF-κB 以延長(zhǎng)滿(mǎn)波睡眠時(shí)間，而NF-κB 又可以增強(qiáng)TNF-α、IL-1β 的轉(zhuǎn)錄，在睡眠/剝奪中起到類(lèi)似神經(jīng)遞質(zhì)的作用[19]。IL-6 是一種多功能細(xì)胞因子，健康人入睡前注射IL-6 可明顯縮短快動(dòng)眼睡眠時(shí)間，白天易出現(xiàn)倦怠、精力不集中等表現(xiàn)，被認(rèn)為參與了睡眠調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果表明，ApoE4 攜帶組TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平顯著高于未攜帶組。分析原因可能與ApoE4的促炎機(jī)制有關(guān)，國(guó)希云等[20]發(fā)現(xiàn)ApoE4可引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，致使腦血管功能?chē)?yán)重退化。因而推測(cè)ApoE4可增強(qiáng)AD 患者的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致睡眠障礙。

AD 患者常伴有抑郁癥狀，且既往報(bào)道已證實(shí)抑郁癥狀對(duì)睡眠障礙影響顯著，如張樓鳳等[3]研究報(bào)道抑郁癥患者的睡眠質(zhì)量與健康人存在顯著差異，且抑郁程度越重，患者睡眠障礙越嚴(yán)重。BNDF 屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除BDNF基因的小鼠抑郁癥、狂躁癥發(fā)生率顯著高于健康小鼠[21]。BNDF 主要表達(dá)于大腦皮層、海馬、下丘腦等組織中，可維持神經(jīng)元功能、促進(jìn)神經(jīng)元再生、參與突觸可塑性，當(dāng)機(jī)體BNDF 表達(dá)降低時(shí)導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡增多，中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性降低，進(jìn)而引起抑郁、狂躁癥狀的出現(xiàn)[22-23]。本研究結(jié)果表明，ApoE4 攜帶組BNDF 水平顯著低于未攜帶組，提示ApoE4可能會(huì)抑制BNDF 的表達(dá)，BNDF 低表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致抑郁癥狀的發(fā)生，而ApoE4抑制BNDF 的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

5-HT 屬于哚衍生物，與人體睡眠、痛覺(jué)等生理功能相關(guān)，5-HT 水平升高可發(fā)揮抗抑郁作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酒精依賴(lài)伴抑郁癥大鼠予以5-HT后，大鼠抑郁癥狀明顯緩解[24]。5-HT 是一種存在于人體血液、腸道、大腦等部位的神經(jīng)遞質(zhì)，其水平升高會(huì)導(dǎo)致機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢波睡眠增多，覺(jué)醒減少；當(dāng)其水平降低則可能導(dǎo)致失眠和情緒波動(dòng)[25]。本研究結(jié)果表明，ApoE4 攜帶組5-HT 水平顯著低于未攜帶組，提示ApoE4可能會(huì)抑制5-HT 表達(dá)，5-HT 低表達(dá)會(huì)降低神經(jīng)活動(dòng)興奮度，影響大腦快速動(dòng)眼睡眠，導(dǎo)致抑郁及睡眠障礙的發(fā)生，而ApoE4抑制5-HT 的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，AD 患者并發(fā)睡眠障礙與ApoE基因多態(tài)性有關(guān)，其中ApoE4對(duì)該類(lèi)患者影響最顯著，其原因可能與ApoE4調(diào)節(jié)患者血脂、炎癥因子及抑郁相關(guān)因子水平有關(guān)。然而本研究具有一定不足之處，后續(xù)研究可擴(kuò)大樣本量及通過(guò)相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確其生物學(xué)作用機(jī)制。