李晶晶，田 賜，王明思，劉祿威，李沐陽(yáng)，馬樹(shù)杰，張利輝，董金皋

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，保定 071001）

農(nóng)田雜草是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要問(wèn)題之一，其具有種類繁多、分布廣泛、危害性大的特點(diǎn)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大損失[1-3]?；瘜W(xué)除草劑的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了雜草防治效率和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，在雜草防治中發(fā)揮著無(wú)法替代的作用[4,5]。但化學(xué)除草劑的大量使用，也造成了土壤污染、雜草抗藥性以及農(nóng)藥殘留等系列問(wèn)題[7,8]。植物源除草劑具有易降解、作用方式多樣、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，是新農(nóng)藥創(chuàng)制的熱點(diǎn)之一[9,10]。目前世界上已發(fā)現(xiàn) 30多科植物含有百余種天然除草化合物，其中有些已被開(kāi)發(fā)成天然除草劑[11]。纖精酮是從紅千層中分離得到的植物源除草先導(dǎo)化合物，以其為模板開(kāi)發(fā)出了三酮類除草劑[12]；壬酸是從牻牛兒苗科植物中分離得到了羧酸類除草化合物，并得到專利保護(hù)和推廣應(yīng)用[13]；1,8-桉樹(shù)腦是植物產(chǎn)生的天然揮發(fā)性單萜，對(duì)馬唐等具有較好的除草活性[14]。因此，對(duì)具有除草作用的植物提取物及其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，有望發(fā)現(xiàn)新穎除草機(jī)制的化合物，可為新型天然除草劑的開(kāi)發(fā)提供候選材料和理論依據(jù)。

本研究采用種子萌發(fā)法測(cè)定了113種植物乙醇提取物對(duì)馬唐和反枝莧種子萌發(fā)的抑制作用，采用平皿法測(cè)定了對(duì)雜草幼根、幼芽生長(zhǎng)的抑制作用；進(jìn)一步評(píng)價(jià)了提取物對(duì)雜草幼根、幼芽的生長(zhǎng)毒力，以期篩選出具較高除草活性的植物種類，為開(kāi)發(fā)新型植物源除草劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試雜草種子 馬唐Digitaria sanguinlis和反枝莧Amaranthus retroflexus種子由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試植物 供試植物113種，分屬56個(gè)科，購(gòu)買于河北省安國(guó)市冷背藥材有限公司，詳細(xì)名稱見(jiàn)表1。

表1 113種植物乙醇提取物對(duì)反枝莧和馬唐種子萌發(fā)的影響Table 1 The effects of ethanol extracts from 113 kinds of traditional Chinese medicine on seed germination ofA. retroflexusandD. sanguinlis

續(xù)表1

續(xù)表1

1.2 植物乙醇提取物的制備

將上述113種植物放于40 ℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎后過(guò)孔徑0.4 mm篩，采用超聲波提取法提取供試植物樣品[15]。具體如下：分別稱取供試植物干粉20 g，加入無(wú)水乙醇，按料（g）液（mL）比為1:10進(jìn)行提取，每次30 min，重復(fù)提取3次，過(guò)濾3次，濾液在52 ℃減壓濃縮得乙醇浸膏，將乙醇浸膏配置成1 g DW/mL的母液。

1.3 除草活性的測(cè)定

1.3.1 113 種植物乙醇提取物對(duì)馬唐和反枝莧種子萌發(fā)的影響 試驗(yàn)采用種子萌發(fā)法[16]，在培養(yǎng)皿（直徑為9 cm，下同）中鋪兩層濾紙，處理組加入0.5 g DW/mL的植物乙醇提取液1.0 mL，對(duì)照組加入乙醇1.0 mL，待乙醇完全揮發(fā)后，加入蒸餾水4 mL，再將20粒供試植物種子在濾紙上擺成一行，所有處理重復(fù)3次，置于培養(yǎng)箱（25±1）℃、相對(duì)溫度50%～70%、光周期14L:10D中培養(yǎng)，期間適時(shí)補(bǔ)充水分，3 d后觀察雜草種子的萌發(fā)情況，按照公式計(jì)算：種子萌發(fā)抑制率＝（對(duì)照種子萌發(fā)數(shù)—處理種子萌發(fā)數(shù)）/對(duì)照種子萌發(fā)數(shù)×100%。

1.3.2 113 種植物乙醇提取物對(duì)馬唐和反枝莧種子幼根、幼芽生長(zhǎng)的影響 選取對(duì)種子萌發(fā)抑制率較高的中藥提取物，進(jìn)一步測(cè)定其對(duì)馬唐和反枝莧種子幼根、幼芽的影響。在試驗(yàn)前1 d浸泡雜草種子，使其吸足水分，然后置于25 ℃恒溫箱中催芽24 h至種子露白[17]。在培養(yǎng)皿中鋪兩層濾紙，處理組加入植物乙醇提取液1.0 mL，對(duì)照組加入乙醇1.0 mL，待乙醇完全揮發(fā)后，加入蒸餾水4 mL，再將20粒供試植物種子在濾紙上擺成一行，置于上述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間適時(shí)補(bǔ)充水分，3～7 d后（依據(jù)幼苗生長(zhǎng)速度）測(cè)量種子主根（最長(zhǎng)根）及芽長(zhǎng)，按照公式計(jì)算幼根（芽）生長(zhǎng)抑制率。幼根（芽）生長(zhǎng)抑制率＝[對(duì)照根（芽）長(zhǎng)度—處理根（芽）長(zhǎng)度]/對(duì)照根（芽）長(zhǎng)度×100%。

對(duì)幼根、幼芽生長(zhǎng)抑制較好的中藥材提取物進(jìn)一步進(jìn)行毒力測(cè)定。采用二倍稀釋法，將提取物稀釋為5個(gè)待測(cè)濃度，每個(gè)濃度重復(fù)3次，每個(gè)培養(yǎng)皿放置20粒雜草種子。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22.0軟件的單因素方差分析法求出抑制中濃度（IC50）及95%置信區(qū)間、毒力回歸方程等相關(guān)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 113種植物乙醇提取物對(duì)反枝莧和馬唐種子萌發(fā)的影響

采用種子萌發(fā)法測(cè)定了113種植物乙醇提取物對(duì)反枝莧和馬唐種子萌發(fā)的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，在供試濃度125 mg DW/mL下，40種植物乙醇提取物對(duì)反枝莧種子萌發(fā)抑制率在80%以上，15種植物乙醇提取物抑制率為50%到80%，有64種植物乙醇提取物抑制率為低于50%。其中茖蔥、建蘭、楮、烏藥、大葉釣樟、牡丹皮、木香、豨薟、漏蘆、佩蘭、馬蹄決明、鹿藿、紫背浮萍、條葉龍膽、木芙蓉、蜀葵、九頭獅子草、安息香樹(shù)、昆明水金鳳、泡桐、蘇鐵蕨、短葉羅漢松、竹葉菜、馬蹄金、杜衡、橄欖和蜈蚣萍的種子萌發(fā)抑制率最高，均達(dá)到100%。

15種植物乙醇提取物對(duì)馬唐種子萌發(fā)抑制率在80%以上，其中大黃、牡丹皮、大葉三升麻、佩蘭、朝鮮淫羊藿、楸樹(shù)、安息香樹(shù)、泡桐、短葉羅漢松和杜衡等 10種植物乙醇提取物的種子萌發(fā)抑制率最高，均達(dá)到100%。

2.2 113種植物乙醇提取物對(duì)反枝莧和馬唐幼根和幼芽的影響

2.2.1 對(duì)反枝莧幼根和幼芽的生長(zhǎng)抑制作用 選取32種對(duì)反枝莧種子萌發(fā)抑制率較高的中藥乙醇提取物，測(cè)定其對(duì)幼根、幼芽生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如表2所示。由表2可見(jiàn)，在供試濃度125 mg DW/mL下，測(cè)定的32種中藥乙醇提取物對(duì)反枝莧幼根和幼芽生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用，其中牡丹皮、木香、佩蘭、鹿藿和短葉羅漢松等5種提取物對(duì)幼根的抑制率最強(qiáng)，均為100%；紫背浮萍、蜈蚣萍、薜荔、茖蔥、馬蹄金、泡桐、杜衡和安息香樹(shù)對(duì)幼根的抑制率在90%以上，分別為97.12%、94.88%、94.88%、94.56%、93.36%、93.29%、92.65%和 92.01%；木芙蓉、蘇鐵蕨、烏藥、楮、九頭獅子草、苦葫蘆、建蘭、竹葉菜和秋子梨對(duì)幼根的抑制率在80%以上，抑制率分別為89.45%、89.13%、89.13%、86.26%、85.87%、84.66%、84.66%、83.70%和80.51%。

表2 32種植物乙醇提取物對(duì)反枝莧幼根和幼芽的影響Table 2 The effects of 32 kinds of plant ethanol extracts on the root and stem ofA. retroflexus

牡丹皮、木香、佩蘭、鹿藿和短葉羅漢松等5種提取物對(duì)幼芽的抑制率最強(qiáng)，為100%；紫背浮萍、蜈蚣萍、薜荔、竹葉菜和安息香樹(shù)的抑制率在90%以上，分別為96.92%、94.61%、93.84%、92.01%和90.76%；烏藥、苦葫蘆、馬蹄金、九頭獅子草、楮和茖蔥對(duì)幼芽的抑制率在 80%以上，分別為 89.23%、86.92%、84.61%、84.61%、83.07%和82.30%。

2.2.2 對(duì)馬唐幼根和幼芽的生長(zhǎng)抑制作用 選取了10種對(duì)馬唐種子萌發(fā)抑制率為100%的植物提取物測(cè)定其對(duì)馬唐幼根、幼芽的生長(zhǎng)抑制作用。由表3可知，在62.5 mg DW/mL供試濃度下，木香、杜衡、泡桐、大葉三生麻和安息香樹(shù)對(duì)馬唐幼根的抑制率在 80%以上，分別為 95.25%、90.26%、85.26%、83.24%和80.36%；杜衡、木香、大葉三升麻、泡桐和佩蘭對(duì)馬唐幼芽的抑制率在80%以上，分別為90.26%、90.25%、88.85%、85.25%和80.29%。

表3 10種植物乙醇提取物對(duì)馬唐幼根和幼芽生長(zhǎng)抑制的影響Table 3 The growth inhibition effects of 10 kinds of plant ethanol extracts on the root and stem ofD. sanguinlis

2.3 植物乙醇提取物對(duì)雜草種子生長(zhǎng)的毒力

2.3.1 6 種植物乙醇提取物對(duì)反枝莧幼根和幼芽生長(zhǎng)的毒力 為進(jìn)一步篩選對(duì)反枝莧幼根抑制活性高的植物種類，測(cè)定了木香、牡丹皮、短葉羅漢松、鹿藿、佩蘭和紫背浮萍對(duì)反枝莧幼根的室內(nèi)毒力。結(jié)果表明，鹿藿、佩蘭、木香、短葉羅漢松、紫背浮萍、牡丹皮對(duì)反枝莧幼根的IC50值分別為1.03、2.24、2.46、2.59、2.79和2.85 mg DW/mL，其中抑制活性最高的為鹿藿乙醇提取物，其他5種提取物的活性相當(dāng)。

木香、牡丹皮、短葉羅漢松、鹿藿和佩蘭對(duì)反枝莧幼芽也具有較強(qiáng)的抑制作用，活性排序?yàn)槁罐健菽鞠恪荻倘~羅漢松≥牡丹皮≥佩蘭，其IC50分別為4.52、7.05、24.17、31.21和32.72 mg DW/mL（表4）。

表4 6種供試植物提取物對(duì)反枝莧種子幼根和幼芽的生長(zhǎng)抑制作用Table 4 The growth inhibition effects of 6 kinds of test plant extracts on the root and stem ofA.retroflexus

2.3.2 8種植物乙醇提取物對(duì)馬唐幼根和幼芽的生長(zhǎng)抑制毒力 根據(jù)表5可知，楸樹(shù)、木香、泡桐、佩蘭、杜衡、安息香樹(shù)和大葉三升麻對(duì)馬唐幼根具有較強(qiáng)的抑制作用，活性排序?yàn)槟鞠恪荻藕狻菖萃荽笕~三生麻≥安息香樹(shù)≥佩蘭≥楸樹(shù)，其IC50分別為5.93、8.72、13.93、15.20、19.20、28.70和39.30 mg DW/mL。

表5 8種供試植物提取物對(duì)馬唐種子幼根和幼芽的生長(zhǎng)抑制作用Table 5 The growth inhibition effects of 8 kinds of test plant extracts on the root and stem ofD. sanguinalis

楸樹(shù)、木香、泡桐、佩蘭、杜衡、安息香樹(shù)、短葉羅漢松和大葉三升麻對(duì)馬唐幼芽也具有較強(qiáng)的抑制作用，活性排序?yàn)槎藕狻菽鞠恪荽笕~三升麻≥泡桐≥佩蘭≥安息香樹(shù)≥短葉羅漢松≥楸樹(shù)，IC50分別為7.78、8.13、12.91、15.27、22.39、23.43、42.12 和 48.22 mg DW/mL。

3 討論

我國(guó)中藥植物資源豐富且獨(dú)具特色，已經(jīng)引起植物源農(nóng)藥研究者的廣泛關(guān)注，但是通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)對(duì)中藥植物開(kāi)展除草活性篩選的研究報(bào)道較少[18-20]。本研究通過(guò)對(duì)53科113種中藥植物進(jìn)行除草活性篩選，發(fā)現(xiàn)在125 mg DW/mL濃度下，對(duì)反枝莧種子萌發(fā)抑制率在80%以上的有40種，占所測(cè)試植物總數(shù)的35.40%；對(duì)馬唐種子萌發(fā)抑制率在80%以上的有15種，占所測(cè)試植物總數(shù)的13.27%；牡丹皮、佩蘭、木香、鹿藿和短葉羅漢松等5種中藥植物對(duì)反枝莧和馬唐幼根、幼芽的抑制率為100%。由此可以看出，篩選出的具有除草活性的植物種類所占比例較高，故有必要加強(qiáng)中藥植物除草活性篩選，以期獲得更多具有開(kāi)發(fā)價(jià)值的除草植物資源。

本研究發(fā)現(xiàn)，牡丹皮、佩蘭、木香、鹿藿和短葉羅漢松等植物提取物對(duì)馬唐和反枝莧不僅具有種子萌發(fā)抑制作用，而且對(duì)幼根、幼芽生長(zhǎng)的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)反枝莧幼根的IC50分別為2.85、2.24、2.46、1.03和2.58 mg DW/mL。郭鳳和羅小勇[21]測(cè)定了牡丹葉提取物對(duì)生菜Lactuca sativaL.、稗Echinochloa crusgalli、播娘蒿Descurainia sophia等幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果顯示，該提取物對(duì)播娘蒿胚根或胚芽的IC50為1.02～9.65 g/L，與本研究結(jié)果較為一致。研究者已從牡丹中分離得到了芍藥甙、丹皮酚、二羥基苯乙酮等化合物[22,23]，但除草活性是否與這些物質(zhì)有關(guān)需要進(jìn)一步研究。佩蘭、木香、鹿藿和短葉羅漢松具有抗菌、抗炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤等藥用活性[24-27]，其農(nóng)用活性研究報(bào)道較少，除草活性為首次報(bào)道。此外，牡丹皮、佩蘭、木香、鹿藿和短葉羅漢松在我國(guó)分布廣泛、易于繁殖、產(chǎn)量較高、價(jià)格便宜，具備開(kāi)發(fā)成新型植物源除草劑的良好前景。

由此可見(jiàn)，牡丹皮、佩蘭、木香、鹿藿和短葉羅漢松5種植物提取物的除草活性較好，具有作為植物源除草劑的價(jià)值。本研究為高效低毒植物源除草劑的發(fā)掘提供了線索，為新型植物源除草劑的創(chuàng)制奠定了基礎(chǔ)。