劉 晶，包 涵，陳 磊，劉源濤，劉 田，楊 青

（大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116024）

昆蟲表皮覆蓋昆蟲整個(gè)身體表面，不僅可以作為一種保護(hù)器官，抵御病原體的攻擊與不利環(huán)境的傷害，而且還可以作為外骨骼，保持昆蟲體型并維持正常的生命活動(dòng)[1-4]。昆蟲表皮可以分為3層，分別為外部的信封層、中間的上表皮和內(nèi)部的原表皮，其中原表皮層由外表皮和內(nèi)表皮組成[5-8]。表皮的主要組份包括幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)及少量脂質(zhì)與色素等。幾丁質(zhì)是 N-乙酰-D-葡糖胺單體以β-(1,4)糖苷鍵聚合形成的多糖[5]，昆蟲表皮中幾丁質(zhì)主要為反平行的α-幾丁質(zhì)[9]，脫乙?；笮纬蓺ぞ厶恰τ诓煌ハx或同一昆蟲的不同部位而言，幾丁質(zhì)在結(jié)構(gòu)、含量上幾乎無明顯差異。表皮蛋白是支撐表皮結(jié)構(gòu)的另一重要成份，表皮中存在上百種表皮蛋白，根據(jù)序列特征，將其劃分為CPR、CPF、CPFL、CPT、CPG、CPAP1、CPAP3、CPLCA、CPLCG、CPLCP、CPLCW和Apidermin等12個(gè)家族[10-14]。隨著生物信息技術(shù)的發(fā)展，更多的表皮蛋白家族被逐步發(fā)掘出來，如 CPAPn家族等[15-17]。與幾丁質(zhì)相比，表皮蛋白在氨基酸序列以及時(shí)空表達(dá)模式上表現(xiàn)出顯著的多樣性，是影響表皮結(jié)構(gòu)及其機(jī)械性能的主要因素[18,19]。

在所有家族的表皮蛋白中，CPR家族蛋白的含量最多，約占所有表皮蛋白基因總數(shù)的70%[12,20]。CPR家族蛋白含有R&R保守結(jié)構(gòu)域，根據(jù)R&R結(jié)構(gòu)域的差異可將CPR蛋白進(jìn)一步分為3個(gè)亞族，即RR-1、RR-2和RR-3。組織定位研究表明RR-1主要存在于柔軟表皮層，RR-2存在于堅(jiān)硬表皮層，而對RR-3的研究較少[21,22]。生化性質(zhì)研究表明CPR家族蛋白具有幾丁質(zhì)結(jié)合能力。RNAi干擾試驗(yàn)表明部分CPR蛋白在昆蟲表皮形成過程中具有重要作用。東亞飛蝗Locusta migratoria的CPR家族表皮蛋白基因LmACP7經(jīng)RNAi沉默后，翅上皮細(xì)胞發(fā)生紊亂，引起蝗蟲翅彎曲皺縮并導(dǎo)致其凋亡[23]。褐飛虱Nilaparvata lugens的9個(gè)CPR家族表皮蛋白基因NlugCPR6，NlugCPR47，NlugCPR56等經(jīng)RNAi沉默后可導(dǎo)致成蟲體型偏瘦且最終死亡[17]。

隨著測序技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，越來越多的昆蟲表皮蛋白得到鑒定和研究，但目前關(guān)于雙叉犀金龜表皮蛋白相關(guān)研究較少。雙叉犀金龜屬于鞘翅目金龜子科叉犀金龜屬，俗名獨(dú)角仙，因其雄性成蟲具有雄壯有力的獨(dú)角而著稱。雙叉犀金龜已成為鐵皮石斛的重要害蟲之一，其幼蟲主要通過取食鐵皮石斛基質(zhì)營養(yǎng)大量繁衍，并咬斷根莖從而危害作物正常生長[24]。因雙叉犀金龜蟲體較大且為地下危害，導(dǎo)致防治困難。

基于上述背景，本論文選取雙叉犀金龜體內(nèi)表達(dá)豐度相對較高的Td14144表皮蛋白作為研究對象，利用生物信息學(xué)方法對其蛋白序列特征進(jìn)行分析，并通過基因克隆、重組表達(dá)以及分離純化獲得Td14144重組蛋白，最后評價(jià)了其對不同幾丁質(zhì)底物的結(jié)合能力。本研究提供了新的表皮蛋白基因資源，有助于了解表皮蛋白在昆蟲表皮形成中的重要作用，并為新型仿生材料設(shè)計(jì)及雙叉犀金龜?shù)纳锓乐翁峁椭?/p>

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及主要試劑

RNA提取試劑RNAiso Plus，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，凝膠回收試劑盒Gel DNA Extraction Kit，質(zhì)粒提取試劑盒MiniBEST Plasmid Purification Kit，TA克隆試劑盒Mighty TA-cloning Kit，In-Fusion克隆試劑盒In-Fusion HD Cloning Kit，PCR酶Premix Taq?（Ex Taq? Version 2.0）、PrimeSTAR? HS（Premix），限制性核酸內(nèi)切酶QuickCut?EcoR I、QuickCut?NcoI，大腸桿菌基因克隆菌株Escherichia coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，蛋白表達(dá)菌株Escherichia coliBL21感受態(tài)細(xì)胞均購自TaKaRa公司。殼聚糖、α-幾丁質(zhì)、β-幾丁質(zhì)均購自Sigma公司，pET-28a質(zhì)粒載體來自蘇州泓迅生物科技股份有限公司。其他未標(biāo)明試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 Td14144基因的克隆

基于課題組雙叉犀金龜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得表皮蛋白基因Td14144。使用RNAiso Plus提取雙叉犀金龜預(yù)蛹期表皮組織總RNA后，Nanoview測定其濃度。利用PrimeScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，根據(jù)表皮蛋白Td14144基因序列，利用SnapGene軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1），進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：cDNA模板（100 ng/μL）1 μL，2×Premix Taq? 25 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1.5 μL，補(bǔ)充 ddH2O 至總體系為 50 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用凝膠回收試劑盒對產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收并連接T-vector，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Escherichia coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增鑒定后，挑取陽性菌落到LB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)12～16 h（37 ℃，220 r/min）提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

1.3 Td14144的生物信息學(xué)分析

使用ExPASy的ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）對蛋白質(zhì)的理論分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測；使用SignalP-5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號肽的預(yù)測；使用ExPASy的ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行蛋白質(zhì)的親疏水性分析；利用SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測；使用CutProtFam-Pred（http://aias.biol.uoa.gr/CutProtFam-Pred/search.php）進(jìn)行表皮蛋白家族分類。使用NCBI中BlastP（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索與Td14144蛋白序列一致性較高的不同物種的同源蛋白，使用 MEGA軟件中 Maximum likelihood（ML）最大似然法將Td14144蛋白序列與同源序列進(jìn)行聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用MUSCLE（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）進(jìn)行多重序列比對，并用 ESPript（http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/）對比對結(jié)果進(jìn)行處理。

1.4 Td14144基因的體外重組及原核表達(dá)

根據(jù)表達(dá)載體pET-28a和雙叉犀金龜表皮蛋白Td14144的基因序列，設(shè)計(jì)帶有NcoI/EcoR I酶切位點(diǎn)的引物序列（表1）。以測序正確的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（50 μL）：T-vector模板（100 ng/μL）1 μL，2×PrimeSTAR? HS 25 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1.5 μL，補(bǔ)充 ddH2O 至總體系為 50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)。原核表達(dá)載體pET-28a經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切后，將酶切產(chǎn)物和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行切膠回收，用In-Fusion連接酶進(jìn)行同源重組。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌Escherichia coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定后，挑取陽性菌落到LB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)12～16 h（37 ℃，220 r/min）提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序驗(yàn)證。將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-14144轉(zhuǎn)入大腸桿菌Escherichia coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。挑取陽性克隆的單菌落于LB（50 mg/L Kan）液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩過夜。將小量培養(yǎng)后的菌液按1:100比例接種于1000 mL的LB（50 mg/L Kan）液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至吸光值OD600為0.5～0.6，加入濃度為0.1 mol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，離心收集菌體。將菌體重新懸浮進(jìn)行超聲破碎，分別取上清和沉淀進(jìn)行分析，SDS-PAGE檢測蛋白的表達(dá)情況。

1.5 Td14144蛋白的分離、純化及Western blot驗(yàn)證

對Td14144進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用金屬螯合層析對重組蛋白進(jìn)行分離純化。使用裂解緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，500 mmol/L NaCl）重懸菌體后，高壓勻漿破碎儀破碎離心取上清，過濾后上樣。利用含有20、90 mmol/L的低濃度咪唑緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，500 mmol/L NaCl）洗滌雜蛋白，250 mmol/L的高濃度咪唑緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，500 mmol/L NaCl）洗脫目的蛋白。SDS-PAGE檢測蛋白純化的各組分。

利用Western blot驗(yàn)證Td14144蛋白表達(dá)：將表皮蛋白從SDS-PAGE電泳膠轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，把PVDF膜用封閉液（TBST溶解的5%脫脂奶粉）孵育1 h，鼠源His一抗室溫孵育2 h，TBST洗PVDF膜6次每次5 min，羊抗鼠二抗室溫孵育1 h，TBST洗PVDF膜6次每次5 min，清洗完畢后，滴加顯色液，進(jìn)行曝光顯色反應(yīng)。

1.6 Td14144蛋白與不同類型幾丁質(zhì)的結(jié)合能力測試

選擇殼聚糖（chitosan）、α-幾丁質(zhì)（α-chitin）、β-幾丁質(zhì)（β-chitin）、膠體幾丁質(zhì)（colloidal chitin）4種不同類型的幾丁質(zhì)用于表皮蛋白與幾丁質(zhì)的體外結(jié)合試驗(yàn)。按照前文所述方法原核表達(dá)表皮蛋白Td14144并進(jìn)行純化。將純化好的蛋白透析置換到結(jié)合緩沖液中（20 mmol/L Tris-HCl，PH 8.0），然后分別與4種不同類型的幾丁質(zhì)混合，構(gòu)建總體積為200 μL的反應(yīng)體系，使得目的蛋白終濃度為0.5 mg/mL，幾丁質(zhì)終濃度為2 mg/mL。將混合物用旋轉(zhuǎn)混合儀在室溫條件下持續(xù)顛倒混勻3～4 h至反應(yīng)結(jié)束。離心取上清記為透過即未結(jié)合幾丁質(zhì)的蛋白質(zhì)，同時(shí)將沉淀加入結(jié)合緩沖液對其進(jìn)行反復(fù)清洗，以除去表面殘留的未結(jié)合幾丁質(zhì)蛋白質(zhì)，將清洗后的沉淀用緩沖液重懸記為洗脫液即幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)。最后使用SDS-PAGE檢測各收集組分，檢測蛋白與不同類型幾丁質(zhì)的結(jié)合情況。通過凝膠成像系統(tǒng)拍照后，使用Image J軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。將目的蛋白灰度值作為內(nèi)參，幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白灰度值與其相比，幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白相對灰度則代表表皮蛋白與4種不同類型幾丁質(zhì)的結(jié)合能力，均設(shè)3次獨(dú)立重復(fù)。同時(shí)利用SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件，對幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白相對灰度進(jìn)行單因素ANOVA方差分析及LSD法差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Td14144的基因克隆及序列分析

以雙叉犀金龜cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了預(yù)期大小的目的片段，測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對一致。Td14144基因編碼區(qū)708 bp（GenBank登錄號：MZ463195），編碼235個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量22 kD，理論等電點(diǎn)6.89；信號肽預(yù)測結(jié)果表明，N端第1～17位氨基酸為信號肽；親疏水性分析發(fā)現(xiàn)，總平均親水性為0.260，蛋白疏水區(qū)域較多，表明該蛋白為疏水性蛋白。

運(yùn)用SMART軟件對保守區(qū)域鑒定。結(jié)果顯示，Td14144編碼的蛋白質(zhì)在127～179位氨基酸處含有Rebers & Riddiford保守基序（圖1），以此確定Td14144屬于昆蟲表皮蛋白中的CPR家族。并通過CutProtFam-Pred在線網(wǎng)站預(yù)測顯示其屬于表皮蛋白RR-2亞族，該亞族主要存在于堅(jiān)硬表皮層中。

圖1 雙叉犀金龜表皮蛋白Td14144及pET28a-14144表達(dá)載體示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the construction of pET28a-14144 expression vectors and cuticular proteinTd14144 inTrypoxylus dichotomus

2.2 Td14144的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

采用從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索到的來自不同物種昆蟲表皮蛋白氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。Td14144表皮蛋白表現(xiàn)為物種分化在基因分化之前，與光肩星天牛Anoplophora glabripennis的cuticle proteinAgCP（登錄號：XP_023313029.1）、食糞金龜Onthophagus taurus的cuticle protein 19-likeOtCP19（登錄號：XP_022903306.1）、cuticle protein 7-likeOtCP7（登錄號：XP_022903288.1）位于一個(gè)小的分支，具有最近的親緣關(guān)系（圖2）。

圖2 雙叉犀金龜和其他物種基于表皮蛋白Td14144氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of cuticular proteinsTd14144 inTrypoxylus dichotomusand other insect species based on amino acid sequence

2.3 Td14144蛋白的原核表達(dá)與分離純化

以重組后的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-14144（圖1）。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá)。Td14144誘導(dǎo)的蛋白主要在上清中表達(dá)，分子量約22 kD左右，與預(yù)測分子量大小一致，表明Td14144蛋白成功表達(dá)，且屬于可溶性表達(dá)。利用金屬螯合層析對重組蛋白進(jìn)行分離純化，并將純化后的蛋白經(jīng)過SDS-PAGE及Western blot檢測，SDS-PAGE結(jié)果顯示在約22 kD大小處得到單一條帶，表明獲得較高純度的Td14144蛋白，Western blot結(jié)果顯示樣品相應(yīng)位置有明顯信號（圖3）。

圖3 雙叉犀金龜表皮蛋白Td14144的SDS-PAGE檢測和Western blot分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis and Western blot of the cuticular proteinTd14144 inTrypoxylus dichotomus

2.4 Td14144與不同類型幾丁質(zhì)的相互作用

幾丁質(zhì)結(jié)合試驗(yàn)表明，Td14144蛋白能夠與殼聚糖、α-幾丁質(zhì)、β-幾丁質(zhì)和膠體幾丁質(zhì)結(jié)合（圖4A）?；叶确治鲲@示Td14144蛋白對上述4種幾丁質(zhì)底物的結(jié)合能力存在一定差異。Td14144蛋白與殼聚糖和α-幾丁質(zhì)具有相對較強(qiáng)的結(jié)合能力，結(jié)合的蛋白質(zhì)量占體系中總蛋白質(zhì)量的比例分別約為66%、55%；對β-幾丁質(zhì)和膠體幾丁質(zhì)的結(jié)合能力則較弱，分別有21%、39%的蛋白參與結(jié)合（圖4B）。

圖4 雙叉犀金龜表皮蛋白Td14144的幾丁質(zhì)結(jié)合試驗(yàn)Fig. 4 Chitin-binding of cuticular proteinTd14144 inTrypoxylus dichotomus

CPR蛋白與幾丁質(zhì)的結(jié)合已被很多研究所證實(shí)。Rebers和 Willis[25]首次證明岡比亞按蚊Anopheles gambiae的CPR家族表皮蛋白AGCP2b的R&R保守基序具有幾丁質(zhì)結(jié)合的功能，可以與α-幾丁質(zhì)結(jié)合。Tang等[26]研究表明家蠶Bombyx mori幼蟲的表皮蛋白BmorCPR56具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性。亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis的表皮蛋白CPR9能夠與脫乙酰幾丁質(zhì)相互作用，導(dǎo)致其自身的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化[27]。目前有研究進(jìn)一步表明 CPR蛋白與幾丁質(zhì)的結(jié)合主要依賴于R&R保守結(jié)構(gòu)域[25,28]。將已有研究中能與幾丁質(zhì)結(jié)合的CPR家族蛋白的R&R結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多重序列比對（圖5），結(jié)果顯示，其均具有一段長約60個(gè)氨基酸的保守序列，該段序列中的酪氨酸、甘氨酸、纈氨酸和丙氨酸及苯丙氨酸具有高度保守性，推測這些氨基酸通過疏水以及π-π堆積作用介導(dǎo)CPR蛋白與幾丁質(zhì)的結(jié)合，通過保守性較低的其他位置的氨基酸差異，使不同表皮蛋白具有與不同幾丁質(zhì)結(jié)合的傾向性。

圖5 雙叉犀金龜表皮蛋白Td14144以及其他已知具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性的CPR蛋白的R&R結(jié)構(gòu)域序列比對Fig. 5 Sequence alignment of R&R domains of cuticular proteinTd14144 inTrypoxylus dichotomusand other CPR proteins known to have chitin-binding activity

3 討論

本研究成功得到了雙叉犀金龜RR-2家族的表皮蛋白Td14144。序列分析表明，Td14144由235個(gè)氨基酸組成，預(yù)測蛋白分子量為22 kD，具有1個(gè)保守的R&R結(jié)構(gòu)域，表明其可能與幾丁質(zhì)具有相互作用。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明Td14144與光肩星天牛、食糞金龜?shù)腞R-2家族表皮蛋白具有較近的親緣關(guān)系，在進(jìn)化上表現(xiàn)出物種分化先于基因分化。通過重組表達(dá)與分離純化，能夠在體外獲得純度達(dá)到95%的重組Td14144蛋白。此外，表皮蛋白Td14144的幾丁質(zhì)結(jié)合特性研究發(fā)現(xiàn)Td14144可以與殼聚糖、α-幾丁質(zhì)、β-幾丁質(zhì)和膠體幾丁質(zhì)結(jié)合，其中對殼聚糖和α-幾丁質(zhì)的結(jié)合能力最強(qiáng)。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)雙叉犀金龜中新的表皮蛋白基因，該基因?qū)儆贑PR家族中的RR-2亞族，并將其命名為Td14144（GenBank登錄號：MZ463195）。通過原核表達(dá)、分離純化獲得較純的重組蛋白，并證實(shí)其能夠結(jié)合不同類型的幾丁質(zhì)，推測可能在雙叉犀金龜堅(jiān)硬表皮的形成過程中發(fā)揮一定作用。本研究為RR-2亞族表皮蛋白提供了新的基因資源，進(jìn)一步證實(shí)了CPR蛋白具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性，將有助于了解昆蟲表皮蛋白在昆蟲發(fā)育過程中所承擔(dān)的重要生理功能，同時(shí)為雙叉犀金龜?shù)纳锓乐翁峁┝藵撛诘陌袠?biāo)。