張 浩,張榮勝,齊中強,于俊杰,喬俊卿,劉郵洲,劉永鋒*
(1. 江蘇大學環(huán)境與安全工程學院,鎮(zhèn)江 212013,2. 江蘇省農業(yè)科學院植物保護所,南京 210014)
關 鍵 字:解淀粉芽胞桿菌;懸乳劑;載體;助劑;防效
芽胞桿菌Bacillusspp.是防治植物病害的重要生防資源,其自然界中廣泛存在,該類菌株具有抑制病原菌生長的能力,對環(huán)境友好,是微生物農藥研發(fā)的熱點[1]。目前以解淀粉芽胞桿菌B. amyloliquefaciens、枯草芽胞桿菌B. subtilis等為代表的芽胞桿菌已經在生產中廣泛應用,解淀粉芽胞桿菌登記的劑型主要以懸浮劑(Suspension concentrate,SC)、可濕性粉劑(Water power,WP)和水分散粒劑(Water dispersible granule,WG)為主,類型比較單一;因此,研發(fā)新型環(huán)保的芽胞桿菌類殺菌劑新劑型對微生物農藥推廣應用有重要的意義。
懸乳劑(Suspoemulsion, SE)是由不溶于水的固體原藥和一種油狀液體原藥(或原藥溶于少量有機溶劑所得的油相液體),以及各種助劑在水介質中分散均化而形成的高懸浮乳狀液體系[2];具有改善藥效、擴大應用范圍和延緩抗性的性能,屬于環(huán)保劑型[3]。解淀粉芽胞桿菌Lx-11是江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所水稻病害研究室分離獲得,對防治水稻白葉枯病等細菌性病害有良好效果[4]。本研究引進納米材料,對解淀粉芽胞桿菌Lx-11發(fā)酵液進行劑型制備,研發(fā)解淀粉芽胞桿菌Lx-11懸乳劑,為芽胞桿菌微生物殺菌劑的劑型研發(fā)提供參考。
1.1.1 供試菌株和培養(yǎng)基 解淀粉芽胞桿菌Lx-11由江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所生物防治研究室保存。采用基礎發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米淀粉11.2 g,黃豆粉14.6 g,酵母膏0.6 g, CaCO31.8 g,魚粉5.0 g,玉米漿5.0 g,補水至1000 mL,pH 7.0[5]。種子液培養(yǎng)基(YPG):胰蛋白胨5.0 g,葡萄糖5.0 g,酵母膏5.0 g,補水至1000 mL,pH 7.0。
1.1.2 種子液制備 制備方法參考文獻[5]。
1.1.3 解淀粉芽胞桿菌Lx-11發(fā)酵液菌體含量檢測方法 將解淀粉芽胞桿菌Lx-11發(fā)酵液稱取1 mL用無菌水稀釋106、107、108倍,分別涂于YPGA培養(yǎng)基的平板上,于28 ℃培養(yǎng),每個處理 3 次重復,24 h后,觀察平板上解淀粉芽胞桿菌的菌落數(shù),并計算菌落形成單位(cfu)[6]。
1.2.1 藥劑和主要儀器 本試驗所需的藥劑(表1)均市售的工業(yè)級產品。主要儀器:激光粒度分析儀GSL-101BI(遼寧儀表研究所有限公司),恒溫干燥箱(上海精宏設備有限公司),數(shù)顯高速均質機PJ200-S(湖南力辰科技有限公司),高速多功能粉碎機 800Y(永康市鉑歐五金制品有限公司),數(shù)字顯示粘度計NDJ-5S(上海力辰邦西儀器科技有限公司),接觸角測試儀JC2000C(上海中晨數(shù)字技術設備有限公司),表面張力測試儀DCAT 11EC(Datephysics)。
表1 供試試劑Table 1 Tested agents
1.2.2 工藝流程 將吸附載體和解淀粉芽胞桿菌 Lx-11發(fā)酵液(菌體含量4.0×109cfu/mL)混合,然后置于電熱恒溫干燥箱中(45±2)℃烘干,用高速多功能粉碎機進行粉碎處理,然后放入植物油中混勻,形成油相,接著將保護劑溶于水中,形成水相,將水相和油相混合,加入助劑,在數(shù)顯高速均質機作用下進行乳化均質得到最終產品。最后按照1.1.3方法測定產品中的解淀粉芽胞桿菌的含量,工藝流程見圖1。
圖1 解淀粉芽胞桿菌Lx-11懸乳劑工藝流程圖Fig. 1 The process flow diagram ofB. amyloliquefaciensLx-11 suspoemulsion
1.3.1 吸附載體對解淀粉芽胞桿菌Lx-11菌體含量的影響 采用直接混合法,將吸附載體按照最高添加比例與解淀粉芽胞桿菌Lx-11發(fā)酵液(含量 4.0×109cfu/mL)混合,同時不加助劑的解淀粉芽胞桿菌Lx-11發(fā)酵液作為對照(CK),在常溫放置,分別在7、30、90 d測定,通過1.1.3方法測定菌體含量,評價各載體對解淀粉芽胞桿菌菌體含量的影響[7]。
1.3.2 不同載體吸水率的測定 在無菌條件下,將無菌水與各載體材料充分混勻,每次加入無菌水的用量按照一定梯度逐漸增加,使載體材料濕潤,保持疏松,不結塊。以100 g載體所含的液體量為載體吸水率,測定3次重復試驗的平均值[8]。
1.3.3 載體中有效菌體釋放率的測定 將菌劑放置在陰涼處保存,2 d后取10 g 樣品加入100 mL生理鹽水中200 r/min下振蕩培養(yǎng) 2 h,然后立即用稀釋平板計數(shù)法測定釋放的菌數(shù)。用接種菌數(shù)與釋放菌數(shù) (測定時載體實際的有效菌體含量)相比計算釋放率[9]。
1.4.1 乳化劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11菌體含量的影響 參考1.3.1的試驗方法。
1.4.2 不同親水親油平衡值(Hydrophile Lipophilic Balance,HLB)乳化穩(wěn)定性測定 根據(jù)HLB值的可加性,將選出的乳化劑兩兩混合,制備出不同HLB值的復配乳化劑。HLB混=(Wa×HLBa+Wb×HLBb)/(Wa+Wb),式中Wa、Wb為乳化劑a和b在復合乳化劑中所占的質量比例,HLBa、HLBb為乳化劑a和b各自所對應的HLB值[10]。
將制備的不同HLB值乳化劑的乳液移入50 mL離心管中在 4000 r/min 條件下離心 2 min,根據(jù)乳化層體積計算乳化穩(wěn)定性[11],乳化穩(wěn)定性(%)=乳化層體積/總體積×100。
1.4.3 乳化劑用量的測定 將復配的乳化劑分別按4%、6%、8%和10%用量加入油水混合相中,用均質機進行乳化均質后,觀察乳液分層,析水析油的情況[12]。
1.5.1 保護劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11菌體含量的影響 參考1.3.1的試驗方法。
1.5.2 不同保護劑對解淀粉芽胞桿菌的保護效果評價 參照 1.5.1中篩選的結果,將不同種類的保護材料按比例溶于水,作為水相,制作懸乳劑。將不加任何保護劑的水作為對照(CK)和加入不同保護劑的懸乳劑放入恒溫培養(yǎng)箱(35±2)℃,分別在1、4、8和12周,采用1.1.3方法測定 Lx-11 的菌體含量[7]。
1.6.1 分散劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11菌體含量的影響 參考1.3.1的試驗方法。
1.6.2 不同分散劑分散性能測定 將添加脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸鈉或硫酸銨的懸乳劑樣品加入到標準硬水中,觀察其在硬水中形成乳液的能力,滴入水中立即呈云霧狀判斷為優(yōu),有顆粒下沉但能基本分散判斷為良,需要搖晃才可分散判斷為中,絮狀下沉不能自動分散需強烈搖動判斷為差[13],同時觀察乳液分離情況如無浮油、沉淀析出判定乳液穩(wěn)定性合格[14]。
防凍劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11菌體含量的影響參考1.3.1的試驗方法。
1.8.1 增效助劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11菌體含量的影響 參照1.3.1的試驗方法。
1.8.2 表面張力和接觸角的測定 將未加增效助劑的懸乳劑作為對照(CK)和加入增效助劑的懸乳劑分別稀釋到100倍,用表面張力測試儀測定[15],同時采集新鮮的水稻葉片,不破壞其葉片結構,將其平整的固定在接觸角測量儀上,時期保證自然狀態(tài),在密閉環(huán)境中用微量進樣器移取10 μm藥滴滴在水稻葉片正面,立即用接觸角測定儀測定各處理藥液的接觸角,從滴加藥液開始,30 s內完成測量,每個處理重復5次,取其平均值[16]。
將配置好的油相和水相混合液在高速均質機不同轉速下進行乳化均質,觀察乳化完成后是否分層,有無氣泡,采用激光粒度分析儀 GSL-101BI測定不同轉速下的粒徑大小。
根據(jù)農藥登記產品規(guī)格制定規(guī)范[17],檢測懸乳劑與發(fā)酵液的外觀、pH、懸浮率等性能指標,同時對兩種藥劑的實際噴灑效果進行對比分析。參照GB/T 1601—1993方法[18]測定pH。參照GB/T 14825—2006方法[19]測定懸浮率。參照GB/T 19136—2003方法[20]測定熱貯穩(wěn)定性。參照GB/T 31737—2015方法[21]測定傾倒后殘余物和洗滌后殘余物。參照GB/T 28137—2011方法[22]測定持久起泡性。
田間小區(qū)試驗于2020年8月在江蘇省農業(yè)科學院試驗田中進行,試驗小區(qū)面積20 m2,每處理重復3次,小區(qū)隨機排列。供試水稻品種:金剛30。試驗處理見表14,每個處理3個重復,試驗期間不施用其他殺菌劑,其他栽培管理措施一致。水稻孕穗期接病原菌(菌株為浙173[23]),接種菌液濃度OD600=0.8,各小區(qū)接種20株,每株接種10片葉以上。防效調查每小區(qū)五點取樣,每點隨機調查5株,每小區(qū)共調查25株,記錄每片葉片的病斑長度和葉長,計算防治效果。接種水稻白葉枯病菌前施藥,接種后間隔7 d左右進行第 2次施藥防治,在2次施藥14 d后調查防治效果。防治效果(%)=(對照區(qū)平均病斑長度-處理區(qū)平均病斑長度)/對照區(qū)平均病斑長度×100[24]。
采用Excel 2010和SPSS 21軟件進行數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。
2.1.1 吸附載體對解淀粉芽胞桿菌Lx-11菌體含量的影響 添加白炭黑、硅藻土在7、30、90 d的菌體含量與CK相比均無顯著性差異;添加高嶺土、玉米淀粉在分別在7和90 d的菌體含量略低于CK;而添加活性炭在7、30、90 d的菌體含量均顯著低于CK,在90 d菌體含量僅為5.53×108cfu/mL,不適合作為配方使用(表2)。
表2 吸附載體對解淀粉芽胞桿菌Lx-11菌體含量的影響Table 2 Influence of adsorption carrier on content ofB.amyloliquefaciens
2.1.2 不同載體吸水率和有效菌體釋放率 4種載體的吸水能力依次為白炭黑>硅藻土>高嶺土>玉米淀粉,菌體釋放率依次為玉米淀粉>白炭黑>高嶺土>硅藻土,綜合考慮吸水率和釋放率,選擇白炭黑作為吸附載體(表3)。根據(jù)白炭黑的吸水率,白炭黑與發(fā)酵液按1:7~1:8比例配合使用。
表3 不同載體的吸水率和解淀粉芽胞桿菌Lx-11有效釋放率Table 3 Water absorption of different carriers and effective release rate ofB. amyloliquefaciensLx-11
2.2.1 乳化劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11菌體含量的影響 添加Span80、Tween 80、 Tween 20、農乳1601在7 d的菌體含量略低于CK,在30、90 d與CK無顯著性差異,添加Vo-1的菌體含量在7、30 d略低于CK,在90 d與CK無顯著性差異。因此,5種乳化劑均可添加使用(表4)。
表4 乳化劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11菌體含量的影響Table 4 Effect of emulsifier on content ofB.amyloliticaLx-11
2.2.2 乳化劑穩(wěn)定性和用量的篩選 農乳 1601與Vo-1作為乳化劑,經過剪切,均質,放置1 d,存在分層現(xiàn)象,不適合作為解淀粉芽胞桿菌的乳化劑。將Span80與Tween80(或Tween 20)配置成親水型乳化劑(HLB>10),通過離心法測量得出,當HLB為13~14時,乳液的乳化穩(wěn)定性最高(表5),當用量達到8%時,可以形成均勻、穩(wěn)定的懸浮劑,無析水析油(表6)。
表5 不同的HLB值對乳化穩(wěn)定性的影響Table 5 Influence of different HLB values on emulsion stability
表6 乳化劑不同的用量對乳化體系的影響Table 6 Influence of different dosage of emulsifier on emulsifying system
2.3.1 保護劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11的菌體含量的影響 添加殼聚糖、糊精、麥芽糊糖精、可溶性淀粉的菌體含量在7、30、90 d與CK相比均有顯著性差異,在90 d的菌體含量分別為1.54×106、2.56×108、9.63×108,9.10×108cfu/mL,對菌體含量影響較大,不適合作為保護劑。而添加海藻酸鈉和海藻糖在7 d的菌體含量略低于CK,在30、90 d與CK均無顯著性差異,可以作為保護劑進一步篩選(表7)。
表7 保護劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11菌體含量的影響Table 7 Effect of protective agent on content ofB.amyloliticaLx-11
2.3.2 不同保護劑對解淀粉芽胞桿菌的保護效果評價 添加海藻酸鈉和海藻糖作為保護劑在培養(yǎng)箱(35±2)℃中在 1、4、8、12周與不加保護劑(CK)相比均有顯著性差異,菌體含量明顯高于CK。表明海藻糖和海藻酸鈉對菌體具有保護作用,可以作為保護劑添加使用(圖2)。
圖2 37 ℃熱貯對解淀粉芽胞桿菌Lx-11菌體含量的影響Fig. 2 Effect of 37 ℃ heat storage on content ofB.amyloliticaLx-11
2.4.1 分散劑對解淀粉芽胞桿菌的菌體含量的影響 添加十二烷基硫酸鈉、烷基酸磺酸鈉、聚羧酸鹽2836在7、30、90 d與CK相比均具有顯著性差異,7 d的菌體含量分別下降為 3.40×108、1.10×108、2.00×106cfu/mL;添加十二烷基磺酸鈉在30、90 d與CK均呈現(xiàn)出顯著性差異,在90 d的菌體含量僅為2.27×105cfu/mL,表明這4種分散劑不適合作為農藥配方添加使用(表8)。
表8 分散劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11菌體含量的影響Table 8 Effect of dispersant on content ofB.amyloliticaLx-11
2.4.2 不同分散劑的分散性能測定 木質素磺酸鈉與聚羧酸鹽 2225分別是黑色和灰色固體加入懸乳劑影響了外觀形態(tài),添加脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸鈉和硫酸銨的分散性都較好,添加硫酸銨的懸乳劑在水中有油花析出,因此選取分散性和稀釋穩(wěn)定性較高的脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸鈉作為分散劑(表9)。
表9 不同分散劑的分散性和稀釋穩(wěn)定性Table 9 Dispersion and dilution stability of different dispersants
懸乳劑與市售的噻唑鋅分散性能相比,懸乳劑在水中立即呈云霧狀分散,無顆粒下沉,入水60 s后,自動均勻分散于水中,而噻唑鋅在水中呈絮狀下沉不能自動分散,需要搖晃,分散性較差,上下分布不均勻(圖3)。
圖3 噻唑鋅和懸乳劑分散性能對比Fig. 3 Comparison of dispersion properties between zinc thiazole and suspoemulsion
添加丙三醇的菌體含量在90 d與CK存在顯著性差異,而添加乙二醇、尿素的菌體含量在7、30、90 d與CK相比均無顯著性差異,表明對芽胞桿菌菌體含量是無影響的,可以作為防凍劑添加使用(表10)。
表10 防凍劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11菌體含量的影響Table 10 Effect of antifreeze on content ofB.amyloliticaLx-11
2.6.1 增效助劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11菌體含量的影響 添加懷農特的菌體含量在7、30、90 d與CK均存在顯著性差異,在90 d的菌體含量僅為2.77×107cfu/mL;添加克歐森和卵磷脂的菌體含量在30、90 d與CK存在顯著性差異,克歐森在90 d的菌體含量僅為1.33×108cfu/mL;而添加有機硅的菌體含量在30 d為1.87×109cfu/mL,略低于CK,在7、90 d與CK無顯著性差距,添加SY-6535與TM-10的菌體含量在7、30、90 d與CK均無顯著性差異,表明對解淀粉芽胞桿菌的菌體含量無影響,可以作為增效助劑進一步篩選(表11)。
表11 增效助劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11菌體含量的影響Table 11 Effect of synergistic agent on content ofB.amyloliticaLx-11
2.6.2 添加不同增效助劑的懸乳劑表面張力和接觸角 添加SY-6535有效降低了懸乳劑的接觸角與表面張力,分別為84.66°和33.97 mN/m,與CK呈現(xiàn)出顯著性差異;添加有機硅的表面張力與CK相比有顯著性差異,但未能有效降低接觸角。而添加TM-10的表面張力、接觸角與CK無顯著性差異,最終選取SY-6535作為增效助劑(圖4)。
圖4 助劑種類對懸乳劑表面張力和接觸角的影響Fig. 4 Effect of additives on surface tension and contact angle of suspoemulsion
當轉速在4000 r/min以下時,未能形成乳化體系,有分層,而且粒徑較大,達到121.74 μm;隨著轉速的增大,粒徑越來越小,轉速達到6000 r/min時,已經形成穩(wěn)定的乳化體系,無分層;轉速達到10000 r/min,會出現(xiàn)少量氣泡;轉速達到12000 r/min,DV90達到13.62 μm,當達到13000 r/min,粒徑大小已經趨于穩(wěn)定。綜合考慮粒徑和節(jié)能因素的影響,選取12000 r/min作為使用的最佳轉速(表12)。
表12 高速均質機轉速對乳化穩(wěn)定性的影響Table 12 Influence of speed of high speed homogenizer on emulsifying stability
將發(fā)酵液和試驗篩選出來的配方所配制的樣品放置恒溫培養(yǎng)箱(35±2)℃中貯存12周的結果表明,初始菌量為1.0×109cfu/mL的懸乳劑在2、4、6、8、12周與初始菌量為1.3×109cfu/mL的發(fā)酵液菌體含量均有顯著性差異,12周的懸乳劑菌體含量為初始菌量的84.2%,熱貯穩(wěn)定性良好,說明制劑配方是穩(wěn)定的。而發(fā)酵液隨時間增加,菌體含量快速下降,12周的菌體含量僅為初始菌量的16.9%(圖5)。
圖5 懸乳劑與發(fā)酵液的熱貯性能測定Fig. 5 Thermal storage properties of suspoemulsion and fermentation liquid
從實際施藥效果來看,懸乳劑可以迅速潤濕水稻葉片,而發(fā)酵液水稻葉片上的潤濕性差,發(fā)生彈跳和飛濺行為,從而造成藥效的大量流失(圖6)。發(fā)酵液外觀是棕色液體,粘度過低,靜置存在分層現(xiàn)象,而懸乳劑外觀是白色均勻懸浮液體,粘度適中,且懸浮率高于發(fā)酵液(表13)。
圖6 懸乳劑與發(fā)酵液的潤濕性能測定Fig. 6 The wetting performance of suspoemulsion and fermentation
表13 解淀粉芽胞桿菌Lx-11懸乳劑和發(fā)酵液主要性能指標Table 13 Main performance indexes ofB.amyloliticaLx-11 suspoemulsion and fermentation
3種藥劑對白葉枯病的田間防治效果(表14)。田間試驗結果表明,人工剪葉接種噴2次藥后,解淀粉芽胞桿菌Lx-11懸乳劑和噻森銅的防效分別為56.3%、62.4%,顯著高于解淀粉芽胞桿菌Lx-11發(fā)酵液。
表14 3種藥劑對水稻白葉枯的防治效果Table 14 Control effects of three insecticides on rice bacterial blight
本試驗對解淀粉芽胞桿菌 Lx-11懸乳劑的制備和田間應用技術進行研究,目的在于研制出可以延長芽胞桿菌貨架期,提高利用率的芽胞桿菌新型環(huán)保劑型。懸乳劑兼具懸浮液和濃乳劑的優(yōu)點,增強了農藥對植物細胞的滲透性,吸收率高,提高了防治效果和農藥的利用率,因此藥效效果更好[25]。武海峰等[26]用白僵菌D1-5胞子制備懸乳劑,結果發(fā)現(xiàn)白僵菌懸乳劑不僅對玉米螟有明顯的毒殺作用,毒殺的效果高于克百威顆粒劑,與傳統(tǒng)白僵菌粉劑和顆粒劑相比,既解決了其勞動效率低、殺蟲效果慢、應用有限的缺點,同時對玉米的增產起到了促進作用。張松影等[27]用黃綠綠僵菌 Mf82制備的懸乳劑與傳統(tǒng)的胞子制劑相比具有殺蟲效果顯著、粘著力強、滲透性好、易于噴灑、在保證防治效果的前提下節(jié)省載體油的用量、降低載體油對作物的藥害等優(yōu)點。芽胞桿菌作為活體微生物,加工難度更加大,使用任何載體和助劑都需要測定對其菌體含量有無影響,而且懸乳劑對配方的要求很高,需要同時考慮乳液的均質性和懸浮性,通過選取合適的分散劑和乳化劑是克服固體顆粒和油滴之間不均勻絮凝問題的關鍵[28]。
通過測定不同載體的吸水率和有效菌體釋放率,篩選出氣相白炭黑(納米級)作為解淀粉芽胞桿菌的吸附載體,經過分散性和乳化穩(wěn)定性試驗篩選出脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸鈉、Span80和 Tween80作為分散劑和乳化劑,同時通過測定藥劑的表面張力和接觸角,篩選出SY-6535作為增效助劑,在高速均質機下剪切均質,研制出“解淀粉芽胞桿菌Lx-11懸乳劑”,不僅延長了芽胞桿菌的貨架期,提高了利用率,同時也達到了減量增效的目的,田間防效明顯高于解淀粉芽胞桿菌發(fā)酵液。
該產品的優(yōu)勢在于將納米載體和懸乳劑制備技術相結合,將生物發(fā)酵液、載體和助劑等加工成安全、環(huán)保、高效的農藥劑型,而且制作過程中均使用的是綠色環(huán)保型材料,將生物源溶劑代替有機溶劑,環(huán)境效益顯著,符合當今農藥劑型發(fā)展趨勢[29]。開發(fā)高效、環(huán)境友好型的劑型是未來農藥發(fā)展的方向,生物農藥開發(fā)成高質量穩(wěn)定的農藥劑型的難度依然存在,將納米材料和技術應用于生物農藥劑型的研制,對改善農藥有效成分的分散性和穩(wěn)定性,減少農藥的流失和降解起著非常重要的作用[30]。