芽胞桿菌SM905的鑒定及其對鐵皮石斛膠孢炭疽菌的抑菌活性研究

竺利紅，李孝輝，施躍峰

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院植物保護與微生物研究所，杭州 310021）

鐵皮石斛Dendrobium candidiumWall. ex Lindl.，為蘭科石斛屬的多年生附生型草本植物，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，其多糖成分，具有提高人體免疫力、抗氧化和抗腫瘤的功效，人工栽培已相當普遍[1,2]。

鐵皮石斛喜歡溫暖陰濕的環(huán)境，病蟲發(fā)生危害逐年加重，尤其是葉片炭疽病更為嚴重，已成為制約鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化發(fā)展的主要因素之一[3,4]。該病由膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides引起，主要危害葉片和莖桿，引起落葉甚至植株枯死，對產(chǎn)量和品質影響極大[5]。而我國在鐵皮石斛上尚沒有一種登記藥劑，生產(chǎn)上濫用農(nóng)藥的現(xiàn)象普遍，農(nóng)藥殘留超標隱患大，“藥中藥”問題突出，嚴重威脅鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展[6]。對鐵皮石斛炭疽病的防治，急需安全高效的專用藥劑。

生物防治是目前植物病害防治的發(fā)展方向之一，其中微生物殺菌劑具有環(huán)境友好、安全性高等優(yōu)點而成為研究熱點[7]。已獲農(nóng)藥登記的微生物殺菌劑主要有芽胞桿菌類、木霉菌、假單胞菌類等[8]，登記作物包括水稻、小麥、番茄、煙草等，鐵皮石斛尚未在列。國內外關于鐵皮石斛炭疽病的生物防治研究報道較少，少量研究僅限于實驗室拮抗菌的分離篩選。曾欣等[9]通過離體葉片測定法發(fā)現(xiàn)內生細菌貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensisB-11對鐵皮石斛炭疽病的防效為64%。劉艷明等[10]通過平板對峙法測定了Ceriporiasp.F102等內生真菌到對鐵皮石斛膠孢炭疽菌的抑菌活性。為了保障鐵皮石斛的綠色高效種植，迫切需要更多有應用前景的生防資源，因此很有必要分離篩選該病原菌的優(yōu)質、高效拮抗菌。本研究從土壤中分離到一株芽胞桿菌Bacillussp. SM905，發(fā)現(xiàn)其對鐵皮石斛膠孢炭疽菌有較好的抑制作用，對其展開了菌種鑒定、抑菌活性測定和盆栽防治試驗，為進一步的田間應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株芽胞桿菌SM905、膠孢炭疽菌由本實驗室保存。10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑由瑞士正先達作物保護有限公司生產(chǎn)。細菌基因組DNA抽提試劑盒、PCR試劑、16S rDNA通用引物27F/1492R、gyrB測序引物UP-1S/UP-2Sr由生工工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)或合成。種子培養(yǎng)基：黃豆餅粉5 g，葡萄糖1 g，水1000 mL，pH 7.5。發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮20 g，黃豆餅粉15 g，番薯淀粉10 g，NaCl 5 g，K2HPO43 g，MgSO41.5 g，水1000 mL，pH 7.5。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1000 mL，pH 自然。PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 mL，pH自然。

1.2 菌株SM905鑒定

1.2.1 形態(tài)學及生理生化特征鑒定 參照文獻[11]方法進行。

1.2.2 分子鑒定 采用基因組DNA抽提試劑盒提取菌株SM905的總DNA，分別用16S rDNA和gyrB引物擴增。16S rDNA擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s；35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。gyrB擴增條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測確定后送生工工程（上海）股份有限公司測序。測序結果分別在Genbank基因數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，并構建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 菌株SM905發(fā)酵上清液和粉劑的制備

取新鮮培養(yǎng)的SM905斜面接種于種子培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，即得種子液。取種子液（按5%的接種量計）接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至2/3芽胞脫落，取部分發(fā)酵液8000 r/min離心15 min，上清液過0.22 μm微孔過濾器，即得發(fā)酵上清液，4 ℃保存。剩余發(fā)酵液用助劑吸附、烘干，制備含孢量為100億CFU/g的粉劑，常溫避光保存。

1.4 菌株SM905對鐵皮石斛膠孢炭疽菌的抑制作用

1.4.1 對膠孢炭疽菌的抑菌活性 采用平板對峙法[12]測定 SM905對膠孢炭疽菌的抑菌活性。取新鮮培養(yǎng)的SM905斜面，用接種環(huán)蘸取少量接入到PDA培養(yǎng)基距中心25 mm的4個點，打孔器打取培養(yǎng)7 d的膠孢炭疽菌菌絲塊（d=6 mm）接入培養(yǎng)皿中央，培養(yǎng)5 d后觀察抑菌效果。

1.4.2 對膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)的影響 將膠孢炭疽菌菌絲塊接種在 PDB培養(yǎng)液，于 28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)10 d 后，無菌擦鏡紙過濾，濾液即為孢子懸浮液。將發(fā)酵上清液與融化的PDA培養(yǎng)基混合，使其分別稀釋 5、10、20倍，對照組為空白PDA培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基冷卻到45 ℃時，加入1 mL孢子懸浮液，迅速搖勻倒平板。每處理設 5 個重復，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。每皿用打孔器隨機打3個孔，將取得的培養(yǎng)物置于光學顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)狀況，以孢子芽管長度大于孢子短半徑者為萌發(fā)標準，統(tǒng)計孢子萌發(fā)率。

1.4.3 對膠孢炭疽菌菌絲生長的抑制作用 采用菌絲生長速率法[13]測定不同濃度發(fā)酵上清液對鐵皮石斛膠孢炭疽菌菌絲生長的抑制效果，將發(fā)酵上清液與融化的PDA培養(yǎng)基混合，使其分別稀釋5、10、20倍，以加入等體積無菌水的PDA培養(yǎng)基為對照。倒平板，待冷卻后在平板中心接入膠孢炭疽菌菌絲塊（d=6 mm），每處理設5個重復，于28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率，并利用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，抑制率（%）=（對照組菌落直徑－處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-6）×100。

采用插片法[14]觀察菌絲的形態(tài)，即取5 mL SM905發(fā)酵上清液加入95 mL融化的PDA培養(yǎng)基中，混勻，對照組培養(yǎng)基中加入等量無菌水，倒平板。將無菌蓋玻片 30度角斜插入凝固的平板，在蓋玻片與培養(yǎng)基交接處接入膠孢炭疽菌菌絲。于28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。取出蓋玻片置于光學顯微鏡下觀察菌絲生長狀態(tài)，另取少量菌絲于掃描電鏡進一步形態(tài)觀察。

1.5 菌株SM905防治鐵皮石斛炭疽病盆栽試驗

試驗采用“雁蕩1號”品種，采用人工接種病原菌，即每盆噴施含孢量為107孢子/mL的鐵皮石斛膠孢炭疽菌孢子懸浮液10 mL，2 d后用于試驗。試驗設4個處理：（1）噴施SM905粉劑100倍液20 mL 1次；（2）間隔7 d噴施SM905粉劑100倍液20 mL 2次；（3）噴施10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑800倍液20 mL 1次；（4）噴施無菌水20 mL 1次。每處理30盆，重復3次。每個處理分別于首次施藥后15、30 d隨機調查30株鐵皮石斛，統(tǒng)計病情指數(shù)并計算防效。病情分級標準為：0級，無病斑；1級，病斑面積占整個葉面積5%以下；3級，病斑面積占整個葉面積6%～15%；5級，病斑面積占整個葉面積16%～25%；7級，病斑面積占整個葉面積26%～50%；9級，病斑面積占整個葉面積50%以上。計算病情指數(shù)和防治效果，病情指數(shù)＝Σ（病級數(shù)×該病級植株數(shù)）/（最大病級數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100，利用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 菌株 SM905鑒定

2.1.1 形態(tài)學、生理生化特征 SM905在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上呈淡黃色菌落，表面干燥且粗糙，邊緣不整齊。革蘭氏染色呈陽性，短桿狀，兩端鈍圓，單個、成對或成串出現(xiàn)，橢圓形芽胞，中生到次端生（圖1）。好氧，能利用葡萄、和乳糖、蔗糖、甘露醇和麥芽糖等，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，可水解淀粉和明膠，氧化酶反應、V-P反應、硝酸鹽還原反應和接觸酶反應均呈陽性。根據(jù)上述特征，初步判斷SM905為芽胞桿菌屬。

圖1 SM905桿狀體（A）、孢囊體（B）、芽胞（C）形態(tài)（100×）Fig. 1 Rod-shaped strain(A), sporangium (B) and spore(C)morphology of strain SM905 (100×)

2.1.2 16S rDNA和gyrB 序列分析 菌株SM905的16S rDNA和gyrB序列Genbank號分別為OM021868和OM037015，并與相關屬種進行比對，構建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）可以看出，菌株SM905與貝萊斯芽胞桿菌B.velezensis的模式菌株BCRC 17467聚合在一枝，同源性達99%以上。結合形態(tài)學和生理生化特征，將菌株SM905鑒定為貝萊斯芽胞桿菌。

圖2 菌株SM905基于16S rDNA（A）和gyrB（B）序列的進化樹Fig. 2 Phylogenetic trees of strain SM905 based on sequences of 16S rDNA (A) andgyrB (B)

2.2 菌株SM905對膠孢炭疽菌的抑制作用

2.2.1 對膠孢炭疽菌的抑菌活性 從圖3可知，SM905對鐵皮石斛炭疽病菌有較強的抑菌活性，形成了明顯的抑菌帶，界限邊緣整齊，靠近抑菌帶邊緣菌絲稀疏并顏色加深。

圖3 SM905對膠孢炭疽菌的抑菌活性Fig. 3 Antifungal activity of SM905 againstColletotrichum gloeosporioides

2.2.2 對膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)的影響 與對照相比，不同稀釋倍數(shù)的 SM905發(fā)酵上清液對膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)率與對照相比差異不顯著（表1）。從形態(tài)上觀察，SM905發(fā)酵上清液對新萌發(fā)菌絲生長抑制明顯，表現(xiàn)為菌絲粗細不一，分支少，菌絲中部有明顯的膨大，而對照組菌絲粗細均勻、舒展，分支多，呈大網(wǎng)狀（圖4）。表明SM905發(fā)酵過程中產(chǎn)生了含有抗膠孢炭疽菌的活性物質，能顯著抑制其孢子萌發(fā)后新菌絲的生長。

表1 SM905發(fā)酵上清液對膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)及菌絲生長的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of strain SM905 fermentation filtrate on spore germination and mycelial growth ofC.gloeosporioides

圖4 SM905對膠孢炭疽菌孢子新萌發(fā)菌絲的影響(400X)Fig. 4 Effect of SM905 against the newly germinated mycelium ofC. gloeosporioides(400X)

2.2.3 對膠孢炭疽菌菌絲生長的影響 從表1可以看出，SM905發(fā)酵上清液不同稀釋倍數(shù)對膠孢炭疽菌菌絲生長的抑制率存在極顯著差異（P＜0.01），隨著稀釋倍數(shù)增大，抑制效果逐漸下降（表1）。SM905發(fā)酵上清液 20倍稀釋液對膠孢炭疽菌菌絲生長的抑制率仍大于90%，通過光學顯微鏡觀察到該濃度處理組氣生菌絲粗細不一、盤曲折疊，隔膜之間菌絲縮短，菌絲膨大，大量色素積累；基部菌絲產(chǎn)生大量分生孢子。而對照組膠孢炭疽菌菌絲均勻、光滑、粗壯，菌絲內無色素積累現(xiàn)象，無分生孢子產(chǎn)生。進一步通過掃描電鏡觀察到處理組菌絲出現(xiàn)大量空洞，菌絲斷裂現(xiàn)象明顯，證實了SM905對膠孢炭疽菌菌絲的破壞作用（圖5）。

圖5 SM905對膠孢炭疽菌菌絲形態(tài)的影響Fig. 5 The effect of strain SM905 on mycelial morphology ofC. gloosporioides

2.3 菌株SM905防治鐵皮石斛炭疽病盆栽試驗

由盆栽試驗結果(表2)可以看出，人工接種病原菌后，對照組開始陸續(xù)發(fā)病，30 d時病情指數(shù)為15.78。SM905粉劑100倍液間隔7 d噴施2次，藥后15 d對鐵皮石斛炭疽病的防效達83.96%，與噴施1次的防效（55.36%）差異極顯著，但低于10%苯醚甲環(huán)唑800倍液（85.4%）；30 d時防效仍保持在80%，優(yōu)于10%苯醚甲環(huán)唑800倍液（79.28%），顯著優(yōu)于SM905噴施1次防效（50.70%）。表明SM905防治鐵皮石斛炭疽病應選擇發(fā)病初期用藥，并且連續(xù)用2次防效更好，持效期更長。

表2 SM905粉劑防治鐵皮石斛炭疽病的盆栽試驗Table 2 Control efficacy of strain SM905 onDendrobiumbium officinaleanthracnose

3 討論

鐵皮石斛是名貴中藥材，炭疽病是影響其品質和產(chǎn)量的重要病害之一。研制安全、高效的生物農(nóng)藥，對于保障鐵皮石斛質量安全，促進產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要的研究意義及廣闊的應用前景。貝萊斯芽胞桿菌屬于芽胞桿菌屬，該菌首次發(fā)現(xiàn)于西班牙馬拉加的一條名為貝萊斯河的河口。研究表明貝萊斯芽胞桿菌對引起稻瘟病、梨灰霉病、草莓炭疽病、小麥赤霉病等病害的多種植物病原菌具有抑制作用[15-18]，在生物防治方面具有巨大的應用潛能。貝萊斯芽胞桿菌對鐵皮石斛炭疽病的研究局限于實驗室拮抗菌的分離篩選階段。所篩菌株僅在室內中表現(xiàn)出拮抗作用還是不夠的，只有在應用中依舊表現(xiàn)出良好防效的拮抗菌株，才具有生防應用潛力[19]。本研究篩選到一株貝萊斯芽胞桿菌SM905，平板對峙試驗表明該菌對鐵皮石斛膠孢炭疽菌具有較強的抑制活性。本研究還進一步展開了 SM905對鐵皮石斛炭疽病的盆栽防治試驗，結果表明SM905粉劑100倍液對炭疽病的防效達80%以上，優(yōu)于10%苯醚甲環(huán)唑800倍液，本說明該菌株具有較強的開發(fā)前景。

各生防菌株的來源不同，產(chǎn)生的拮抗活性物質類型不同，其作用機理也有所差異[20]，作用機理的研究對建立田間使用技術十分關鍵。以往研究表明貝萊斯芽胞桿菌的抑菌機理為致使病原菌菌絲畸形和降低孢子萌發(fā)率[21-24]，相比之下本研究菌株SM905在機理上有兩個不同點。SM905僅抑制膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)后新菌絲的生長，對孢子萌發(fā)率本身沒有顯著影響；SM905發(fā)酵上清液 20倍稀釋液能抑制膠孢炭疽菌氣生菌絲的生長，使其膨大畸形、空洞，甚至斷裂，但同時也發(fā)現(xiàn)其能誘導病原菌基部菌絲在3 d內產(chǎn)生大量分生孢子，而對照組菌絲培養(yǎng)10 d后才開始形成明顯的分生孢子堆，說明SM905發(fā)酵產(chǎn)生的活性物質脅迫了病原菌菌絲的生長，加速其老化產(chǎn)孢。分生孢子可以在不良環(huán)境中休眠，如條件合適，則繼續(xù)萌發(fā)生長，侵染植物。因此在實際應用中應選擇發(fā)病初期施藥，同時保證足夠的藥劑濃度，或者通過重復施藥，以達到徹底殺滅病原菌菌絲的目的，這一點與盆栽試驗結果吻合。SM905粉劑100倍液施用2次效果優(yōu)于1次。在后續(xù)的研究中，我們將進一步開展SM905的發(fā)酵工藝研究、活性物質的分離鑒定以及田間應用技術研究，希望能為鐵皮石斛的安全生產(chǎn)提供一種新型高效的生防制劑。