西達本胺通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT-15細胞凋亡

趙琳珊，李玉苗，李楠，賈友超,王曉芳，韓強，臧愛民

(1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,河北省腫瘤放化療機制與規(guī)程研究 重點實驗室，河北 保定 071000；2.河北大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000)

結(jié)腸癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，早期結(jié)腸癌患者采取手術(shù)為主的綜合治療，部分患者可以治愈[1]. 隨著靶向治療和免疫治療的進展，晚期結(jié)腸癌患者生存期逐漸延長，但治愈希望仍然渺茫，難以控制的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是目前臨床治療所面臨的難題，因此需要從不同角度進一步探索結(jié)腸癌生物學(xué)治療的手段.表觀遺傳修飾的改變在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及耐藥過程中發(fā)揮重要作用，其中組蛋白乙?；c腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān).組蛋白乙酰化修飾由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDAC)協(xié)調(diào)進行.在腫瘤細胞中，HDAC的過度表達增強了組蛋白去乙酰化作用，DNA與組蛋白結(jié)合緊密，不利于抑癌基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致基因“沉默”.由組蛋白乙?；揎椀母淖円鸬漠惓；虮磉_水平可以使用表觀遺傳藥物HDAC抑制劑調(diào)節(jié)或逆轉(zhuǎn)[2].

西達本胺(Chidamide)化學(xué)名是N-(2-氨基-4-氟苯基)-4-{N-[(E)-3-(3-吡啶)丙烯?；鵠氨甲基}苯甲酰胺，是一種口服的組蛋白去乙?；敢种苿?，通過選擇性抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC10[3]，調(diào)節(jié)染色體上的組蛋白和非組蛋白乙?；剑M一步調(diào)控基因的表達，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，阻滯細胞周期.西達本胺在外周T細胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤臨床試驗中顯示出較好的治療效果[4-7],但在實體瘤治療方面的價值仍不確定.本文旨在研究西達本胺對結(jié)腸癌細胞HCT-15的細胞凋亡和細胞周期的影響，并初步探討其作用機制，為結(jié)腸癌治療提供新的思路.

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養(yǎng)條件

人結(jié)腸癌細胞系HCT-15細胞株由南方科技大學(xué)饋贈.將含有10%(體積分數(shù))胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基置于溫度為37 ℃，在體積分數(shù)5% CO2且相對濕度為90%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，傳2-3代后取對數(shù)生長期細胞用于實驗.

1.2 藥物和主要試劑

西達本胺由深圳微芯科技公司饋贈，使用二甲基亞砜(DMSO)進行溶解，配制儲備液濃度為40 mmol/L，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?Histone H3、Histone H4、Acetyl-Histone H3、Acetyl-Histone H4、Bcl-2、Bax、Caspase 3、Cleaved Caspase 3、Caspase 9、Cleaved Caspase 9、PARP、Cleaved PARP、Cytc、γH2AX、p21、p27、CDK2、CyclinA2抗體均購自cell signaling公司;CCK-8試劑盒購自MedChemExpress公司;FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒購自BD生物公司;EdU細胞增殖檢測試劑盒購自銳博生物公司.

1.3 CCK-8實驗檢測細胞活力

將對數(shù)生長期HCT-15細胞每孔100 μL(4×103/孔)接種于96孔板，24 h后按不同濃度梯度(64、32、16、8、4、2、1 μmol/L)加入西達本胺含藥培養(yǎng)基，每組均設(shè)置了RPMI-1640培養(yǎng)基空白對照組和DMSO陰性對照組,并同時設(shè)置6個復(fù)孔.待培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后,避光加入CCK-8溶液10 μL，孵育4 h后,酶標(biāo)儀檢測波長450 nm光密度值(OD值)，進行3次獨立重復(fù)實驗.計算抑制率，抑制率=(OD加藥組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組).

1.4 細胞形態(tài)學(xué)觀察

消化對數(shù)生長期HCT-15細胞每孔2.5 mL(5×105/孔)接種于6孔板，24 h后分別加入終濃度1.272、2.815、10.943 μmol/L的西達本胺含藥培養(yǎng)基，并設(shè)置DMSO陰性對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48、72 h后于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并拍照.

1.5 克隆形成實驗

取經(jīng)不同濃度西達本胺處理48 h后的HCT-15細胞，消化后按500/孔接種于6孔板，十字形晃動使細胞分散均勻，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，10 d后出現(xiàn)大于50個細胞肉眼可見的克隆集落且克隆之間不發(fā)生融合終止培養(yǎng).棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2～3次，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛固定20 min后，使用質(zhì)量分量1%的結(jié)晶紫染液染色15 min，洗去多余染色劑放置室溫干燥，待水漬消失后掃描拍照.

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

消化對數(shù)生長期HCT-15細胞，5×105/孔，每孔2.5 mL接種于6孔板，24 h后分別加入終濃度2.815、10.943 μmol/L的含藥培養(yǎng)基，并設(shè)置DMSO陰性對照組.繼續(xù)培養(yǎng)48 h后使用Annexin V-FITC/PI雙染法對細胞進行處理染色；避光、室溫(25 ℃)孵育15 min后，上機檢測.

1.7 EdU細胞增殖實驗

消化對數(shù)生長期HCT-15細胞，5×105/孔，每孔2.5 mL接種于6孔板，24 h后分別加入終濃度0.612、1.272、2.815、10.943 μmol/L的含藥培養(yǎng)基.每組均設(shè)置DMSO對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進行EdU標(biāo)記.制備25 μmol/L的EdU工作液，加入6孔板孵育2 h，PBS清洗后加入質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛使細胞固定，室溫孵育30 min，棄固定液后加入甘氨酸溶液，搖床孵育5 min以去除多余的固定液.清洗后加入滲透劑室溫孵育10 min.再次清洗后加入Apollo染色液，避光搖床孵育30 min.滲透劑清洗之后加入Hoechst染色液進行細胞核染色，避光搖床孵育30 min.PBS清洗2次洗去多余染色液，使用熒光倒置顯微鏡在鏡下觀察并拍照.

1.8 蛋白免疫印跡實驗檢測細胞凋亡途徑

收集經(jīng)不同濃度(1.272、2.815、10.943 μmol/L)西達本胺處理48 h后的HCT-15細胞蛋白.每個樣品取30 μg蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，上層濃縮膠用60 V電壓，分離膠電壓調(diào)至100 V.將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，恒壓90 V轉(zhuǎn)膜1.5 h.質(zhì)量分量5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗膜3次，每次10 min.一抗采用1∶1 000體積比稀釋, 4 ℃孵育過夜，二抗采用1∶2 000體積比稀釋,室溫下孵育1 h.加入1∶1(體積比)配制的ECL化學(xué)發(fā)光A液、B液顯色3 min，使用化學(xué)發(fā)光儀顯影拍照.

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件、GraphPad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析及作圖，所有實驗均進行3次獨立重復(fù)實驗.(SPSS軟件計算72 h的 IC10、IC20、IC50值分別為1.272、2.815、10.943 μmol/L).采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗方法分析組間差異，P<0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 西達本胺抑制HCT-15細胞的增殖

CCK-8法檢測西達本胺對HCT-15細胞增殖的抑制作用，結(jié)果顯示，HCT-15細胞經(jīng)不同濃度藥物處理24、48、72、96、120 h后，能夠明顯抑制細胞增殖，相同濃度不同時段對比，隨著時間延長抑制率明顯增高，有明顯的時間依賴性，P<0.000 1(圖1a)；相同時間不同濃度對比，隨著加藥濃度的增加抑制率明顯增高，當(dāng)藥物濃度為4 μmol/L時，抑制率出現(xiàn)明顯的濃度依賴性，P<0.000 1(圖1b).上述結(jié)果表明隨著藥物濃度的增加和時間的延長，西達本胺抑制HCT-15細胞的增殖且呈一定的時間和濃度依賴性.

a.相同濃度不同時段的抑制率;b.同時段不同濃度的抑制率.(與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1).圖1 西達本胺對HCT-15細胞的增殖抑制呈濃度-時間依賴性Fig.1 Concentration-dependent effect of Chidamide on HCT-15 cell proliferation

2.2 西達本胺影響HCT-15細胞形態(tài)及克隆形成能力

細胞經(jīng)不同濃度藥物處理后形態(tài)發(fā)生變化(圖2a)，隨著藥物濃度及作用時間的增加，細胞形態(tài)變?yōu)殚L梭形，觸角增多，細胞內(nèi)顆粒物增多，并且可見空泡；同時相鄰細胞之間連接疏松，細胞膜折光度下降，細胞數(shù)量也隨之減少.平板克隆的結(jié)果顯示，隨著加藥濃度的增加克隆集落數(shù)減少，且單個集落體積逐漸減小(圖2b).平板克隆結(jié)晶紫染色結(jié)果同樣印證了上述結(jié)果，集落數(shù)明顯減少(圖2c).由此可見，西達本胺顯著影響了結(jié)腸癌HCT-15細胞的生物學(xué)形態(tài)和克隆形成能力.

a.不同濃度西達本胺作用于HCT-15細胞48 h和72 h后的細胞形態(tài)變化; b.平板克隆形成實驗第10的集落形成情況; c.平板克隆形成實驗結(jié)晶紫染色.圖2 西達本胺抑制細胞增殖的形態(tài)學(xué)變化Fig.2 Chidamide inhibits morphological changes of cell proliferation

2.3 西達本胺誘導(dǎo)HCT-15細胞凋亡并阻滯細胞周期

流式細胞術(shù)檢測到明顯的細胞凋亡，隨著加藥濃度的升高，細胞凋亡數(shù)量增多，早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞的數(shù)量都隨之上升(圖3a).測得實驗組凋亡率分別為12.32%±0.84%(P<0.05)、15.63%±0.91%(P<0.001)，與對照組相比，有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3b).與此同時通過EdU實驗檢測其細胞周期的變化(圖3c)，隨著加藥濃度的增高，Hoechst藍色熒光染色細胞數(shù)目減少，即活細胞數(shù)減少，藥物對細胞殺傷作用顯著；EdU綠色熒光染色細胞數(shù)減少，即進入DNA復(fù)制期的細胞數(shù)量減少.表明西達本胺可以明顯促進HCT-15細胞凋亡、抑制其增殖且阻滯細胞周期.

a.流式細胞術(shù)檢測HCT-15細胞凋亡;b.凋亡率與對照組相比具有顯著性差異(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；c.EdU檢測HCT-15細胞周期阻滯.圖3 西達本胺對細胞凋亡和周期的影響Fig.3 Effects of chidamide on apoptosis and cell cycle

2.4 西達本胺通過線粒體凋亡機制介導(dǎo)細胞凋亡

Western blot 結(jié)果顯示，隨著加藥濃度增大，乙?；M蛋白Acetyl-Histone H3、Acetyl-Histone H4表達上調(diào)(圖4a).由線粒體介導(dǎo)的Caspase信號通路相關(guān)蛋白Bcl-2表達下調(diào)，Bax、Cytc、Cleaved Caspase 9、Cleaved Caspase 3、Cleaved PARP表達上調(diào).DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物γH2AX表達上調(diào)(圖4b).細胞周期相關(guān)蛋白p21、p27表達上調(diào)，CDK2、CyclinA2蛋白的表達水平下調(diào)(圖4c).

圖4 西達本胺對乙?；M蛋白、線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白、周期蛋白表達的影響Fig.4 Effects of Chidamide on expression of acetylated histones，mitochondrial apoptosis pathway related proteins and cyclins

3 討論

結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展與原癌基因的活化和抑癌基因的失活緊密相關(guān).組蛋白的乙?；欣贒NA和組蛋白八聚體的解離，核小體結(jié)構(gòu)變得松弛，使得原本無法和啟動子接觸的區(qū)域成為新的轉(zhuǎn)錄靶點，各種轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄過程[8].西達本胺是一種新型的組蛋白去乙酰化酶抑制劑，通過抑制組蛋白去乙?；傅幕钚裕岣呓M蛋白的乙?；剑龠M抑癌基因的表達，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡.本研究發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的升高，HCT-15結(jié)腸癌細胞凋亡增多，細胞體外克隆形成能力減弱，初步證實了西達本胺對結(jié)腸癌HCT-15細胞系的抑制作用.而后筆者檢測了經(jīng)不同濃度西達本胺處理后的組蛋白的乙?；剑Y(jié)果顯示隨著加藥濃度增加Acetyl Histone 3、Acetyl Histone 4表達水平逐漸增高，證實了西達本胺可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞系組蛋白乙?；皆龈?

進一步探討了西達本胺處理后結(jié)腸癌HCT-15細胞系的具體凋亡途徑.細胞發(fā)生凋亡的主要途徑有兩種，即內(nèi)源性凋亡途徑和外源性凋亡途徑.內(nèi)源性凋亡途徑主要由線粒體介導(dǎo).以往研究表明，西達本胺可以通過激活線粒體凋亡途徑來誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[9-10].西達本胺通過Caspase依賴的凋亡途徑抑制AML細胞增殖，阻斷G1/S期轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)細胞凋亡[11].西達本胺下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xL和Bcl-2，激活促凋亡蛋白Bax，在p53信號的調(diào)控下，Cytc從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體，與線粒體膜結(jié)合釋放Cytc，在dATP的作用下，Cytc釋放到細胞質(zhì)內(nèi)，與凋亡蛋白酶激活因子1(APAF-1)結(jié)合形成聚合物，與Caspase 9前體結(jié)合形成凋亡體，Caspase 9被激活.Caspase 9激活了該通路下游的一系列Caspase成員，包括Caspase 7和Caspase 3，進一步誘導(dǎo)特定的凋亡底物和細胞凋亡[12-13].此外，西達本胺還具有誘導(dǎo)DNA損傷的作用[14].為了驗證以上結(jié)論，本研究檢測了由線粒體介導(dǎo)的Caspase信號通路相關(guān)蛋白的表達量變化，結(jié)果顯示抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)，Bax、Cytc、Cleaved Caspase 9、Cleaved Caspase 3、Cleaved PARP表達上調(diào)，隨著藥物濃度的增加，γH2AX表達量上升.這說明西達本胺可能通過上調(diào)組蛋白乙?；?，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松，從而引起細胞的DNA雙鏈損傷并激活內(nèi)源性凋亡途徑促進腫瘤細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用.細胞周期的調(diào)控主要與Cyclin、CDK以及CDKI有關(guān).Cyclin與CDK形成復(fù)合物促進細胞周期進展，而CDKI的作用則相反.p21是CDKI的成員，可抑制CDK活性，阻滯細胞周期.在結(jié)腸癌中，西達本胺調(diào)控p21、CDK4、p53表達水平，阻滯細胞于G0/G1期[15].在淋巴瘤中，西達本胺調(diào)控p21、CyclinE表達水平，阻滯細胞周期于G0/G1期[16].本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)西達本胺處理結(jié)腸癌細胞HCT-15后，p21表達上調(diào)，而CDK2、CyclinA2蛋白的表達下調(diào)，EdU實驗檢測細胞總周期變慢.結(jié)果提示西達本胺可能通過上調(diào)p21的表達并抑制周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物Cyclin-CDK-CDKI的活性達到阻滯細胞周期的效果.

乙?；{(diào)控異常是多種腫瘤的共同生物學(xué)特征之一，西達本胺在淋巴瘤、乳腺癌均獲批適應(yīng)證，應(yīng)用前景廣闊，需要我們在其他類型腫瘤對其進行更深入的探索.本研究驗證了西達本胺在結(jié)腸癌細胞系HCT-15發(fā)揮作用的主要機制，探討了造成該細胞系凋亡的具體途徑，但是藥物造成DNA損傷的具體機制尚未明確，需要在后續(xù)的工作中繼續(xù)研究.