人表皮生長因子受體2與晚期食管鱗癌患者含鉑類藥物化療預后的相關(guān)性

梁 立，劉艷春，孟立寧，楊 曼，陳宏洋，韓愛勇，岳燕軍

食管癌是源于食管黏膜上皮的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均較高，分別居于惡性腫瘤的第6位和第4位；食管癌病理類型具有顯著的地域特征，歐美國家以食管腺癌為主，而亞洲國家食管鱗癌發(fā)病率更高[1]。食管癌常見治療手段有放療、化療、外科手術(shù)等，外科手術(shù)是臨床治療早、中期及局部晚期食管癌的主要手段，可有效提高患者生存率，但大部分食管癌患者就診時已發(fā)展至晚期，且伴有區(qū)域或全身淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，手術(shù)已無法達到理想治療效果，或患者無法耐受手術(shù)治療，此時，臨床多采用化療的方式對患者進行治療[2-3]。含鉑類藥物的聯(lián)合化療是目前治療食管癌最常用的方案，但患者經(jīng)鉑類藥物化療后整體5年生存率仍不足20%[4]。因此，尋找可以預測晚期食管癌鉑類藥物化療預后的分子標志物，并根據(jù)其特點制定新的治療方案，對改善患者預后具有重要臨床意義。人表皮生長因子受體2(HER2)是一種磷酸化受體蛋白，在腫瘤細胞中表達較高，可調(diào)控腫瘤細胞的增殖、分化和浸潤轉(zhuǎn)移，影響癌癥患者預后[5-6]。本研究探討腫瘤組織HER2蛋白表達及基因擴增與食管鱗癌患者含鉑類藥物化療預后的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2018年6月—2019年6月張家口市第一醫(yī)院采用含鉑類藥物化療的晚期食管鱗癌100例的臨床資料，根據(jù)患者隨訪2年預后情況分為預后良好組53例和預后不良組47例。納入標準：①均符合食管癌診斷標準[7]，且經(jīng)內(nèi)鏡及病理組織學檢查確診為晚期食管鱗癌；②均失去手術(shù)治療指征；③一線化療均接受含鉑類藥物的方案；④存在可評價的腫瘤病灶；⑤預計生存時間≥3個月；⑥臨床資料完整者。排除標準：①合并其他臟器轉(zhuǎn)移者；②合并嚴重心、肝、肺、腎損傷者；③合并嚴重感染者；④合并其他惡性腫瘤者。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1化療方案：所有患者接受含鉑類藥物的化療方案[7]，包括順鉑、奧沙利鉑、卡鉑及奈達鉑，與含鉑類藥物聯(lián)合化療藥物包括5-氟尿嘧啶、長春瑞濱、長春地辛、多西他賽、紫杉醇、博來霉素、吉西他濱。

1.2.2預后標準：以患者隨訪2年的生存情況作為預后評估標準，將腫瘤相關(guān)死亡患者納入預后不良組，生存患者納入預后良好組。

1.2.3資料收集：通過病歷系統(tǒng)收集兩組入院時性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、血紅蛋白、白蛋白等各項臨床資料。

1.2.4儀器和方法：取患者空腹血液5 ml，希森美康XN-3000血液分析儀及配套試劑盒測定血紅蛋白、白蛋白水平；取患者入院活組織病理檢查時的組織標本，采用熒光原位雜交技術(shù)檢測HER2/neu基因擴增情況，采用免疫組織化學法檢測HER2蛋白表達；DNA熒光原位雜交探針、熒光原位雜交TM試劑盒均購自北京金菩嘉生物技術(shù)有限公司；即用型C-erB-2兔抗人單克隆抗體、免疫組織化學Envision plus廣譜試劑盒、PBS、枸櫞酸鹽緩沖液均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.5熒光原位雜交技術(shù)檢測[8]：①采用HER2 DNA熒光原位雜交探針標記紅色熒光，設對照探針標記綠色熒光。a.石蠟切片：在溫度為65 ℃下烤片過夜，標本脫蠟至水，50 ℃條件下用酸性亞硫酸鈉(濃度為30%)處理切片，時間為20～30 min，并用2×枸櫞酸鹽緩沖液漂洗2次，每次5 min；37 ℃條件下在蛋白酶K溶液中孵育20～30 min，2×枸櫞酸鹽緩沖液漂洗2次，每次5 min，室溫下在0.1 mmol/L HCl中浸泡5～10 min，再次用2×枸櫞酸鹽緩沖液漂洗2次，每次5 min；b.脫水：玻片依次在-20 ℃預冷的濃度為70%、85%、100%乙醇中各脫水2 min，后置于室溫下浸入丙酮溶液中2 min，取出后使玻片自然干燥。②熒光原位雜交技術(shù)：a.脫水：于73 ℃條件下在濃度為70%的甲酚胺變性液中浸泡5 min，后依次在預冷的濃度為70%、85%、100%乙醇中各脫水3 min；b.雜交：將10 μl探針混合液滴入玻片組織中，蓋片，以橡膠封片，于73 ℃條件下進行變性，時間為5 min，后在42 ℃條件下雜交過夜；c.洗滌：于73 ℃條件下在2×枸櫞酸鹽緩沖液/0.3% NP溶液洗脫液中洗滌，時間為3 min，再于室溫下洗滌5 s，干燥；將15 μl DAPI復染劑滴加于雜交區(qū)域，蓋片，置于暗處10～20 min，熒光顯微鏡下觀察。③結(jié)果判定：以橘紅色HER2/neu基因熒光信號和綠色熒光信號數(shù)目比值作為判讀標準，共計數(shù)30個細胞，當紅色熒光信號/綠色熒光信號比值<1.8為基因無擴增，記為陰性；當比值>2.2或眾多紅色熒光信號連接成簇或團為基因擴增，記為陽性；比值位于1.8～2.2之間時增加計數(shù)細胞至100個后再次進行判斷。

1.2.6免疫組織化學檢測[8]：石蠟切片并于65 ℃條件下烤片，脫蠟至水，用pH值7.4的PBS沖洗3次，每次3 min，枸櫞酸鹽緩沖液(pH值6.0)加熱修復10 min，用PBS沖洗2次，每次3 min；用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，滴加聚合物增強劑于室溫下孵育20 min，用PBS沖洗3次，每次3 min；滴加酶標抗鼠/兔聚合物試劑，室溫下孵育30 min，用PBS沖洗5次，每次3 min；滴加DAB液，顯微鏡下觀察6 min，蘇木精復染，用0.1% HCl分化，沖洗，藍化，乙醇脫水干燥，二甲苯透明，樹膠封固，晾干觀察。結(jié)果判定：HER2蛋白陽性位于細胞膜，呈棕褐色，無反應或腫瘤細胞膜染色<10%為“-”；細胞膜不完整染色≥10%為“+”；較弱的完整細胞膜染色≥10%為“++”；較強的完整細胞膜染色>10%為“+++”；其中“-”和“+”為無表達，記為陰性，“++”和“+++”為過表達，記為陽性。

2 結(jié)果

2.1兩組基線資料比較 兩組性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、TNM分期、分化程度及血紅蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。預后良好組浸潤深度為T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、白蛋白≤35 g/L、HER2蛋白表達陽性及HER2/neu基因擴增陽性患者占比顯著低于預后不良組(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.2影響晚期食管鱗癌患者含鉑類藥物化療預后不良的因素 將上述單因素分析中比較差異有統(tǒng)計學意義的相關(guān)因素納入多因素Logistic回歸分析，行量化賦值，因變量為是否發(fā)生不良預后(是=1，否=0)，自變量為浸潤深度(T4=1，T3=0)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(是=1，否=0)、白蛋白(≤35 g/L=1，>35 g/L=0)、HER2蛋白表達(陽性=1，陰性=0)、HER2/neu基因擴增(陽性=1，陰性=0)。分析結(jié)果顯示，浸潤深度為T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、白蛋白≤35 g/L、HER2蛋白表達陽性及HER2/neu基因擴增陽性是晚期食管鱗癌患者含鉑類藥物化療預后不良的獨立危險因素(P<0.01)。見表2。

表2 影響晚期食管鱗癌患者含鉑類藥物化療預后不良的多因素Logistic回歸分析

3 討論

HER2是一種原癌基因的表達產(chǎn)物，其表達上調(diào)可引起細胞過度增殖從而促使細胞向惡性轉(zhuǎn)化，HER2水平在結(jié)直腸癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等腫瘤組織細胞中均呈高表達，基于HER2的分子靶向治療已成為上述惡性腫瘤綜合治療方案的重要組成部分[9-10]。既往研究顯示，HER2在食管腺癌患者中的表達及病理機制相關(guān)研究較多[11]，但我國食管癌病理組織學類型以鱗狀細胞癌為主，而目前關(guān)于HER2對食管鱗癌的影響機制尚需進一步探討。

本研究發(fā)現(xiàn)，預后良好組浸潤深度為T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、白蛋白≤35 g/L、HER2蛋白表達陽性及HER2/neu基因擴增陽性患者占比顯著低于預后不良組。提示上述因素可能是導致晚期食管鱗癌患者含鉑類藥物化療預后不良的危險因素。其原因為腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響食管鱗癌患者生存情況的獨立影響因素，在多項研究中均已被證實[12-14]。白蛋白是評估患者營養(yǎng)狀態(tài)的重要指標，晚期食管癌患者存在吞咽困難的癥狀，營養(yǎng)物質(zhì)攝入不足，同時機體能量消耗增加，常因營養(yǎng)不良引起免疫功能下降，此時患者腸黏膜屏障破壞、感染等嚴重并發(fā)癥發(fā)生風險也會明顯上升，進而引發(fā)不良預后[15]。

HER2/neu基因是一種受體酪氨酸激酶類原癌基因，屬于表皮生長因子受體家族，其位于人染色體17q21，分子量約為185×103kD，在正常組織中有微弱的表達，但無HER2/neu基因擴增[16]。HER2受體細胞內(nèi)區(qū)具有活化的酪氨酸蛋白激酶，自身也存在若干酪氨酸殘基磷酸化位點，其可與特異性生長因子結(jié)合誘導二聚體化并促使受體交叉磷酸化，磷酸化的受體可將細胞外的生長信號傳導至細胞核內(nèi)，控制細胞分裂相關(guān)基因的表達[17]。HER2/neu基因擴增可促使轉(zhuǎn)錄上調(diào)，使HER2蛋白合成量增加，參與腫瘤細胞增殖、分裂、凋亡，并上調(diào)血管通透性因子及內(nèi)皮生長因子表達，進而破壞抗體抑制侵襲的保護屏障，并促使腫瘤組織新生血管生成，使腫瘤細胞侵襲性增強[18]。HER2/neu基因擴增產(chǎn)物可通過不同信號傳導通路使細胞異常增殖并向惡性轉(zhuǎn)化，HER2蛋白表達上升又在細胞增殖、分裂、轉(zhuǎn)化、侵襲、黏附中發(fā)揮重要作用[19-20]。因此，HER2蛋白表達陽性和HER2/neu基因擴增陽性常表明腫瘤惡性程度高，侵襲、轉(zhuǎn)移能力強，此類患者腫瘤轉(zhuǎn)移及復發(fā)早，預后較差。

經(jīng)多因素Logistic回歸分析證實，浸潤深度為T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、白蛋白≤35 g/L、HER2蛋白表達陽性及HER2/neu基因擴增陽性是晚期食管鱗癌患者含鉑類藥物化療預后不良的獨立危險因素。因此，對晚期食管鱗癌患者采用含鉑類藥物化療時應對上述因素予以干預，以提高患者生存率。

綜上所述，HER2蛋白表達陽性、HER2基因擴增陽性與晚期食管鱗癌患者含鉑類藥物化療預后具有明顯相關(guān)性，可為臨床制定基于HER2的分子靶向治療方案提供理論依據(jù)。