HPV16感染與宮頸鱗癌的相關(guān)性及對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)的影響

張秀娟 郭東雅 賈玖麗 馬松雅 李 紅 劉姍姍

近年來(lái)我國(guó)宮頸癌發(fā)病呈上升趨勢(shì)，每年約50萬(wàn)新發(fā)病例，其中宮頸鱗癌(SCC)是宮頸癌主要類型，可占宮頸癌總數(shù)的70%以上[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌發(fā)生與人乳頭瘤病毒16(HPV16)的持續(xù)感染密切相關(guān)，而癌癥發(fā)生是多種因素綜合作用的結(jié)果，因此HPV16感染的普通宮頸細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞需要疊加因素，如多種相關(guān)信號(hào)通路的激活[2]?；诖?，有學(xué)者提出了宮頸癌發(fā)展的階梯式致癌學(xué)說(shuō)[3]。Wnt/β-catenin是一種在惡性腫瘤中異常激活的經(jīng)典信號(hào)通路，且在各種類型腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起促癌作用。目前關(guān)于HPV16感染對(duì)Wnt/β-catenin通路表達(dá)的影響機(jī)制尚不明確，本次通過(guò)分析不同宮頸組織HPV16感染情況及Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)情況，進(jìn)一步研究HPV16及Wnt信號(hào)通路在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2017年6月到2021年6月我院因手術(shù)切除獲得的106例SCC組織(其中FIGO分期[4]中Ⅰ期57例，Ⅱ期49例；分化程度：低分化21例，中分化39例，高分化46例；淺層浸潤(rùn)44例，深層浸潤(rùn)62例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例)、76例宮頸上皮瘤變組織(其中 CINⅠ29例，CINⅡ20例，CINⅢ27例)和54例正常宮頸組織(子宮肌瘤患者行全子宮切除術(shù)獲得)，所有患者經(jīng)病理檢測(cè)確診，標(biāo)本采集前未接受過(guò)放化療或其他抗腫瘤藥物治療，且患者不存在其他腫瘤。

1.2 方法

收集SCC患者臨床資料，包括年齡、FIGO分期、分化程度、浸潤(rùn)深度、是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，采用熒光定量PCR及免疫組化法檢測(cè)各組HPV16感染及宮頸組織中Wnt-3a、β-catenin蛋白表達(dá)情況，分析不同宮頸組織中HPV16感染率及Wnt-3a、β-catenin蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況。將SCC患者按照不同臨床病理情況進(jìn)行分類，分析不同臨床病理患者HPV16感染率及Wnt-3a、β-catenin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異，采用Pearson檢驗(yàn)分析HPV16感染與臨床病理及Wnt-3a、β-catenin蛋白表達(dá)相關(guān)性。

1.2.1 HPV感染檢測(cè)方法 將石蠟包裹的宮頸組織置于離心管，加入二甲苯震蕩，以12000 r/min(半徑8.7 cm)離心5 min，取沉淀加入無(wú)水乙醇震蕩，同上再次離心，再次取沉淀在勻漿器中研磨，提取組織中DNA，以提取的DNA為模板采用PCR儀(美國(guó)Eppendrof公司)擴(kuò)增HPV16的E6基因。當(dāng)溶液中有模板時(shí)，可檢測(cè)到探針5'段熒光基團(tuán)發(fā)出的信號(hào)，并以此作為感染陽(yáng)性。循環(huán)條件：94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 35 s，共30 cycles，72℃ 10 min，1個(gè)cycle。引物序列：上游5'-CCACCCAGAAAGTTACCACA-3'，下 游 5'-TGCAACAAGACATACATCGA-3'。

1.2.2 Wnt-3a、β-catenin蛋白表達(dá)檢測(cè)方法 將病理組織加入二甲苯脫蠟，在蔗糖溶液中過(guò)夜，取出加入PBS清洗，隨后加入過(guò)氧化氫甲醇處理30 min，再次PBS清洗，吸去多余洗液，滴加Wnt-3a、β-catenin免抗人單克隆抗體，4℃過(guò)夜，取出后PBS清洗然后滴加二抗，室溫下孵育30 min，PBS清洗，DAB顯色，隨后加入蘇木精復(fù)染，中性膠封片，并設(shè)置PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。判定方式：在顯微鏡400倍放大下選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野中選擇100個(gè)細(xì)胞，以細(xì)胞中出現(xiàn)黃色、棕黃色為陽(yáng)性。以陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞比例計(jì)分：<2%為0分；≥2%～20%為1分；>20%～50%為2分；>50%為3分。染色深度計(jì)分：0分無(wú)著色；1分淺著色；2分深著色。兩者相乘為最終表達(dá)水平計(jì)分，以3分及以上為陽(yáng)性表達(dá)。所有片子均由我院2位病理科醫(yī)師采用雙盲法判讀。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 各組HPV16感染及宮頸組織中Wnt-3a、β-catenin蛋白表達(dá)情況

Wnt-3a蛋白在各宮頸組織中均表達(dá)在胞質(zhì)；而β-catenin蛋白在正常宮頸組織中表達(dá)在細(xì)胞膜，在CIN組織和SCC組織中主要表達(dá)在胞質(zhì)和胞核。HPV16感染率、Wnt-3a、β-catenin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在各組中比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表1。

表1 各組HPV16感染及宮頸組織中Wnt-3a、β-catenin蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況(例，%)

2.2 不同臨床特征SCC組織中HPV16感染情況

FIGO分期Ⅱ期、中低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者HPV16感染率分別高于FIGO分期Ⅰ期、高分化、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)，見表2。

表2 不同臨床特征SCC組織中HPV16感染情況/例

2.3 不同臨床特征SCC組織中Wnt-3a、β-catenin蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況

FIGO分期Ⅱ期、中低分化患者Wnt-3a、β-catenin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別高于FIGO分期Ⅰ期、高分化患者(P<0.05)，見表3。

表3 不同臨床特征SCC組織中Wnt-3a、β-catenin蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況/例

2.4 HPV16感染與宮頸癌臨床病理及Wnt-3a、β-catenin蛋白表達(dá)的關(guān)系

Pearson相關(guān)性分析顯示，HPV16感染與宮頸鱗癌分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Wnt-3a、β-catenin表達(dá)呈正相關(guān)(γ>0，P<0.05)，見表4。Wnt-3a、β-catenin與宮頸鱗癌分化程度、FIGO分期與呈正相關(guān)(γ=0.326、0.413，γ=0.288、0.335，P均<0.001)。

表4 HPV16感染與宮頸癌臨床病理及Wnt-3a、β-catenin蛋白表達(dá)關(guān)系

3 討論

SCC的發(fā)生是一個(gè)連續(xù)漫長(zhǎng)的過(guò)程，是婦女惡性腫瘤中僅次于乳腺癌的惡性腫瘤，多項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查已經(jīng)證實(shí)其與HPV感染的密切關(guān)系[5]。HPV種類眾多，目前已知的高達(dá)100多種，其中超過(guò)30種與宮頸細(xì)胞感染有關(guān)。HPV16是一種高危型HPV，已有研究發(fā)現(xiàn)HPV16的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的重要因素[6]。本次研究檢測(cè)了正常宮頸組織、CIN組織及SCC組織中HPV16感染情況，發(fā)現(xiàn)隨病變程度增加HPV16感染率也隨之升高，驗(yàn)證了HPV16感染是SCC發(fā)生的重要致病因素。本次研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IGO分期Ⅱ期、中低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者HPV16感染率分別高于FIGO分期Ⅰ期、高分化、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者，提示HPV16感染可能參與了SCC發(fā)生發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程。還有研究發(fā)現(xiàn)，SCC發(fā)病往往起始于包括HPV16在內(nèi)的HPV感染，但卻不是充分因素[7]。也有報(bào)道顯示，宮頸癌發(fā)病率遠(yuǎn)低于HPV感染率，提示只有部分HPV感染患者才會(huì)發(fā)展為宮頸癌[8]。相關(guān)研究認(rèn)為，HPV感染可能是SCC的一種內(nèi)源性因素，其可引發(fā)機(jī)體中癌基因異常激活、免疫調(diào)節(jié)紊亂和抑癌基因失活等一系列變化，造成細(xì)胞癌變和癌組織的形成[9]。已有研究發(fā)現(xiàn)HPV早期基因區(qū)E6和E7基因是主要的致癌基因，可以影響多個(gè)腫瘤發(fā)生相關(guān)生物信號(hào)傳導(dǎo)通路，如Wnt/β-catenin[10]。探究SCC發(fā)生發(fā)展的分子層面機(jī)制對(duì)患者實(shí)施個(gè)性化診療和靶向阻斷治療具有重要價(jià)值。

Wnt信號(hào)通路目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在各種類型惡性腫瘤中起到促癌作用，被認(rèn)為是潛在的腫瘤標(biāo)志物，且能在一定程度上預(yù)測(cè)預(yù)后。有學(xué)者通過(guò)對(duì)比果蠅和小鼠致癌基因發(fā)現(xiàn)wg與int-1具有高度同源性，因此將wg和int-1統(tǒng)稱為wnt基因[11]。相關(guān)研究顯示，wnt蛋白能激活細(xì)胞中wnt信號(hào)通路，其中經(jīng)典通路為Wnt/β-catenin信號(hào)通路[12]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路目前已經(jīng)在多項(xiàng)研究中被證實(shí)參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，在此過(guò)程中，其上游信號(hào)激活和引發(fā)的β-catenin異常聚集是宮頸細(xì)胞發(fā)生癌變的關(guān)鍵過(guò)程[13-14]。本次通過(guò)免疫組織法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，從正常宮頸組織、CIN組織到SCC組織，Wnt-3a、β-catenin蛋白在胞質(zhì)中表達(dá)均呈上升趨勢(shì)。與正常宮頸組織相比，SCC組織中β-catenin在胞膜上表達(dá)明顯減少，提示W(wǎng)nt-3a、β-catenin蛋白表達(dá)與SCC的發(fā)生存在一定相關(guān)性。有學(xué)者采用RT-PCR檢測(cè)正常宮頸炎組織和宮頸癌組織中Wnt-3a、β-catenin蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨著病變程度的增加，兩者表達(dá)量逐漸增加[15]，同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)了Wnt/β-catenin信號(hào)通路在SCC發(fā)展中作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活后可引發(fā)宮頸癌細(xì)胞增殖過(guò)程由G1期向S期轉(zhuǎn)換，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥能力[16]。本次研究中FIGO分期Ⅱ期、中低分化患者Wnt-3a、β-catenin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別高于FIGO分期Ⅰ期、高分化患者，證實(shí)Wnt-3a、β-catenin蛋白表達(dá)與SCC臨床病理進(jìn)展相關(guān)。

HPV目前已經(jīng)證實(shí)與SCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17]，且HPV感染與宮頸鱗癌分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，證實(shí)其在SCC發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起到重要作用。本次研究還發(fā)現(xiàn)，HPV16感染率與Wnt-3a、β-catenin表達(dá)呈正相關(guān)，提示三者可能在SCC病變過(guò)程起協(xié)同作用。相關(guān)研究顯示，HPV16中的E6基因沉默能減少HPV16感染細(xì)胞中異位β-catenin表達(dá)，提示E6起到激活Wnt通路作用[18]。還有研究顯示，E6蛋白促進(jìn)Wnt/β-catenin通路激活，引發(fā)p53降解增加，導(dǎo)致了β-catenin的堆積和聚集[19-20]。因此Wnt通路激活可能是建立在HPV16感染上，并最終導(dǎo)致了SCC的發(fā)生。

綜上所述，SCC中HPV16感染率明顯偏高，且與SCC發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。HPV16感染、Wnt-3a、β-catenin蛋白表達(dá)可能在SCC發(fā)展過(guò)程中起到協(xié)同作用，可為SCC的臨床治療提供新的思路。