復(fù)方翅果油的毒理學(xué)初步研究

唐 慧，王 默，李 偉，張 靜，周 雯，程 東

(1.山東省疾病預(yù)防控制中心，濟(jì)南 250014； 2.山東省立醫(yī)院，濟(jì)南 250021；3.濟(jì)南市槐蔭區(qū)疾病預(yù)防控制中心，濟(jì)南 250022 )

翅果油樹是胡頹子科、胡頹子屬落葉直立喬木或灌木，距今已有200多萬年的歷史[1]，僅在晉、陜兩地小范圍內(nèi)零星分布，是我國獨(dú)有的珍稀優(yōu)良油料樹種，被稱作“植物國寶”。翅果油樹果實(shí)種仁含有豐富的油脂，翅果油中亞麻酸與亞油酸含量比約為1∶7[2]，接近母乳中這兩種成分的比例(約為1∶10)；翅果油中維生素E的含量較高，達(dá)0.98%；此外，翅果油中還含有少量的植物甾醇和黃酮類化合物[3-4]。研究表明，翅果油具有降脂減肥、抗疲勞、抗氧化及抗炎等作用[5-8]。2011年翅果油被批準(zhǔn)為新資源食品[9]，但產(chǎn)量少、規(guī)模小、成本高阻礙了對其廣泛深入地開發(fā)和利用，因此在過去的十年間，市面上翅果油及其相關(guān)產(chǎn)品屈指可數(shù)。我國葡萄種植面積居世界第二，作為葡萄酒工業(yè)副產(chǎn)品之一的葡萄籽油，其價(jià)格相對較低且生物活性多樣，在保健食品、醫(yī)藥和工業(yè)領(lǐng)域得到市場的高度認(rèn)可。翅果油中添加葡萄籽油，可在結(jié)合兩種優(yōu)良油脂多種功效的同時(shí)，有助于降低翅果油產(chǎn)品的成本，提高市場認(rèn)知度，對于擴(kuò)大翅果油植株種植面積，促進(jìn)當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)特色產(chǎn)業(yè)的形成具有重要的意義。

此前的研究多側(cè)重于翅果油單品的生物活性，未見其復(fù)方制劑被應(yīng)用于保健食品的報(bào)道。本研究對以翅果油、葡萄籽油為原料組方的復(fù)方翅果油進(jìn)行初步的安全性評價(jià)，為其長期食用提供毒理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

復(fù)方翅果油，為透明油狀液體，山西某公司提供，由翅果油和葡萄籽油組成，每100 g中含亞油酸42 g、亞麻酸2 g、維生素E 800 mg，人體推薦劑量為0.06 g/(kg·d)；花生油。

環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞公司；敵克松(Dexon)，美國Chemservice公司；2-氨基芴(2-AF)，美國Sigma-Aldich 公司；甲基磺酸甲酯(MMS)，德國Merck-Schuchand公司；1，8-二羥基蒽醌，比利時(shí)Acros Organics公司；肌酐試劑盒，上海復(fù)興長征公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、膽固醇、甘油三酯、葡萄糖、總蛋白、白蛋白試劑盒，北京利德曼公司。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級ICR小鼠及SD大鼠，北京華阜康生物科技股份有限公司。試驗(yàn)動(dòng)物均適應(yīng)3 d后方可開始試驗(yàn)。

1.1.3 試驗(yàn)菌株

鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100和TA102，上海寶錄公司。

1.1.4 主要儀器

Countermat Flash全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器，西班牙IUL公司；CD3700血細(xì)胞分析儀，美國Abbott公司；7180全自動(dòng)任選式生化分析儀，日本Hitachi公司；組織切片機(jī)，德國Leica公司；Sakura Tissue-Tek Prisma & Tissue-TekGlasg2染色封片機(jī)，日本櫻花公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 急性毒性試驗(yàn)

采用最大耐受劑量(MTD)法進(jìn)行試驗(yàn)。以食用花生油為溶劑，將復(fù)方翅果油配制成質(zhì)量濃度為0.5 g/mL的溶液。選用18～21 g ICR小鼠20只，雄、雌各半，分兩次灌胃復(fù)方翅果油溶液，每次灌胃量為0.02 mL/g，兩次間隔4 h，合并染毒劑量為20.0 g/kg。染毒后連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠體重、中毒及死亡情況。

1.2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

1.2.2.1 Ames試驗(yàn)(平板摻入法)

稱取5.0 g復(fù)方翅果油，經(jīng)0.055 MPa滅菌20 min，冷卻后以丙酮為溶劑配制成質(zhì)量濃度分別為50 000、10 000、2 000、400、80 μg/mL的溶液，待用。在加或不加代謝活化系統(tǒng)(S-9)的條件下，分別取0.1 mL不同質(zhì)量濃度受試物與測試菌株(TA97、TA98、TA100、TA102)增菌液混合，倒入底層培養(yǎng)基平板，對應(yīng)受試物劑量分別為5 000、1 000、200、40、8 μg/皿，另外設(shè)置自發(fā)回變組、溶劑對照組和陽性對照組，于37℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)回變菌落數(shù)。

1.2.2.2 骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

以食用花生油為溶劑，將復(fù)方翅果油配制成質(zhì)量濃度分別為0.125、0.250、0.500 g/mL的溶液。選用體重25～30 g ICR小鼠，10只/組，雄、雌各半，分兩次灌胃不同質(zhì)量濃度的復(fù)方翅果油溶液，灌胃量0.02 mL/g，兩次間隔24 h。末次染毒后6 h，處死小鼠，取胸骨骨髓制片。每張涂片鏡檢1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，計(jì)數(shù)出現(xiàn)微核的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算微核細(xì)胞率。記錄計(jì)數(shù)200個(gè)PCE的過程中觀察到的正染紅細(xì)胞(NCE)數(shù)量，計(jì)算PCE/NCE。另設(shè)溶劑對照組和環(huán)磷酰胺陽性對照組(劑量40 mg/kg)。

1.2.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

以食用花生油為溶劑，將復(fù)方翅果油配制成質(zhì)量濃度分別為0.125、0.250、0.500 g/mL的溶液。選用體重25～30 g雄性ICR小鼠，5只/組，連續(xù)5 d灌胃不同質(zhì)量濃度的復(fù)方翅果油溶液，灌胃量0.02 mL/g。灌胃后第35天處死小鼠，取兩側(cè)附睪制片。每張涂片計(jì)數(shù)1 000個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子，記錄畸變精子的類型及數(shù)量，計(jì)算精子畸變率。另設(shè)溶劑對照組和環(huán)磷酰胺陽性對照組(劑量40 mg/kg)。

1.2.3 亞急性毒性試驗(yàn)(30 d喂養(yǎng)試驗(yàn))

以食用花生油為溶劑，將復(fù)方翅果油配制成質(zhì)量濃度分別為0.019、0.038、0.075 g/mL的溶液。選用體重60～80 g雄、雌SD大鼠，10只/組，連續(xù)30 d灌胃不同質(zhì)量濃度的復(fù)方翅果油溶液，灌胃量0.08 mL/g。另外設(shè)置溶劑對照組。試驗(yàn)周期內(nèi)，觀察大鼠中毒表現(xiàn)及死亡情況。每周稱量大鼠體重和進(jìn)食量，計(jì)算每周食物利用率(每周增重/每周進(jìn)食量)及總食物利用率(總增重/總進(jìn)食量)。灌胃30 d后，大鼠空腹16 h，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，進(jìn)行血常規(guī)指標(biāo)和血生化指標(biāo)檢測；對大鼠進(jìn)行大體解剖觀察，取肝、脾、腎、睪丸等臟器稱量濕重，計(jì)算臟體比(臟器質(zhì)量/空腹體重)；對肝、脾、腎、睪丸/卵巢、胃、腸等臟器進(jìn)行固定后，制成組織切片進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)量資料使用SPSS軟件進(jìn)行均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算和方差分析或秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗(yàn)(MTD法)

試驗(yàn)期內(nèi)，試驗(yàn)動(dòng)物生長狀況良好，未見中毒表現(xiàn)和死亡，受試物對雄、雌小鼠的經(jīng)口MTD均大于20.0 g/kg(見表1)。根據(jù)急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)方翅果油屬無毒級。

表1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

2.2.1 Ames試驗(yàn)結(jié)果(見表2)

由表2可看出，受試物各劑量組菌落數(shù)小于自發(fā)回變組菌落數(shù)的2倍，且無劑量反應(yīng)關(guān)系。

表2 Ames試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果(見表3)

由表3可見，受試物各劑量組雄、雌小鼠的PCE/NCE均高于溶劑對照組的20%，表明受試物對小鼠骨髓細(xì)胞無細(xì)胞毒性。受試物各劑量組微核細(xì)胞率與溶劑對照組比較無明顯劑量反應(yīng)關(guān)系且無顯著性差異(P>0.05)，而陽性對照組與溶劑對照組之間存在極顯著性差異(P<0.01)。

2.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果(見表4)

由表4可見，受試物各劑量組小鼠精子畸變率與溶劑對照組比較無明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系且無顯著性差異(P>0.05)，而陽性對照組與溶劑對照組之間存在極顯著性差異(P<0.01)。

表3 骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

表4 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

2.3 亞急性毒性試驗(yàn)

2.3.1 一般表現(xiàn)

各試驗(yàn)組大鼠在試驗(yàn)期內(nèi)生長狀況良好，無中毒體征及死亡，體重增長、進(jìn)食量、食物利用率等指標(biāo)與溶劑對照組比較無顯著性差異(P>0.05)(見表5～表7)。

表5 復(fù)方翅果油對大鼠體重的影響

表6 復(fù)方翅果油對大鼠進(jìn)食量的影響

續(xù)表6

表7 復(fù)方翅果油對大鼠食物利用率的影響

2.3.2 血常規(guī)指標(biāo)測定結(jié)果(見表8)

由表8可見：受試物低、高劑量組雄性大鼠的中性粒細(xì)胞占比、淋巴細(xì)胞占比與溶劑對照組比較存在顯著性差異(P<0.05、P<0.01)，但數(shù)值均在實(shí)驗(yàn)室正常范圍內(nèi)，不認(rèn)為存在生物學(xué)意義；其他血常規(guī)指標(biāo)均在實(shí)驗(yàn)室正常范圍內(nèi)，且與溶劑對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。

表8 血常規(guī)指標(biāo)測定結(jié)果

2.3.3 血生化指標(biāo)測定結(jié)果(見表9)

由表9可見：受試物雄性大鼠高劑量組、雌性大鼠中劑量組谷丙轉(zhuǎn)氨酶，雌性大鼠高劑量組白蛋白與溶劑對照組比較存在顯著性差異(P<0.05)，但數(shù)值均在實(shí)驗(yàn)室正常范圍內(nèi)，不認(rèn)為存在生物學(xué)意義；其他生化指標(biāo)均在實(shí)驗(yàn)室正常范圍內(nèi)，且與溶劑對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。

2.3.4 大體解剖及病理組織學(xué)觀察結(jié)果

試驗(yàn)?zāi)┢诖笫蟠篌w解剖未見明顯異常。各試驗(yàn)組雄、雌大鼠的肝、脾、腎、睪丸等臟器濕重及臟體比與溶劑對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表10)。

表9 血生化指標(biāo)測定結(jié)果

表10 大鼠30 d喂養(yǎng)臟器濕重及臟體比結(jié)果

對大鼠肝、脾、腎、睪丸/卵巢、胃、腸的組織病理切片檢查結(jié)果顯示，高劑量組和溶劑對照組個(gè)別大鼠標(biāo)本可見肝小葉內(nèi)點(diǎn)狀炎細(xì)胞浸潤灶或肝臟匯管區(qū)內(nèi)點(diǎn)狀炎細(xì)胞浸潤灶(見圖1B、圖1C)，但所見病變程度輕，發(fā)生率低，且高劑量組的病變程度和發(fā)生率與溶劑對照組比較未見加重，屬于大鼠自發(fā)病變，未見高劑量組大鼠出現(xiàn)毒性相關(guān)的特異性病理改變。

注：A.溶劑對照組大鼠正常肝組織切片；B.高劑量組大鼠肝小葉內(nèi)點(diǎn)狀炎細(xì)胞浸潤；C.溶劑對照組大鼠肝臟匯管區(qū)點(diǎn)狀炎細(xì)胞浸潤。

3 結(jié) 論

本次試驗(yàn)條件下，復(fù)方翅果油急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，其對雄、雌小鼠的MTD均大于20 g/kg，根據(jù)急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，屬于無毒級物質(zhì)；遺傳毒性試驗(yàn)階段，復(fù)方翅果油在體外、體內(nèi)兩個(gè)試驗(yàn)系統(tǒng)中，對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102無誘變陽性，未見致小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核作用，也未觀察到致小鼠精子畸變作用，表明其對原核細(xì)胞、哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞與生殖細(xì)胞均未呈現(xiàn)遺傳毒性作用；亞急性毒性試驗(yàn)顯示，復(fù)方翅果油各劑量組大鼠在試驗(yàn)期間一般表現(xiàn)良好，體重及食物利用率等各項(xiàng)指標(biāo)正常，血常規(guī)及血生化各指標(biāo)均在實(shí)驗(yàn)室正常范圍內(nèi)，大鼠大體解剖與病理組織學(xué)檢查均未顯示特異性的病理改變。初步認(rèn)定復(fù)方翅果油無明顯毒副作用，可安全應(yīng)用于食品及保健食品。