張 勇，陳 燕，李欣陽(yáng)，王全穎，張永豐，王秋珍

(1.國(guó)家海洋局秦皇島海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站, 河北 秦皇島 066002; 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院, 河北 秦皇島 066000)

在自然生態(tài)環(huán)境中，微生物之間具有錯(cuò)綜復(fù)雜的互作關(guān)系(如互利共生、競(jìng)爭(zhēng)拮抗等)，通過(guò)調(diào)控自身以及其他生物的生長(zhǎng)、生理和代謝活動(dòng)，不斷適應(yīng)變化莫測(cè)的外界環(huán)境。在實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件下微生物能夠調(diào)節(jié)自身活動(dòng)以適應(yīng)人工培養(yǎng)條件，生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)均發(fā)生顯著改變，最終導(dǎo)致可培養(yǎng)性和代謝產(chǎn)物的變化?；旌吓囵B(yǎng)方式能夠促進(jìn)微生物之間的物質(zhì)、能量和信息交流，使微生物對(duì)碳、氮等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同化作用加強(qiáng)，促使更多的碳流向碳水化合物[1]。因此，采用混合培養(yǎng)方法獲得的微生物生物質(zhì)在食品、飼料、化工、可再生能源等方面具有更大的應(yīng)用潛力。

全球范圍內(nèi)能源消耗和環(huán)境污染問(wèn)題的加劇，促使人類(lèi)對(duì)于生物質(zhì)能源的探究更加深入。微生物油脂作為一種綠色可再生能源，不僅是合成生物柴油的重要底物，而且是很多功能化學(xué)品的重要來(lái)源。因此，通過(guò)微生物混合培養(yǎng)方式實(shí)現(xiàn)微生物油脂的高效生產(chǎn)對(duì)于解決當(dāng)前的能源與環(huán)境問(wèn)題具有重要意義。本文對(duì)微生物混合培養(yǎng)生產(chǎn)油脂的現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，以期為微生物油脂的高效生產(chǎn)提供參考。

1 微生物油脂概述

隨著化石燃料的不斷消耗，生物質(zhì)能源的研究愈加深入。微生物具有生長(zhǎng)迅速、底物來(lái)源廣泛、油脂含量高的特點(diǎn)，是生物質(zhì)燃料和天然活性產(chǎn)物的重要來(lái)源。某些微藻、真菌、原生生物和細(xì)菌等微生物均能合成大量的脂類(lèi)物質(zhì)，組成這些脂質(zhì)的脂肪酸主要為中長(zhǎng)鏈(14～22個(gè)碳原子)的飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸[2-3]。其中：含有14～18個(gè)碳原子的飽和脂肪酸如十四烷酸(C14∶0)、棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)等，以及單不飽和脂肪酸如棕櫚油酸、油酸等，是制備生物柴油的優(yōu)良底物[4]；而長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸如二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、花生四烯酸(AA)和γ-亞麻酸(GLA)等具有重要的生理功能，在食品、醫(yī)藥、保健、飼料等行業(yè)具有重要的應(yīng)用價(jià)值[5-6]。

微生物油脂的合成受多種因素的影響，其中培養(yǎng)基組成(碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等)和環(huán)境條件(溫度、pH、鹽度等)是工藝優(yōu)化中研究最多的[2]。充足的碳源有利于微生物的快速生長(zhǎng)，而限氮和低溫條件則能夠促進(jìn)微生物細(xì)胞內(nèi)油脂的累積。在操作模式上，與分批發(fā)酵相比，補(bǔ)料分批發(fā)酵更有利于微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成，但生產(chǎn)成本也更高。另外，某些微生物之間混合培養(yǎng)可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)和信息交流互相促進(jìn)彼此的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成，同時(shí)結(jié)合培養(yǎng)條件的優(yōu)化，最終比微生物單獨(dú)培養(yǎng)表現(xiàn)出更高的生物量和油脂產(chǎn)量。

2 微生物混合培養(yǎng)生產(chǎn)油脂的現(xiàn)狀

目前，關(guān)于微生物混合培養(yǎng)生產(chǎn)油脂的研究主要集中在藻-菌混合培養(yǎng)方面。藻-菌之間明顯的營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)優(yōu)勢(shì)，使其在廢棄物處理和微生物油脂生產(chǎn)方面?zhèn)涫懿毮?。?菌混合培養(yǎng)雖然研究得比較早，但近些年相關(guān)研究并不多；而藻-藻混合培養(yǎng)的研究較為缺乏。

2.1 藻-菌混合培養(yǎng)

藻-菌混合培養(yǎng)主要是微藻與酵母或細(xì)菌之間的混合培養(yǎng)。用于混合培養(yǎng)的微藻主要包括小球藻[7-8]、柵藻[9-10]、小椿藻[11]、雨生紅球藻[12]、斜生四鏈藻[13]等；酵母主要包括粘紅酵母[3,14-16]、圓紅冬孢酵母[17-18]、釀酒酵母[2,19]、解脂耶氏酵母[20-21]等；細(xì)菌包括巴西固氮螺菌[9]、微藻共生菌[10]等。微藻與酵母混合培養(yǎng)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，是混合發(fā)酵中應(yīng)用最多的微生物組合，其中小球藻與粘紅酵母混合培養(yǎng)生產(chǎn)油脂的研究最多(表1)。一方面，微藻對(duì)有機(jī)物的降解能力較弱，但能夠利用底物中的大量無(wú)機(jī)物，通過(guò)光合作用吸收環(huán)境中的二氧化碳并釋放氧氣，而酵母菌在有氧條件下可利用底物中的大量有機(jī)物進(jìn)行自身的代謝，釋放出二氧化碳。因此，微藻與酵母混合培養(yǎng)能夠通過(guò)營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)、氣體交換和pH調(diào)節(jié)等機(jī)制，促進(jìn)微生物代謝產(chǎn)物的合成和底物的有效利用。并且，微藻釋放的一些次生代謝產(chǎn)物可以作為化感物質(zhì)刺激酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)[14]。另外，在光照條件下微藻也可以與細(xì)菌在人工培養(yǎng)基和廢棄物中進(jìn)行混合培養(yǎng)。小球藻ChlorellavulgarisSAG 211-19與需氧細(xì)菌混合培養(yǎng)可以處理水產(chǎn)品加工廢水，培養(yǎng)14 d后，小球藻的生物量和油脂含量分別達(dá)到0.82 g/L和32.15%[22]。柵藻可以與巴西固氮螺菌AzospirillumbrasilenseATCC 29145或自身共生細(xì)菌進(jìn)行混合培養(yǎng)[11-12]。

接種量和接種時(shí)間是影響藻-菌混合培養(yǎng)生長(zhǎng)和油脂累積的重要因素。多數(shù)研究在進(jìn)行藻-菌混合培養(yǎng)時(shí)，同時(shí)接種一定比例的藻液和菌液，并且藻液的細(xì)胞密度高于菌液。Zhang等[14]研究表明，同時(shí)接種不同比例的小球藻Chlorellavulgaris與粘紅酵母Rhodotorulaglutinis(CGMCC No. 2258)進(jìn)行混合培養(yǎng)，當(dāng)藻和菌的種子液接種比例均為3%時(shí)，其生物量和油脂產(chǎn)量分別為10.3 g/L和1.56 g/L，而當(dāng)藻和菌的種子液接種比例分別為6%和3%時(shí)，其生物量和油脂產(chǎn)量分別為8.7 g/L和1.03 g/L。因此，微藻接種比例的增加會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)和油脂累積。另外，少數(shù)研究先接種菌液，當(dāng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期以后，再接種藻液[17]。

微藻可以進(jìn)行自養(yǎng)、異養(yǎng)和混合營(yíng)養(yǎng)生活，微藻在進(jìn)行純培養(yǎng)時(shí)多數(shù)利用光合作用進(jìn)行光自養(yǎng)生活。而在藻-菌混合培養(yǎng)時(shí)，光自養(yǎng)仍然是微藻的主要生活方式，但在暗發(fā)酵的異養(yǎng)條件下，培養(yǎng)體系中其他微生物的存在能夠提高微藻對(duì)難降解底物的利用效率。在異養(yǎng)條件下單一微藻培養(yǎng)難以利用二糖，但蛋白核小球藻Chlorellapyrenoidosa與粘紅酵母Rhodotorulaglutinis在蔗糖條件下進(jìn)行混合培養(yǎng)時(shí)，蛋白核小球藻卻可以利用由粘紅酵母水解蔗糖生成的葡萄糖和果糖，搖瓶培養(yǎng)5 d后，其油脂含量達(dá)到30%以上(占細(xì)胞干重的比重)[15]。與自養(yǎng)方式相比，異養(yǎng)方式不需要光照，對(duì)環(huán)境和發(fā)酵設(shè)備的要求更低，在規(guī)模化生產(chǎn)中更具優(yōu)勢(shì)。

表1 小球藻與酵母混合培養(yǎng)生產(chǎn)油脂的研究

2.2 藻-藻混合培養(yǎng)

微藻與微藻之間混合培養(yǎng)生產(chǎn)油脂的研究較少，為數(shù)不多的研究表明柵藻可以與雨生紅球藻、小球藻、野生藻類(lèi)等進(jìn)行混合培養(yǎng)[24-26]。一方面，混合培養(yǎng)微藻之間由于對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致培養(yǎng)液中總氮濃度的降低，以此作為環(huán)境壓力有利于藻類(lèi)細(xì)胞內(nèi)油脂的合成[24]。另一方面，混合培養(yǎng)微藻釋放的可溶性藻產(chǎn)物能夠促進(jìn)彼此的光合作用和同化作用，促進(jìn)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)和油脂合成[24]。小球藻Chlorellavulgaris與二形柵藻Scenedesmusdimorphus同時(shí)接種至人工培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后，油脂產(chǎn)量和油脂含量達(dá)到3.84 g/L和10.9%[25]。柵藻Scenedesmussp. LX1與雨生紅球藻Haematococcuspluvialis混合培養(yǎng)可以用于處理生活二級(jí)廢水(Domestic secondary effluent)，同時(shí)接種不同比例(藻-藻細(xì)胞干重的比例4∶1、1∶1和1∶10)的兩種微藻時(shí)，其生物量可達(dá)到0.51～0.54 g/L；并且在接種比例為4∶1時(shí)，生物量最大[24]。故接種比例影響混合培養(yǎng)微藻的生長(zhǎng)和油脂累積。此外，以模擬城市污水為發(fā)酵底物，柵藻ScenedesmusobliquusFACHB 416與池塘或湖泊野生藻可以進(jìn)行混合培養(yǎng)，但其油脂產(chǎn)量顯著低于柵藻單獨(dú)培養(yǎng)[26]。因此，藻-藻混合培養(yǎng)能夠用于多種廢棄物的處理和油脂的生產(chǎn)，但對(duì)底物的利用效率普遍不高，并且藻類(lèi)之間的混合培養(yǎng)工藝研究尚且缺乏，仍有待進(jìn)一步探究。

2.3 菌-菌混合培養(yǎng)

菌-菌混合培養(yǎng)中經(jīng)常使用的真菌包括酵母和霉菌，多用于發(fā)酵農(nóng)業(yè)廢棄物如玉米秸稈[27]、谷氨酸發(fā)酵廢水[28]、丟糟[29]等。一般在采用的混合菌株中，至少有一種菌株具有較強(qiáng)的大分子物質(zhì)降解能力，另外的菌株則具有較強(qiáng)的油脂累積能力。假絲酵母Candidasp.具有較強(qiáng)的纖維素等多糖降解活性，而皮狀絲孢酵母TrichosporoncutaneumGIM 2.68油脂累積能力強(qiáng)，兩者混合培養(yǎng)可用于發(fā)酵丟糟，在最適培養(yǎng)條件下發(fā)酵4 d后，油脂轉(zhuǎn)化率達(dá)到2.114%[29]。玉米秸稈含有豐富的纖維素成分，可以用作多菌種發(fā)酵生產(chǎn)油脂的底物。利用綠色木霉Green wooden mould GIM 3.139、煙曲霉AspergillusfumigatusFreseniusGIM3.421與皮狀絲孢酵母TrichosporoncutaneumGIM2.68混合發(fā)酵玉米秸稈，在最適條件下油脂轉(zhuǎn)化率可達(dá)1.247%[27]。其中綠色木霉和煙曲霉具有較強(qiáng)的纖維素降解活性，生成的五碳糖和六碳糖可用于皮狀絲孢酵母油脂的合成。此外，釀酒酵母可以分別與德式乳酸桿菌、畢赤酵母等進(jìn)行混合培養(yǎng)[30]。與藻-菌混合培養(yǎng)以及藻-藻混合培養(yǎng)相比，菌-菌混合培養(yǎng)的微生物之間在生長(zhǎng)和油脂累積方面的協(xié)同作用不強(qiáng)，并且已有的研究主要集中在酵母和霉菌混合培養(yǎng)對(duì)農(nóng)業(yè)廢棄物的轉(zhuǎn)化方面。因此，尋找更加多樣的底物來(lái)源以及高產(chǎn)高附加值代謝產(chǎn)物的菌株類(lèi)型，是未來(lái)值得探究的方向。

3 微生物混合培養(yǎng)產(chǎn)油的發(fā)酵底物研究現(xiàn)狀

混合培養(yǎng)能夠提高微生物對(duì)發(fā)酵底物的選擇性和利用效率?；旌吓囵B(yǎng)體系中底物的碳、氮源種類(lèi)和濃度以及二氧化碳水平也是影響微生物生長(zhǎng)和油脂累積的關(guān)鍵因素。將酵母工業(yè)消化液用作小球藻Chlorellavulgaris與解脂耶氏酵母Yarrowialipolytica的混合培養(yǎng)底物，隨著底物稀釋倍數(shù)的增加，其生物量和油脂產(chǎn)量均降低[21]。劉方舟等[16]研究了不同碳源(葡萄糖、甘油和乙酸鈉)在不同初始質(zhì)量濃度(1～10 g/L)下普通小球藻ChlorellavulgarisUTEX2714和粘紅酵母Rhodotorulaglutinis2.704共培養(yǎng)的生長(zhǎng)和油脂累積的情況，結(jié)果表明，不同碳源的最適質(zhì)量濃度存在差異，3種碳源的最適質(zhì)量濃度分別為7、5 g/L和10 g/L，柵藻Scenedesmusobliquus與其共生細(xì)菌B1進(jìn)行混合培養(yǎng)時(shí)，使用添加NaHCO3的BBM人工培養(yǎng)基培養(yǎng)16 d后，柵藻的生物量和油脂含量分別達(dá)到2.42 g/L和24.4%，顯著高于未添加NaHCO3的對(duì)照組(1.38 g/L和22.0%)[10]。二氧化碳水平的增加能夠提高微藻的光合作用速率，有利于推動(dòng)混合培養(yǎng)體系碳的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)和油脂合成。

與人工培養(yǎng)基相比，雖然廢棄物作為發(fā)酵底物時(shí)微生物的生長(zhǎng)相對(duì)較慢，但仍然可以獲得較多的生物量和胞內(nèi)油脂。微生物混合培養(yǎng)的研究多使用工農(nóng)業(yè)廢棄物、城市廢水、食物垃圾等作為發(fā)酵底物，廢棄物中人工營(yíng)養(yǎng)成分的添加能夠促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的累積。小球藻與酵母混合培養(yǎng)能夠利用釀酒廠廢水[17]、工廠粗甘油副產(chǎn)物[23]、海產(chǎn)品加工廢水[22]、城市廢水[24]、木薯蔗渣水解液[3]、食品廢棄物[18,31]等進(jìn)行生長(zhǎng)和油脂合成。蛋白核小球藻Chlorellapyrenoidosa15-2070與粘紅酵母Rhodotorulaglutinis(GIM2.27)在未脫毒的木薯蔗渣水解液中混合培養(yǎng)12 d后，兩者的生物量和油脂產(chǎn)量分別達(dá)到31.45 g/L和18.47 g/L[3]。微生物混合培養(yǎng)的底物可以使用一種廢棄物，也可以使用兩種以上的廢棄物混合液。蛋白核小球藻與圓紅冬孢酵母在黃酒釀造廢水和生活廢水混合液中培養(yǎng)5 d后，油脂含量和產(chǎn)量分別達(dá)到63.45%和4.60 g/L[17]。藻-菌混合培養(yǎng)能夠?qū)Χ喾N廢棄物進(jìn)行高效利用，同時(shí)累積較高含量的油脂，是極具工業(yè)化應(yīng)用前景的微生物組合，在廢棄物資源化再利用方面具有很好的應(yīng)用潛力。

此外，廢棄物中添加一定比例的人工培養(yǎng)基成分或者碳氮源，往往更有利于微生物的快速生長(zhǎng)和油脂累積，并且不同種類(lèi)的外加碳源影響微生物的轉(zhuǎn)化能力[16]。斜生四鏈藻Tetradesmusobliquus(ACOI 204/07)與圓紅冬孢酵母RhodosporidiumtoruloidesNCYC 921以啤酒廠二次廢水為發(fā)酵底物進(jìn)行混合培養(yǎng)，底物中甘蔗糖蜜的添加促進(jìn)了微生物的生長(zhǎng)，其生物量(1.68 g/L)明顯高于未添加的對(duì)照組(0.44 g/L)[13]。以乳品廢水發(fā)酵液和甘油為底物，小球藻ChlorellavulgarisNIES-227與解脂耶氏酵母YarrowialipolyticaGIM 2.197混合培養(yǎng)144 h后，其生物量和油脂產(chǎn)量分別達(dá)到1.62 g/L和0.31 g/L[20]。微生物混合培養(yǎng)利用來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉的各種廢棄物作為發(fā)酵底物，能夠降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)資源再利用和環(huán)境保護(hù)的目的。

4 結(jié) 語(yǔ)

微生物混合培養(yǎng)生產(chǎn)油脂的研究主要集中在藻-菌、藻-藻和菌-菌混合培養(yǎng)，既可以利用富營(yíng)養(yǎng)人工培養(yǎng)基，也可以發(fā)酵各種廢棄物，是一種綠色、經(jīng)濟(jì)的油脂生產(chǎn)方式。藻-菌混合培養(yǎng)通過(guò)微藻與酵母(或細(xì)菌)之間的營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)和化感物質(zhì)作用，實(shí)現(xiàn)微生物的快速生長(zhǎng)和油脂的大量累積，是目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。藻-藻混合培養(yǎng)可通過(guò)加強(qiáng)微藻之間的相互競(jìng)爭(zhēng)，提供低氮環(huán)境促進(jìn)脂質(zhì)的累積。而菌-菌混合培養(yǎng)分別利用微生物的降解能力和油脂合成能力，提高產(chǎn)油微生物對(duì)大分子底物的利用效率。一方面，目前用于混合培養(yǎng)生產(chǎn)油脂的微生物種類(lèi)較少，主要為小球藻、柵藻、粘紅酵母、圓紅冬孢酵母和釀酒酵母，未來(lái)可以進(jìn)一步將高產(chǎn)高附加值代謝產(chǎn)物的微藻和原生生物等用于混合培養(yǎng)生產(chǎn)油脂的研究。另一方面，混合培養(yǎng)代謝產(chǎn)物組成簡(jiǎn)單，脂肪酸組成多為C14～C18的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸，可用于生物柴油的生產(chǎn)原料；而針對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸合成微生物的混合培養(yǎng)研究短缺，亟待全面深入研究。