楊立賓，江云兵，周 甜，崔福星，朱道光，徐 飛

1. 西華師范大學環(huán)境科學與工程學院，四川 南充 637002

2. 黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040

氣候變暖是全球變化的主要表現(xiàn)之一[1]，據(jù)IPCC評估報告預測，如果氣溫以目前的速度增長，到2052年，預計全球氣溫將會比工業(yè)化之前水平升高1.5 ℃[2]. 氣候變暖引起降水格局的變化是全球氣候變化的重要特征之一，隨著氣候變暖的加劇，降雪也將發(fā)生較大變化[3]. 在北半球的陸地生態(tài)系統(tǒng)中冬季有近50%的面積被積雪覆蓋[4]，有效厚度的雪被覆蓋能夠起到絕緣保溫和保濕作用[5]，同時也能夠維持土壤微生物的活力[6-7]，并使土壤微生物在冬季進行土壤呼吸[8]. 冬季土壤呼吸是重要的碳排放過程，研究[5]表明，冬季土壤呼吸主要來自微生物的異氧呼吸，其呼吸量占全年土壤呼吸總量的14%～30%. 目前對于冬季土壤呼吸的研究已有報道，但相關(guān)研究主要集中于極地苔原地區(qū)、高緯度地區(qū)和亞高山地區(qū)[9-14]，而在其他地區(qū)相關(guān)的研究并不多見.

凋落物是土壤營養(yǎng)元素的主要補給者[13]，能夠為冬季土壤微生物存活提供有機物質(zhì)與營養(yǎng)元素[9]. 真菌是凋落物分解過程中的重要分解者[14]，有研究認為真菌是分解過程中的先鋒群落[14]，在分解過程的先驅(qū)階段，真菌群落首先破壞木質(zhì)素的保護層[14-16]，為其他類群參與分解以及不同性質(zhì)的物質(zhì)分解創(chuàng)造條件.目前，對于冬季土壤呼吸的變化規(guī)律和產(chǎn)生原因尚存爭議，有學者認為與碳虧缺限制作用(limitation of carbon)有關(guān)[9]，而有些學者認為與微生物群落轉(zhuǎn)化(shift of microbial populations between winter and summer )有關(guān)[10]，還有學者認為與二者無關(guān)[11].

地處我國最高緯度的黑龍江省氣溫變暖的水平遠超全國平均水平[17]，大興安嶺地區(qū)是我國寒溫帶森林生態(tài)系統(tǒng)的典型代表，也是受氣候變化影響較為敏感的區(qū)域. 研究表明，1961-2015年黑龍江省氣溫顯著升高，大興安嶺降雪初日推遲、降雪終日提前、降雪期縮短、降雪日數(shù)減少、降雪強度增加、小雪次數(shù)和小雪量減少[17]. 目前針對寒溫帶森林冬季土壤呼吸和作用機制的研究并不廣泛，相關(guān)假說的提出是否具有全球一致性還需進一步研究. 因此，為探討寒溫帶森林冬季土壤呼吸的影響因素以及冬季土壤呼吸“碳虧缺”假說的全球一致性，該研究在大興安嶺落葉松林采用人工堆雪的方法設(shè)置有效雪被覆蓋，添加不同質(zhì)量凋落物，進行野外原位試驗. 采用Illumina高通量測序技術(shù)，對土壤真菌進行測序，分析土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的差異，以期為冬季土壤呼吸及影響機制的研究提供參考.

1 研究方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)域位于黑龍江省大興安嶺呼中國家級自然保護區(qū)內(nèi)，試驗樣地(51°49′01″N～51°49′19″N、122°59′33″E～123°00′03″E)位于2014年建成的落葉松(Larix gmelinii)林25 hm2國際性監(jiān)測樣地內(nèi). 樣地地形平緩，海拔847～974 m，年均氣溫-4 ℃，年均降水量458.3 mm，年均相對濕度71%，年均蒸發(fā)量911 mm[18].土壤為棕色針葉林土，土壤厚度為5～25 cm. 植被群落結(jié)構(gòu)單一，是以落葉松為主要優(yōu)勢種的寒溫帶落葉針葉林，其中喬木4種，灌木37種，草本127種，隸屬于21科39屬. 喬木為落葉松和白樺(Betula platyphylla)，主要灌木包括杜香(Ledum palustre)、篤斯越桔(Vaccinium uliginosum)等，主要草本包括舞鶴草(Maianthemum bifolium)、地榆(Sanguisorba officinalis)等[19].

1.2 試驗設(shè)計與樣品采集

2018年11月10日，在試驗區(qū)內(nèi)選取地勢平坦、相對較為開闊、環(huán)境均質(zhì)性較好的20 m×20 m的試驗樣地3塊，在每塊樣地分別劃出1 m×1 m的4個區(qū)域，分別對應添加不同質(zhì)量的凋落物. 其中，自然對照組不做處理(CK)，凋落物去除組(litter removal group,LR)將土壤表層凋落物層去除，凋落物加倍組(litter addition group, LA)使用0.147 mm孔徑的凋落物袋在1 m×1 m的范圍內(nèi)均勻添加25 g低溫烘干后的落葉松針葉，凋落物多倍組(litter double add group, LD)添加50 g凋落物. 采用人工堆雪的方法將雪均勻覆蓋在布置好凋落物的樣方上，雪被高度為50 cm.2019年2月10日將雪被和凋落物、腐殖質(zhì)層移除，采集0～10 cm土壤，挑出凋落物、細根、小石塊等雜物后低溫研磨、混勻后置于-80 ℃下儲存，其中一份用于土壤理化性質(zhì)測定，另一份進行高通量測序，用于真菌多樣性分析[18-19].

1.3 測定與分析

1.3.1土壤理化指標測定

采用電位法測定土壤pH；使用CN元素分析儀(Multi N/C 2100S，德國耶拿分析儀器股份公司)測定土壤OC和TN含量；采用堿解蒸餾法測定土壤AN含量；采用NaHCO3浸提比色法測定土壤AP含量；采用火焰光度計法測定土壤AK含量；采用氯仿熏蒸法測定土壤MBC含量[18-22].

1.3.2土壤DNA提取與真菌ITS基因擴增

稱取0.5 g土壤樣品，使用試劑盒(Carlsbad, CA,USA)法提取土壤總DNA. 以50 ng DNA為模版，采用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對土壤真菌ITS基因ITS1區(qū)進行PCR擴增. 擴增體系：5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L的dNTP 2 μL，5 μmol/L的Primer F 0.8 μL，5 μmol/L的Primer R 0.8 μL，5 U/μL的Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，DNA模板10 ng，補超純水(ddH2O)至20 μL. PCR擴增后利用2%的瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Union City,CA, USA)凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物. 將純化擴增產(chǎn)物等摩爾混合，構(gòu)建Miseq文庫，使用Illumina MiSeq平臺對文庫進行上機測序[18-22].

1.4 生物信息學分析和數(shù)據(jù)處理

使用Qiime軟件進行數(shù)據(jù)去雜，以97%相似性為標準劃分操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)，使用Usearch去除嵌合體. 采用RDP classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學分析，置信度閾值為0.7. 物種分類采用Unite 8.0/itself_fungi(Unite Release 8.0)的真菌數(shù)據(jù)庫進行比對和鑒定[19].采用Mothur軟件進行Alpha多樣性指數(shù)分析和Rarefaction分析，分別用覆蓋度(Coverage)指數(shù)和艾斯(Ace)指數(shù)、香農(nóng)-威納(Shannon-Wiener)指數(shù)、辛普森(Simpson)指數(shù)分別表示測序深度和物種的多度、豐富度、均勻度[20-22]. Beta多樣性基于Bray-Curtis距離計算并進行PCoA分析，用FastUniFrac分析得到樣本間距離矩陣. 采用db-RDA分析和相關(guān)性Heatmap分析(采用Pearson法)進行環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析. 采用FUNGuild軟件對真菌的生態(tài)功能群進行分析. 使用R語言vegan包和ggplot包[18-22]制圖.生物信息學分析采用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的微生物多樣性云V4.0平臺[19-20].

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

從表1可以看出：與對照組相比，各處理組土壤pH均下降，其中LD與其他各組均存在顯著性差異；土壤OC含量隨凋落物質(zhì)量的增加呈顯著升高趨勢，LR與其他組相比土壤OC含量顯著降低，各組之間存在顯著性差異；TN和AN含量隨凋落物質(zhì)量的增加依次升高，其中LR、LD均與CK存在顯著性差異；AP、AK含量隨凋落物質(zhì)量的增加而顯著升高，各處理組與對照組相比均具有顯著性差異；MBC含量隨凋落物質(zhì)量的增加依次升高，凋落物添加組與對照組無顯著性差異，凋落物去除組與對照組存在顯著性差異(P＜0.05).

表 1 不同處理下的土壤理化性質(zhì)比較Table 1 Comparison of soil physical and chemical properties under different treatments

2.2 真菌組成與群落分布特征分析

如圖1所示，不同處理下土壤真菌OTUs總數(shù)排序為LA＞LR＞CK＞LD，數(shù)量分別為797、762、733、710個. 其中，各組共有的OTUs數(shù)量為390個，特有的OTUs數(shù)量中，LR為66個，CK為52個，LA為40個，LD為31個.

在相似水平為97%的條件下，對OTUs的代表序列做分類學分析，試驗測序共鑒定出11門、42綱、97目、193科、352屬、534種真菌. 從圖2中右側(cè)大圓的外端半圓可以看出，在綱分類水平上按相對豐度依次為傘菌綱(Agaricomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)、Geminibasidiomycetes、Archaeorhizomycetes、散囊均綱(Eurotiomycetes)、銀耳綱(Tremellomycete)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、被孢霉綱(Mortierellomycetes)、茶漬綱(Lecanoromycetes)、TritirachioDothideomyc綱和麥軸梗霉綱(Tritirachiomycetes)，其中傘菌綱、錘舌菌綱、Geminibasidiomycetes為各組中的優(yōu)勢菌綱.圖2中右側(cè)大圓的內(nèi)端半圓表示某菌綱在4個組中的相對豐度排序，可以看出，各組中傘菌綱的相對豐度排序為CK＞LA＞LR＞LD，錘舌菌綱的相對豐度排序為LD＞LR＞CK＞LA，Geminibasidiomycetes的相對豐度排序為LD＞LA＞CK＞LR.

圖 2 不同處理下土壤真菌綱水平上的群落組成Fig.2 Community composition of soil fungi class level under different treatments

從圖2中左側(cè)外端半圓的分析可以看出，傘菌綱在各組中的相對豐度較高，為共有優(yōu)勢菌綱. 隨著凋落物質(zhì)量的增加，傘菌綱的相對豐度先升高后降低，錘舌菌綱的相對豐度先降低后升高，Geminibasidiomycetes的相對豐度持續(xù)升高.

從圖3可以看出，屬分類水平上主要包括Russula、Inocybe、Geminibasidium、Archaeorhizomyces、Oidiodendron、Hygrophorus、Cortinarius、Piloderma等，其中Russula為各組中的優(yōu)勢菌屬，各組間Russula、Inocybe、Cortinarius的相對豐度存在極顯著性差異，Piloderma的相對豐度存在顯著性差異.

圖 3 不同處理下土壤真菌屬水平上的群落組成和差異Fig.3 Community composition and difference of soil fungi at genus level under different treatments

2.3 Alpha多樣性分析

對雪蓋下添加不同質(zhì)量凋落物的土壤真菌的Alpha多樣性指數(shù)進行ANOVA分析，結(jié)果(見表2)顯示，各分解等級的Coverage指數(shù)均超過99，趨近于100，且各組之間無顯著性差異，說明樣本中序列被測出的概率較高，表明此次測序結(jié)果能夠反映樣本中真菌的真實情況. 對于真菌的Ace指數(shù)，其中LR最高，LD最低，說明各組下真菌的多度有所不同，但各組之間無顯著性差異. 對于Shannon-Wiener指數(shù)，其中LR最高，CK最低，說明各樣品中真菌物種組成的豐富度不同，但各組無顯著性差異. 對于Simpson指數(shù)，其中CK最高，LR最低，說明各組之間優(yōu)勢類群的優(yōu)勢度和整個菌群的均勻程度有所不同，但各組之間并無顯著性差異.

表 2 不同處理下土壤真菌多樣性指數(shù)分析Table 2 Analysis of diversity index of soil fungi under different treatments

2.4 Beta多樣性分析

基于Bray-Curtis距離對雪蓋下添加不同質(zhì)量凋落物處理的土壤真菌群落組成進行主坐標PCoA(principal co-ordinates analysis)分析. 從圖4(a)可以看出：在主成分1方向上各組樣品分為兩大組，第一組在主成分1的負方向上(LA和LD)，第二組在主成分1的正方向上(CK和LR)；在主成分2方向上CK和LR被分開，分別置于第一象限和第四象限. 4個處理組的置信橢圓互有交集，其中LA和LD組橢圓面積之間的重合度較高，說明這兩個處理下土壤真菌的多樣性和組成更加相似. 主成分1的解釋率為30.69%，主成分2的解釋率為26.43%，累計解釋率為57.12%.從圖4(b)所示Bray-Curtis距離可以看出，LA與LD之間的距離最小，為0.611 1，說明這兩組的相似性更高；而LR和LD之間的距離最大，為0.695 9，說明這兩組的相似性較低.

圖 4 不同處理下土壤真菌群落間的PCoA分析和Bray-Curtis距離Fig.4 PCoA analysis and Bray-Curtis distance between soil fungal communities under different treatment

2.5 物種與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)分析

基于Bray-Curtis距離，在PCoA分析的基礎(chǔ)上加入環(huán)境因子，進行db-RDA(distance-based redundancy analysis)分析. 從圖5可以看出：第一、二軸的貢獻率分別為21.92%和20.17%，累計貢獻率為42.09%. 與PCoA分析結(jié)果相似，全部樣品被坐標軸分為3組，LA組和LD組在第一象限，LR組在第二象限，CK組在第三象限. MBC含量與土壤養(yǎng)分含量呈負相關(guān)，與土壤pH呈正相關(guān).

選取屬分類水平上的物種與環(huán)境因子進行相關(guān)性Heatmap分析，通過計算Pearson相關(guān)系數(shù)獲得數(shù)值矩陣，以Heatmap圖顯示. 從圖6可以看出，紅菇屬的相對豐度與土壤OC含量呈顯著負相關(guān)，與土壤pH呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)；絲蓋菌屬的相對豐度與TN、AN含量均呈顯著負相關(guān)(P＜0.05)，與土壤AP含量呈極顯著負相關(guān)(P＜0.01)；Archaeorhizomyces屬的相對豐度與TN、AN、AK含量均呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)；絲膜菌屬和子囊菌門中未定義的菌屬與TN、AN、AK含量均呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01).

圖 5 基于Bray-Curtis距離的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis based on Bray-Curtis distance

圖 6 屬水平上的真菌與環(huán)境因子的相關(guān)性Heatmap分析Fig.6 Heatmap analysis of the relationship between fungi at the genus level and environmental factors

3 討論

3.1 凋落物輸入對土壤微生物生物量的影響

有效厚度的雪被(厚度大于30 cm)能夠隔絕土壤與外界環(huán)境的熱量交換，從而減小土壤溫度的變化幅度，對土壤起到保溫作用[23]，而適宜的土壤溫度又有利于土壤水分的保持[24-26]. 溫度和水分是土壤微生物活性的重要影響因素，適宜的溫度和水分改變了土壤微生物的生物量和群落組成結(jié)構(gòu)[27-28]. 土壤微生物的活性影響著冬季土壤碳、氮礦化及養(yǎng)分利用[29]，也扮演了凋落物在高寒地區(qū)森林生態(tài)系統(tǒng)冬季的分解主要的驅(qū)動因素；同時，凋落物的數(shù)量、成分、質(zhì)地、養(yǎng)分均會影響土壤微生物的種類、數(shù)量及活力[11].

目前有關(guān)添加凋落物對土壤微生物生物量的影響的研究結(jié)果不盡相同，有研究發(fā)現(xiàn)，凋落物的添加使土壤MBC和MBN(微生物生物量氮)分別增加了13%和46%[11]；但也有研究表明凋落物的影響并不明顯[30]，這與筆者得到的MBC含量變化結(jié)果一致. 筆者發(fā)現(xiàn)，有效厚度雪蓋下添加不同凋落物的土壤養(yǎng)分發(fā)生了不同程度的變化，說明有效厚度的雪被覆蓋下原有的土壤腐殖質(zhì)和輸入的凋落物發(fā)生了分解，同時也說明土壤微生物具有活性；這從該研究中土壤MBC含量的變化也可以看出，隨著輸入凋落物質(zhì)量的增加，土壤微生物的生物量也升高，但與對照組相比并無顯著性差異；而去除凋落物組與其他3組相比卻具有顯著差異. 究其原因可能是，凋落物的輸入為土壤微生物提供了可利用的資源，使得土壤微生物中對于養(yǎng)分變化較為敏感的某些類群以及分解過程中的先鋒類群生物量得到小幅提高，導致總量有所增加但并無差異性[30-31]，而凋落物的去除處理則使得雪蓋下具有活性的土壤微生物類群缺少可利用的資源，可能導致微生物死亡，總體生物量降低.

3.2 凋落物輸入對土壤真菌Beta多樣性和群落組成的影響

多樣性指數(shù)是生態(tài)學和生物多樣性科學中重要的群落多樣性度量指標. Alpha多樣性是最直接、最直觀的群落比較方式，也是比較群落區(qū)別的綜合指數(shù)[20]；而Beta多樣性是強調(diào)群落結(jié)構(gòu)沿梯度的變化情況或特定梯度范圍內(nèi)變異的方向性[32-34]. 該研究中，添加不同質(zhì)量凋落物的雪蓋下土壤真菌的Alpha多樣性指數(shù)雖各不相同，但并不存在顯著差異，營養(yǎng)成分的變化并未對土壤真菌的多度、豐富度和均勻度造成顯著影響. 但不同處理下土壤真菌的組成發(fā)生了變化，且在屬水平上具有極顯著和顯著差異. 這說明雖然凋落物的改變沒有影響真菌類群總體的Alpha多樣性，但真菌類群的組成可能發(fā)生了轉(zhuǎn)換，出現(xiàn)了部分耐低溫的真菌類群，并能夠利用凋落物維持生存和代謝. 這些嗜冷類群取代了嗜溫類群，可能成為冬季低溫環(huán)境中的主要真菌類群，并對土壤生態(tài)過程起到主導作用.

從表征Beta多樣性的PCoA分析以及在此基礎(chǔ)上加入環(huán)境因子的db-RDA結(jié)果可以看出，由于凋落物的添加，各組之間計算得到的Bray-Curtis距離有不同程度的差異，LR和LD與其他兩組差異較大，說明凋落物的改變造成土壤養(yǎng)分的不同，導致土壤真菌對土壤養(yǎng)分的利用也存在差別. 這從土壤真菌的群落組成和相對豐度的變化上也能夠得到印證，特別是優(yōu)勢菌屬中的紅菇屬以及相對豐度較大的絲蓋菌屬在各組之間都具有極顯著性差異，而且這兩個屬的菌群與碳源、氮源均呈顯著相關(guān). 土壤真菌生態(tài)功能組隨凋落物輸入的變化也出現(xiàn)了相似的結(jié)果，相對豐度較大的外生菌根真菌和腐生真菌群變化并不相同，這可能是由于各菌群與碳、氮元素的偏好和碳氮元素的限制性有關(guān). “碳虧缺”假說認為，在冬季，土壤微生物對碳的消耗會造成碳供應虧缺，導致土壤真菌逐漸死亡[9]. 綜上，土壤真菌對于外源營養(yǎng)物質(zhì)特別是碳元素的敏感性更高，證明碳元素是土壤真菌生長的限制因子. 該研究還發(fā)現(xiàn)，氮元素與一些生態(tài)功能菌群的相關(guān)性很高，說明氮元素可能是冬季土壤真菌活性的又一個限制因子，而能否成為“碳虧缺”理論的補充仍然需要進一步研究.

全球氣候變化背景下，大興安嶺寒溫帶興安落葉松林冬季雪蓋下凋落物質(zhì)量的變化改變了土壤養(yǎng)分，但并未顯著改變土壤真菌類群總體的Alpha多樣性，而去除凋落物顯著降低了土壤真菌生物量；Beta多樣性和db-RDA分析顯示，土壤真菌在屬水平上存在顯著性差異，不同菌屬的真菌類群與各項土壤化學特征具有顯著相關(guān)性.

4 結(jié)論

a) 在大興安嶺寒溫帶興安落葉松林設(shè)置有效雪被覆蓋，不同質(zhì)量凋落物的添加改變了土壤的理化性質(zhì)，其中土壤養(yǎng)分含量隨凋落物質(zhì)量的增加而上升.其中，LD的土壤pH顯著低于其他3組，而LR的MBC含量顯著高于其他3組(P＜0.05)；此外，CK、LA、LD的TN、AN、AP和AK含量均顯著高于LR(P＜0.05)，表明土壤養(yǎng)分含量會隨凋落物質(zhì)量的增加而呈上升的趨勢.

b) 就土壤真菌而言，其多度、豐富度、均勻度等多樣性指數(shù)和微生物生物量并未發(fā)生顯著改變.

c) “碳虧缺”假說認為碳是冬季土壤微生物活性的限制因子，該研究發(fā)現(xiàn)絲膜菌屬和子囊菌門中未定義的菌屬均與TN、AN含量呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，而絲蓋菌屬相對豐度與TN、AN含量呈負顯著相關(guān)(P＜0.05). 由此可見，氮元素可能是寒溫帶落葉針葉林冬季土壤真菌活性的又一個限制因子.