兜蘭屬植物花期調(diào)控研究進(jìn)展

尹玉瑩　房林　李琳　陳硯　符穩(wěn)群　吳坤林　曾宋君

摘? 要：兜蘭由于獨(dú)特的花朵造型、絢麗的花朵色彩、持久的觀賞花期而具有極高的觀賞價(jià)值，是國(guó)際上的高檔花卉。但由于生態(tài)環(huán)境的破壞以及人們對(duì)其過(guò)度采挖，兜蘭現(xiàn)已成為世界上最瀕危的植物物種之一，許多種類(lèi)已瀕臨滅絕，所有兜蘭野生種均被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES）附錄I而被禁止交易。目前，市場(chǎng)上流行的兜蘭品種大多是由臺(tái)灣等地利用無(wú)菌播種獲得的雜交種或少量原生種，但由于兜蘭屬植物的生長(zhǎng)習(xí)性復(fù)雜、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、花期種間差異大，至今尚無(wú)有效的花期調(diào)控技術(shù)。兜蘭為典型的合軸生長(zhǎng)方式，花芽產(chǎn)生于每年開(kāi)花前后從基部分蘗出的新側(cè)芽。兜蘭屬植物為總狀花序，具多花原基，多花種類(lèi)（或品種）的副花同時(shí)或先后發(fā)育;單花種類(lèi)（或品種）是由于副花花芽分化后停止發(fā)育所引起的。開(kāi)花時(shí)間與開(kāi)花豐度是2個(gè)非常重要的園藝性狀。光照、溫度、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和肥料是影響植物開(kāi)花的主要因素。對(duì)于主要分布在熱帶地區(qū)的兜蘭屬植物而言，光周期對(duì)其花期的影響不顯著;溫度是促進(jìn)春花型兜蘭從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)進(jìn)入生殖生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素;赤霉素（GA）和6-芐基嘌呤（6-BA）單獨(dú)施用或結(jié)合施用均可以有效調(diào)控花期，一些單花種類(lèi)利用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可促進(jìn)單花類(lèi)的副花發(fā)育形成雙花或多花;開(kāi)花前定期噴施低濃度的含高磷高鉀的水溶肥也可以有效提前花期。本文在對(duì)兜蘭屬植物生長(zhǎng)習(xí)性、花芽分化方式和花期調(diào)控技術(shù)等相關(guān)研究進(jìn)行綜合分析的基礎(chǔ)上，參考其他蘭花花期調(diào)控的方法，提出了兜蘭屬植物花期調(diào)控技術(shù)及分子機(jī)制的主要研究方向，以期為兜蘭屬植物的花期調(diào)控及兜蘭商品化生產(chǎn)提供參考。

關(guān)鍵詞：兜蘭;生長(zhǎng)習(xí)性;花芽分化;花期調(diào)控中圖分類(lèi)號(hào)：S682.31 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Advances in Flowering Regulation of

YIN YuyingFANG LinLI LinCHEN XianFU WenqunWU KunlinZENG Songjun

1. Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Gene Improvement， South China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou 510650， China; 2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China; 3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Botany， South China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou 510650， China; 4. Yunfu Renshan Chengtou Agricultural Development Co.， Ltd.， Yunfu， Guangdong 527300， China; 5. Department of Biological Science & Technology， Minnan Normal University， Zhangzhou， Fujian 363000， China

species， popularly known as slipper orchids because of the resemblance of the pouch-shaped lip to a lady’s slipper， gorgeous flower color and long-lasting flowering， have captured the interest of many orchid growers and hobbyists and are one of the most popular and rare orchid genera being sold and exhibited today. Wild populations are under the threat of extinction as a result of over-collection， loss of suitable habitats， and all species are listed in the Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora （CITES） Appendix I and the trade is prohibited. At present， most of the popular species on the market are hybrids or a small number of native species obtained by asymbiotic seed germination in Taiwan and other places. Due to its long growth cycle， large differences among species and diverse flowering habits， it is difficult to achieve effective flowering regulation. has a sympodial habit of growth. After blooming， the plant will resume growth at the base of the previous shoot. The apical meristem of each new growing shoot continually differentiates its leaves until it initiates flower buds under proper environmental conditions. The is a raceme with polyfloral primordia. The dominant flower and lateral flower （s） of polyfloral species or varieties develope simultaneously or successively. However， the single flower species or varieties are caused by the cessation of development of lateral flower buds after differentiation. Flowering time and flowering abundance are two very important horticultural traits. Light， temperature， plant growth regulators and fertilizers are the main factors affecting plant flowering. For the species mainly distributed in tropical regions， the photoperiod has no significant effect on the flowering period. Temperature is a key factor to promote the growth of spring-flowered from vegetative growth to reproductive growth. Gibberellin （GA） and 6-benzylpurine （6-BA） alone or in combination can effectively control the flowering period. The use of plant growth regulators in some monofloral species could promote the development of lateral flowers to form double or multiple flowers. Regular spraying of low-concentration water-soluble fertilizers containing high phosphorus and high potassium before flowering can also effectively advance the flowering period. This article reviews the related researches on the growth habit， flower bud differentiation and flowering regulation technology of . With reference to other methods of orchid flowering period regulation， suggestions for flowering regulation are put forward in order to provide reference for the research on the flowering regulation technology and the commercial production of .

; growth habit; flower bud differentiation; flowering regulation

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.04.013

兜蘭是蘭科（Orchidaceae）兜蘭屬（ Pfitzer）植物的統(tǒng)稱(chēng)，其顯著特征為唇瓣特化成兜狀或拖鞋狀，頗似女性的拖鞋，故又稱(chēng)為“拖鞋蘭”或者“仙履蘭”等。兜蘭屬植物花型奇特、花色艷麗、花期長(zhǎng)，具有極高的觀賞價(jià)值。目前兜蘭生產(chǎn)已由趣味栽培轉(zhuǎn)為商業(yè)栽培，除了作為高檔盆花廣受人們喜愛(ài)以外，也逐漸進(jìn)入切花市場(chǎng)，兜蘭也將成為繼蝴蝶蘭之后又一需要高技術(shù)、具有高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的花卉代表。由于過(guò)度采集和棲息地的破壞，大部分野生兜蘭處于瀕臨滅絕的困境，所有野生種類(lèi)均被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES）的附錄I中并禁止交易。因此市場(chǎng)上流行的兜蘭大多為人工栽培的雜交種，以斑葉單花魔帝型（Maudiae type）及綠葉單花的復(fù)合雜交品系標(biāo)準(zhǔn)型（Complex type）為主流，多花型兜蘭的數(shù)量較少。但由于雜交種無(wú)菌播種后其后代性狀會(huì)發(fā)生分離，品質(zhì)不穩(wěn)定，花期不一致，難以按計(jì)劃進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，特別是兜蘭的無(wú)性克隆技術(shù)還不成熟，難以獲得遺傳背景一致的商品雜交種用于花期研究，嚴(yán)重阻礙了兜蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，兜蘭規(guī)?；耘喑潭容^低，不同種類(lèi)或品種由于遺傳背景的差異對(duì)環(huán)境條件的要求不同，難以實(shí)行統(tǒng)一的栽培管理方法，盡管已有一些兜蘭栽培和花期調(diào)控研究的報(bào)道，但由于采用傳統(tǒng)蘭花的水肥栽培和自然開(kāi)花的生產(chǎn)模式，尚無(wú)有效且精準(zhǔn)的花期調(diào)節(jié)技術(shù)使其應(yīng)節(jié)開(kāi)花。本文對(duì)兜蘭屬植物生長(zhǎng)習(xí)性、花芽分化和花期調(diào)控技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，參考其他蘭花花期調(diào)控的方法，提出兜蘭屬植物花期調(diào)控的研究方向及建議。

兜蘭的生長(zhǎng)習(xí)性

兜蘭為多年生草本植物，葉近基生，呈2列排列于短縮的莖上，莖下端與短縮的根狀莖相連接。全屬約有109種，主要分布于熱帶亞洲，從印度向東跨越中國(guó)南部到菲律賓和整個(gè)東南亞和馬來(lái)群島新幾內(nèi)亞和所羅門(mén)群島。我國(guó)兜蘭屬植物種質(zhì)資源豐富，主要分布于西南和華南地區(qū)，約有27個(gè)種。大多數(shù)兜蘭屬植物生于地面或積土的巖石表面或巖縫中，較少數(shù)著生于樹(shù)上。兜蘭為典型的合軸（sympodial）生長(zhǎng)方式，每年開(kāi)花前后會(huì)從基部分蘗出新的分蘗芽，分蘗芽進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育并開(kāi)花。其開(kāi)花習(xí)性多樣，在自然光照和溫度的溫室栽培條件下，同色兜蘭（）一年四季都能開(kāi)花，而胼胝兜蘭（）只能在4—5月開(kāi)花，長(zhǎng)瓣兜蘭（）則主要在7—9月開(kāi)花，波瓣兜蘭（）的花期集中于10—12月。

兜蘭的花芽分化

兜蘭屬植物的花序軸一般可著生1～15朵花。多花短瓣組（Sections ）、多花長(zhǎng)瓣組（Sect. ）和多花無(wú)耳組（Sect. ）為多花的總狀花序，通常具3朵或3朵以上花，同時(shí)開(kāi)放或相繼開(kāi)放;其余種常為單花，但所有單花種都孕育有1個(gè)以上敗育花芽在其頂端苞片處，在適宜的條件下，這些花芽也能開(kāi)放形成雙花或多花現(xiàn)象。如白旗兜蘭（）在正常栽培條件下多為單花，偶爾會(huì)出現(xiàn)雙花。

皮秋霞等通過(guò)形態(tài)解剖研究了杏黃兜蘭（）成花的過(guò)程，發(fā)現(xiàn)杏黃兜蘭通常可以分化出2～3朵小花，但往往只有1朵花發(fā)育最早，最終開(kāi)放，其他小花在發(fā)育過(guò)程中停止發(fā)育。通常情況下，杏黃兜蘭產(chǎn)生復(fù)雜花器官所用的時(shí)間僅為半個(gè)月或更短，而從花器官形成至花開(kāi)放，則一般需要6～8個(gè)月左右的時(shí)間，即當(dāng)年9月形成完整花芽，直到次年2—4月花開(kāi)。此外研究發(fā)現(xiàn)杏黃兜蘭的分蘗芽集中于母株開(kāi)花前后出現(xiàn)，母株一般產(chǎn)生1～2個(gè)分蘗芽。從營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分配的角度來(lái)分析，在轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)之前，杏黃兜蘭的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)優(yōu)先分配給母株的營(yíng)養(yǎng)器官（葉片），供其生長(zhǎng)，以同化、積累更多營(yíng)養(yǎng)，至轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)后，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要分配給生殖器官，供其進(jìn)行形態(tài)建成。只有在花已完成生長(zhǎng)或開(kāi)放后，分蘗芽才成為主要的營(yíng)養(yǎng)分配庫(kù)，開(kāi)始迅速生長(zhǎng)分化，長(zhǎng)出母體。CribB認(rèn)為多花花序是杓蘭亞科中較為原始的特征，推測(cè)兜蘭屬植物可能在其進(jìn)化過(guò)程中，不再需要通過(guò)多花表型來(lái)達(dá)到其繁殖的目的，因此其多花總狀花序不斷減退，養(yǎng)分集中于供應(yīng)單朵花的發(fā)育并產(chǎn)生新的分蘗芽，使有性繁殖與無(wú)性繁殖達(dá)到最優(yōu)分配。然而在實(shí)際生產(chǎn)中，往往豐花表型具有更高的商品價(jià)值。陳影通過(guò)對(duì)魔帝兜蘭（Maudiae）實(shí)生苗進(jìn)行赤霉素處理，發(fā)現(xiàn)噴施赤霉素會(huì)出現(xiàn)一梗雙花現(xiàn)象，不同濃度（1、10、50、100 mg/L）處理的魔帝兜蘭，其總雙花率平均達(dá)10%，對(duì)照組無(wú)雙花。另外，在研究中也發(fā)現(xiàn)，大部分兜蘭種類(lèi)開(kāi)花后一般每年只能長(zhǎng)出1個(gè)側(cè)芽用于第2年開(kāi)放，但我們審定的園春兜蘭（× ）、迎春兜蘭（× ）等具有較強(qiáng)的分蘗能力，1個(gè)芽開(kāi)放后能形成2～3個(gè)側(cè)芽，每個(gè)側(cè)芽第2年能開(kāi)花，開(kāi)花數(shù)多。因此，在研究過(guò)程中，一方面可以通過(guò)刺激未完全發(fā)育的小花繼續(xù)發(fā)育出來(lái)，形成一梗雙花或多花實(shí)現(xiàn)豐花表型;另一方面可以通過(guò)雜交育種的手段培育出分蘗能力強(qiáng)的雜交種實(shí)現(xiàn)豐花。

花期調(diào)控技術(shù)

?光照調(diào)控

光在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中極其重要。光質(zhì)、光強(qiáng)與光周期均能影響植物的光合作用進(jìn)而影響植物的正常生長(zhǎng)。在一些蘭科植物中已經(jīng)證明，成花誘導(dǎo)受光周期調(diào)控。Wang等研究認(rèn)為，蝴蝶蘭（）在30℃/20℃（晝/夜）條件下，9 h光照比16 h光照更能有效地促進(jìn)花芽萌發(fā)。Lopez等認(rèn)為在低溫處理之前對(duì)盆栽堇花蘭（）進(jìn)行4周或8周的短日照處理（光照時(shí)間9?h/d），可以極大地促進(jìn)開(kāi)花，開(kāi)花量達(dá)到90%以上，而且出花整齊。然而對(duì)于主要分布在熱帶地區(qū)的兜蘭屬植物而言，光周期對(duì)其花期的影響不顯著。

?溫度調(diào)控

對(duì)于多年生熱帶低地蘭科植物而言，光周期對(duì)其開(kāi)花的影響有限，環(huán)境溫度的變化可能在調(diào)控其花期的過(guò)程中起著更重要的作用。其中蘭科蝴蝶蘭屬（）植物為典型代表，生產(chǎn)上通過(guò)控制溫度調(diào)控花期，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；N植，達(dá)到終年生產(chǎn)的目的。研究表明當(dāng)日溫高于28℃時(shí)，花芽的萌動(dòng)被抑制，使植株保持營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，當(dāng)溫度低于26℃時(shí)，蝴蝶蘭可以完成成花誘導(dǎo)。除蝴蝶蘭外，低溫對(duì)石斛屬（）、美堇蘭屬（）、軛瓣蘭屬（）植物開(kāi)花均有促進(jìn)作用。張嘉滿等對(duì)兜蘭3個(gè)亞屬的8種材料進(jìn)行較為系統(tǒng)的花期調(diào)控研究，分析了日照長(zhǎng)度、日夜溫度和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等因素對(duì)兜蘭開(kāi)花的影響，結(jié)果表明，促進(jìn)兜蘭屬植物開(kāi)花的可能因子，除單花品系之雜交種魔帝型（ Maudiae type）外，主要受溫度的調(diào)控。雜交種 Greyi和Magic Lantern于高溫環(huán)境30℃/25℃下開(kāi)花率為0%，20℃/15℃環(huán)境下均有88%的開(kāi)花率。另外晝/夜溫度25℃/15℃對(duì)原生種李氏兜蘭（）白旗兜蘭紅旗兜蘭（）和秀麗兜蘭（）均有良好的催花效果。對(duì)于兜蘭屬的模式種波瓣兜蘭而言，溫度誘導(dǎo)（thermo-induction）可以有效促進(jìn)其開(kāi)花，即當(dāng)植株持續(xù)暴露在18℃左右的溫度下時(shí)，植株會(huì)無(wú)限期地保持在營(yíng)養(yǎng)階段。然而，如果植物在接近12℃的溫度下有2～3周的溫度誘導(dǎo)期，然后再回到較高的溫度下，在很短的時(shí)間內(nèi)就會(huì)開(kāi)花。另外，Cribb也提出夜溫的顯著降低能促進(jìn)多花的羅氏兜蘭（）提前開(kāi)花。

綜上，結(jié)合兜蘭的原產(chǎn)地來(lái)看，兜蘭屬植物主要分布在熱帶亞洲。其中在馬來(lái)西亞、新加坡和印度尼西亞等地，季節(jié)性的暴風(fēng)雨引起的溫度下降可能是影響兜蘭開(kāi)花的主要因素。因此，可以通過(guò)空調(diào)溫室調(diào)控晝夜溫度或高山催花的方式探索影響兜蘭開(kāi)花的溫度條件。

? 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑調(diào)控

在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，溫度與光照控制具有高消耗、高成本、難度大的特點(diǎn)。而植物激素作為影響植物開(kāi)花的重要因素，外施植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可部分取代光周期與溫度等環(huán)境因子的催花效果，且成本低，易操作，因此應(yīng)用廣泛。通常情況下，對(duì)于蝴蝶蘭屬和石斛屬植物而言，細(xì)胞分裂素刺激開(kāi)花，而生長(zhǎng)素會(huì)抑制細(xì)胞分裂素的作用，赤霉素單獨(dú)應(yīng)用時(shí)效果不明顯，但與細(xì)胞分裂素聯(lián)合使用時(shí)效果略有提高。雖然赤霉素?zé)o法誘導(dǎo)開(kāi)花，但外施赤霉素可以逆轉(zhuǎn)蝴蝶蘭高溫下無(wú)法開(kāi)花的表型，但會(huì)造成花朵畸形。細(xì)胞分裂素與赤霉素聯(lián)合使用，可改善畸形的發(fā)生。李秀玲等以帶葉兜蘭（P. hirsutissimum）和同色兜蘭為試驗(yàn)材料，研究了2種兜蘭在不同發(fā)育時(shí)期葉片中內(nèi)源激素變化與開(kāi)花的關(guān)系，結(jié)果表明，從大苗期到現(xiàn)葶期，帶葉兜蘭葉片中玉米素（ZT）含量顯著降低，GA和生長(zhǎng)素（IAA）含量顯著升高。而同色兜蘭葉片中GA、脫落酸（ABA）和IAA的含量均下降，玉米素核苷（ZR）含量無(wú)明顯變化;從現(xiàn)葶期到初花期，帶葉兜蘭葉片中ZT的含量直線上升，GA的含量先降低后上升，IAA的含量急劇上升，GA/IAA的比值持續(xù)下降。同色兜蘭葉片中ZR含量呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)，GA的含量變化不大，IAA和ABA含量先下降后上升，GA/IAA的比值持續(xù)上升。兜蘭從大苗期到現(xiàn)葶期，完成了從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變。從現(xiàn)葶期到初花期，涉及了花序和花器官的進(jìn)一步發(fā)育。不同種兜蘭其內(nèi)源激素水平與其花芽分化的關(guān)系不盡相同。同色兜蘭是兜蘭屬中較易種植、較易開(kāi)花的種，一年四季都能開(kāi)花，通常具1～2朵花，少數(shù)具3朵花。帶葉兜蘭為兜蘭屬中典型的春花型兜蘭，于每年春季4—5月開(kāi)花，通常單花。對(duì)于春花型帶葉兜蘭而言，現(xiàn)葶期葉片中GA含量（36.95?μg/g）顯著高于大苗期GA含量（6.19?μg/g），說(shuō)明帶葉兜蘭花朵形態(tài)建成需要更高水平的GA含量。對(duì)比雙花同色兜蘭和單花帶葉兜蘭從現(xiàn)葶期到初花期葉片中激素含量的變化趨勢(shì)發(fā)現(xiàn)，兜蘭葉片中GA和IAA的含量可能影響了花序的進(jìn)一步發(fā)育，進(jìn)而決定了開(kāi)花數(shù)量和花朵品質(zhì)。赤霉素對(duì)于兜蘭屬植物抽梗開(kāi)花有促進(jìn)作用，但不同種對(duì)赤霉素的濃度要求不同。陳俊成使用赤霉素GA與GA，可誘導(dǎo)Maudiae type開(kāi)花，濃度以100 mmol/L的效果最好，但使用赤霉素會(huì)造成花梗不正常彎曲，整體花型不對(duì)稱(chēng)，上萼片內(nèi)卷，形狀變狹長(zhǎng)，花瓣卷曲，子房變長(zhǎng)等畸形花問(wèn)題。Miguel等對(duì)4年生未開(kāi)花的雜交種實(shí)生苗（Macabre × ）進(jìn)行噴施GA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，866 mmol/L GA使開(kāi)花率達(dá)到100%，并導(dǎo)致花序伸長(zhǎng)。蕭元川研究了GA與BA對(duì)多花與單花組合形成的雜交品種（ ×Somers Isles）的影響，發(fā)現(xiàn)125 mmol/L GA可明顯促進(jìn)開(kāi)花，BA在開(kāi)花起始階段與GA產(chǎn)生拮抗作用，但對(duì)花序發(fā)育則具有協(xié)同作用，并提出GA可能通過(guò)改變植物碳水化合物的代謝與分配從而促進(jìn)開(kāi)花的啟動(dòng)。

綜上所述，由于兜蘭花發(fā)育進(jìn)程時(shí)間長(zhǎng)，難以明確其關(guān)鍵發(fā)育時(shí)間節(jié)點(diǎn)，需進(jìn)一步明確兜蘭花芽分化的解剖顯微過(guò)程，探索影響兜蘭花芽分化的關(guān)鍵激素。目前可以確定赤霉素可以促進(jìn)兜蘭提前開(kāi)花，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

?營(yíng)養(yǎng)調(diào)控

陳影研究了不同比例氮、磷、鉀含量的花肥和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理對(duì)魔帝兜蘭（Maudiae）花期的影響，結(jié)果表明噴施花多多2號(hào)高磷肥和花多多11號(hào)高鉀肥能促進(jìn)開(kāi)花，施肥處理對(duì)魔帝兜蘭花朵形態(tài)無(wú)顯著影響。Wathanasakun- ek研究了不同的栽培基質(zhì)與鈣肥對(duì)兜蘭開(kāi)花的影響，結(jié)果表明樹(shù)皮混合水苔以及顆粒海綿（granulate sponge）的組合栽培基質(zhì)在促進(jìn)花朵數(shù)量方面明顯優(yōu)于單一的樹(shù)皮栽培基質(zhì)，另外300?mmol/L鈣肥處理后產(chǎn)生較多花朵。

分子生物學(xué)研究進(jìn)展

近年來(lái)，組學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展大大推動(dòng)了蘭科植物開(kāi)花相關(guān)分子機(jī)制的研究。目前已有7個(gè)蘭科植物種類(lèi)完成了全基因組測(cè)序，分別是深圳擬蘭（）鐵皮石斛（， ）鼓槌石斛（）、小蘭嶼蝴蝶蘭（）、香子蘭（）和墨蘭（Cymbidium sinense）。另外，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以全面快速地獲取特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息。目前，借助二代測(cè)序技術(shù)，對(duì)蘭科植物開(kāi)展了大量的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組分析，篩選差異表達(dá)基因，有助于更好地了解復(fù)雜開(kāi)花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)新的開(kāi)花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步深入挖掘蘭科植物開(kāi)花相關(guān)特異性關(guān)鍵基因提供重要參考。通常情況下，對(duì)于石斛屬植物，低溫與細(xì)胞分裂素均能誘導(dǎo)其開(kāi)花。為探究春化和細(xì)胞分裂素信號(hào)通路在開(kāi)花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)系，Wen等通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組研究了對(duì)照組、冷處理組和細(xì)胞分裂素處理組間的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)低溫促進(jìn)細(xì)胞分裂素信號(hào)通路上關(guān)鍵基因的表達(dá)，且低溫與細(xì)胞分裂素處理均能觸發(fā)（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1）（LEAFY）（APETALA1）和赤霉素信號(hào)通路關(guān)鍵基因顯著上調(diào)，說(shuō)明低溫、細(xì)胞分裂素和赤霉素信號(hào)通路相互作用共同調(diào)控石斛屬植物開(kāi)花。低溫同樣能促進(jìn)蝴蝶蘭屬植物開(kāi)花，Huang等對(duì)低溫和高溫處理的蝴蝶蘭植物腋芽的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析和比較，發(fā)現(xiàn)低溫誘導(dǎo)赤霉素合成基因的表達(dá)，說(shuō)明在低溫條件下，赤霉素通路可能也在蝴蝶蘭花期調(diào)控中發(fā)揮重要作用。與石斛和蝴蝶蘭相反，文心蘭屬（）植物通常在高溫（30℃）條件下完成成花轉(zhuǎn)變。通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫環(huán)境下，氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡可能是誘導(dǎo)文心蘭在高溫環(huán)境下開(kāi)花的內(nèi)源性信號(hào)之一。因此，不同的蘭科植物進(jìn)化出與其生長(zhǎng)環(huán)境相關(guān)的特異性花期調(diào)控機(jī)制，多種花期調(diào)控信號(hào)通路相互作用共同調(diào)控植物完成成花轉(zhuǎn)變。同時(shí)，越來(lái)越多與蘭科植物開(kāi)花相關(guān)的關(guān)鍵開(kāi)花基因被挖掘，Wang等綜述了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)蘭花開(kāi)花基因的研究進(jìn)展。

兜蘭屬植物由于其材料自身的局限性，其開(kāi)花相關(guān)分子機(jī)制研究進(jìn)展較慢。王燕君等利用SMART策略構(gòu)建了硬葉兜蘭花芽的抑制性消減雜交（SSH）文庫(kù)，得到了18條差異表達(dá)片段，通過(guò)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因含有多個(gè)轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的同源基因，可能參與硬葉兜蘭的花發(fā)育調(diào)控過(guò)程。李冬梅等從同色兜蘭中分離了花器官發(fā)育相關(guān)的2個(gè)MADS-box基因和。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)、蛋白結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，和分別屬于B類(lèi)MADS-box蛋白家族的AP3和PⅠ亞家族。表達(dá)分析顯示，和在花芽發(fā)育中均有表達(dá)，在成熟花、唇瓣和花瓣中的表達(dá)量高，在蕊柱、萼片、苞葉和根中次之，在花莖和葉中較低，在子房中幾乎不表達(dá);在各組織中均有不同豐度的表達(dá)。通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)，已對(duì)杏黃兜蘭的成熟花芽進(jìn)行測(cè)序，能為兜蘭的分子生物學(xué)提供信息。然而，僅從一個(gè)物種和一個(gè)發(fā)育階段獲得花芽的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。因此，來(lái)自不同種類(lèi)和發(fā)育階段的花芽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)將有助于獲得更全面的數(shù)據(jù)資源和深入了解兜蘭的開(kāi)花機(jī)制。LI等利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)同色兜蘭、硬葉兜蘭和2個(gè)常見(jiàn)的栽培品種‘紅魔帝’（ Red Maudiae）和‘綠魔帝’（Green Maudiae）的混合花芽分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在對(duì)高溫途徑相關(guān)基因進(jìn)行同源序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)基因只存于高溫下開(kāi)花的兜蘭中，推測(cè)在部分兜蘭中基因?qū)ο?秋開(kāi)花型兜蘭有正向調(diào)節(jié)作用。另外和可能是調(diào)節(jié)兜蘭成花（大小和結(jié)構(gòu)）和開(kāi)花時(shí)間的關(guān)鍵基因。

鎖定關(guān)鍵開(kāi)花基因后，需要對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證。與模式植物擬南芥不同，蘭科植物為單子葉植物，具有基因組大、轉(zhuǎn)化效率低、再生周期長(zhǎng)、生長(zhǎng)緩慢的特點(diǎn)。因此，常通過(guò)在擬南芥、水稻或煙草中異源表達(dá)相關(guān)基因的方式間接驗(yàn)證基因的功能。另外，病毒誘導(dǎo)的基因沉默及轉(zhuǎn)基因技術(shù)是通過(guò)反向遺傳學(xué)的方式研究蘭花基因功能的有效途徑。目前在重要商品蘭花，如蝴蝶蘭與石斛中形成了較為成熟的功能基因驗(yàn)證方法。Hsieh等報(bào)道了一種利用大花蕙蘭花葉病毒（CymMV）作為沉默載體，通過(guò)農(nóng)桿菌侵染花序或葉片，誘導(dǎo)蝴蝶蘭基因沉默的優(yōu)化方法，并成功沉默和等基因，誘導(dǎo)顯著的表型，其沉默效率高達(dá)95.8%。隨后，Jang等運(yùn)用該方法成功驗(yàn)證了敲除蝴蝶蘭植株的表型。組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，將有助于蘭花基因的功能研究和具有商業(yè)價(jià)值性狀的蘭花基因工程。由于蝴蝶蘭與石斛均具備了成熟的組培再生體系，借助組織培養(yǎng)技術(shù)，Hsing等以蝴蝶蘭原球莖為受體材料，優(yōu)化了一種高效可遺傳的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得了大約1.2%～5.2%的轉(zhuǎn)化率。CHAI等以石斛愈傷組織為受體材料，利用L-methionine sulfoximine（MSO）作為選擇劑，優(yōu)化了一種高效的基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。該體系已成功應(yīng)用于過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因石斛蘭品系的建立。

然而，相較于蝴蝶蘭與石斛屬植物，兜蘭屬植物開(kāi)花相關(guān)基因的研究起步較晚，遺傳轉(zhuǎn)化體系尚不成熟。近年來(lái)，兜蘭屬植物非共生萌發(fā)離體快繁技術(shù)體系不斷取得新的突破，為建立兜蘭屬植物遺傳轉(zhuǎn)化奠定了一定基礎(chǔ)。一些兜蘭種子在經(jīng)非共生萌發(fā)產(chǎn)生原球莖后，通過(guò)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的調(diào)控可以通過(guò)原球莖誘導(dǎo)出愈傷組織或類(lèi)原球莖完成再生過(guò)程，通過(guò)成熟的愈傷組織或類(lèi)原球莖再生體系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。張莉以魔帝兜蘭的原球莖為受體材料，利用農(nóng)桿菌子房注射法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法對(duì)魔帝兜蘭遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行了初步探究。研究發(fā)現(xiàn)利用農(nóng)桿菌子房注射法轉(zhuǎn)化魔帝兜蘭的最佳注射時(shí)間為授粉后48～53 d，證實(shí)最佳注射時(shí)間為魔帝兜蘭的受精時(shí)間。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)法中，對(duì)原球莖進(jìn)行針刺處理可以最大限度地獲得抗性受體材料，抗性受體材料的獲得率高達(dá)4.17%;用農(nóng)桿菌侵染液侵染受體材料20 min時(shí)獲得率最高，為5.00%;侵染后受體材料最合適的共培養(yǎng)時(shí)間為3 d，其獲得率為4.17%;在共培養(yǎng)基內(nèi)添加200 μmol/L AS的轉(zhuǎn)化效率為5.83%，均高于其他濃度的轉(zhuǎn)化率。另外在基因槍介導(dǎo)法中發(fā)現(xiàn)，在基因槍轟擊前對(duì)受體材料進(jìn)行甘露醇高滲處理，含0.3 mmol/L甘露醇的高滲培養(yǎng)基的獲得率高達(dá)6.67%;利用直徑為0.6?μm的金粉在9?cm的轟擊距離下進(jìn)行轟擊的獲得率最佳;轟擊后的受體材料在恢復(fù)培養(yǎng)基下培養(yǎng)20 d后再進(jìn)行篩選培養(yǎng)的獲得率最高。LUO等通過(guò)激光共聚焦顯微鏡對(duì)魔帝兜蘭的胚胎發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了顯微觀察，發(fā)現(xiàn)其在受粉后40～45 d是受精期，在此期間進(jìn)行子房注射能獲得較高的轉(zhuǎn)化率，最高可達(dá)2.54%。為了更好地了解兜蘭屬植物基因的功能，加速兜蘭分子育種研究，需要繼續(xù)探索適合兜蘭屬植物更可靠、更穩(wěn)定、更高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

近年來(lái)，新的分子工具不斷涌現(xiàn)，為植物定向分子育種提供了強(qiáng)有力的技術(shù)保障。通常，兜蘭屬等多年生植物通過(guò)傳統(tǒng)雜交育種的方式獲得多個(gè)優(yōu)良性狀集于一體的雜交組合的效率較低?；蚓庉嫾夹g(shù)如CRISPR-Cas9為獲得非模式生物的無(wú)效突變體（null mutation）和多點(diǎn)突變體（multiple mutant）提供了一個(gè)便捷的工具。這一技術(shù)的出現(xiàn)不僅有助于蘭花分子遺傳學(xué)研究，而且有助于通過(guò)靶向基因編輯產(chǎn)生具有各種優(yōu)良性狀的新型蘭花品種。目前，在小蘭嶼蝴蝶蘭中，已成功利用CRISPR/Cas9獲得了MADS基因（、和）的多點(diǎn)突變體，三重突變率高達(dá)97.9%。同時(shí)還獲得了單突變體和雙突變體以了解不同基因突變對(duì)花發(fā)育的影響。今后，借助新型分子技術(shù)的發(fā)展，兜蘭屬植物的基因編輯技術(shù)也將日漸成熟，花期調(diào)控研究也將更加深入和全面。另外，近些年表觀遺傳（DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA、染色質(zhì)重塑）與開(kāi)花途徑間的機(jī)理研究越來(lái)越深入，尤其是表觀調(diào)控在春化途徑（vernalization pathway）和年齡途徑（age pathway）中發(fā)揮著重要作用。是春化途徑調(diào)控?cái)M南芥開(kāi)花的關(guān)鍵調(diào)控因子，春化對(duì)表達(dá)抑制的維持主要是通過(guò)與位點(diǎn)結(jié)合的非編碼RNA（和）的表達(dá)和基因上組蛋白修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中植物多梳蛋白抑制復(fù)合體（polycomb repressive complex2， PRC2）以及PRC1-like復(fù)合物起著重要作用。年齡途徑中短鏈（20～24個(gè)核苷酸）非編碼RNA（micRNA）miR156、miR172及其靶基因SPLs組成年齡途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子，確保植物在非誘導(dǎo)條件下開(kāi)花。兜蘭屬植物為無(wú)限的總狀花序，外界環(huán)境因素極大地影響其開(kāi)花數(shù)量與花朵品質(zhì)。如單花的麻栗坡兜蘭（）和杏黃兜蘭（）在適宜的環(huán)境條件下甚至能開(kāi)出3～4朵花。表觀遺傳調(diào)控極有可能參與其成花誘導(dǎo)，影響其開(kāi)花。目前尚未發(fā)現(xiàn)通過(guò)表觀遺傳修飾調(diào)控兜蘭花期的研究。在其他觀賞植物如菊花、杜鵑花和矮牽牛中均發(fā)現(xiàn)，使用DNA甲基化抑制劑處理植株后，花期提前。說(shuō)明去甲基化能調(diào)控開(kāi)花基因的表達(dá)，促進(jìn)提前開(kāi)花。因此，在兜蘭屬植物中可以嘗試進(jìn)一步探究表觀遺傳修飾模式如DNA甲基化水平、組蛋白修飾的類(lèi)型和非編碼RNA的種類(lèi)的改變對(duì)其開(kāi)花的影響。

問(wèn)題與展望

綜上所述，兜蘭屬植物花期調(diào)控研究進(jìn)展較為緩慢主要原因有以下幾點(diǎn)：（1）材料自身的局限性。由于兜蘭在自然界繁殖難度大，難以獲得足夠數(shù)量的原生種用于研究，特別是兜蘭屬所有野生種類(lèi)均被列入CITES的附錄I后更不可能獲得;其次，利用無(wú)菌播種生產(chǎn)出的原生種實(shí)生苗從出瓶到開(kāi)花，一般需要2～6 a時(shí)間，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，同時(shí)，由于其抗性較差，較少應(yīng)用于商品化規(guī)模生產(chǎn)。（2）種間差異大，開(kāi)花習(xí)性多樣。例如，在自然光照和溫度下進(jìn)行溫室栽培，同色兜蘭一年四季都能開(kāi)花，而帶葉兜蘭只能在4—5月開(kāi)花。我國(guó)華南地區(qū)栽培的兩大流行品種‘紅魔帝’和‘綠魔帝’一年四季開(kāi)花，但其遺傳背景不一致，不是理想的花期調(diào)控研究材料。（3）缺乏參考基因組序列信息。借助轉(zhuǎn)錄組研究，雖然能加快探究兜蘭開(kāi)花分子機(jī)制的步伐，但由于缺乏參考基因組，采用從頭組裝的方式進(jìn)行組裝的序列信息，注釋較差，大部分序列不具有全長(zhǎng)cDNA特征，因此后期進(jìn)行基因功能研究難度較大。（4）尚未建立成熟的組織培養(yǎng)體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系。由于兜蘭雜交種具有豐富的花型、花色和較好抗性等雜種優(yōu)勢(shì)，目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的兜蘭多為雜交種，但采用雜交種為親本的同一雜交組合的實(shí)生苗，個(gè)體生長(zhǎng)習(xí)性具有巨大的差異，花期也不一致，如魔帝類(lèi)兜蘭的雜交后代，不但花色變化極大，花期也極不一致，大部分組合的雜交后代一年四季均可開(kāi)花，因此在開(kāi)展花期試驗(yàn)時(shí)難以獲得足夠數(shù)量遺傳背景一致的材料用于花期調(diào)控研究。

針對(duì)上述問(wèn)題，利用組織培養(yǎng)建立兜蘭快繁體系獲得足夠數(shù)量且品質(zhì)均一的組培苗是花期調(diào)控研究的關(guān)鍵，華南植物園在兜蘭屬植物組織培養(yǎng)方面取得了較好的進(jìn)展，已成功建立了魔帝類(lèi)兜蘭組織培養(yǎng)技術(shù)體系并生產(chǎn)出大量的試管苗，可用于花期調(diào)控研究。另外，近年來(lái)隨著第3代測(cè)序技術(shù)的成熟和成本的大幅降低，借助太平洋生物科學(xué)公司（Pacific Biosciences， Pac Bio）的單分子實(shí)時(shí)（single-molecule real-time， SMRT）測(cè)序技術(shù)或牛津納米孔技術(shù)公司（Oxford Nanopore Technologies， ONT）的單分子納米孔測(cè)序技術(shù)，采用三代聯(lián)合二代的測(cè)序策略，可以獲得具有更高可信度的差異表達(dá)分析和數(shù)據(jù)發(fā)掘結(jié)果，有效彌補(bǔ)了二代測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)的大部分序列不具有全長(zhǎng)cDNA特征的缺點(diǎn)，有助于功能基因的克隆和功能驗(yàn)證，也能更有效地開(kāi)展兜蘭花期調(diào)控等相關(guān)分子機(jī)制研究。

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