劉文靜　胡文彬　周政　劉燁　趙正洪　徐慶國(guó)

摘? 要：香味是影響稻米品質(zhì)的一個(gè)重要性狀，Badh2基因突變是水稻產(chǎn)生香味的主要原因，水稻香味產(chǎn)生主要有Badh2基因第2、4、5、7、8外顯子突變類(lèi)型，其中研究最多的是第7外顯子突變類(lèi)型。為了提高水稻香味性狀檢測(cè)的準(zhǔn)確性、安全性和效率，本研究根據(jù)水稻Badh2基因突變（第7外顯子8 bp缺失、3 bp突變）的序列設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了3條分子標(biāo)記引物，分別命名為Fgr-FF、Fgr-NF和Fgr-R，利用該三引物分子標(biāo)記法可準(zhǔn)確擴(kuò)增出Badh2第7外顯子突變基因，并鑒定其純雜合情況。本標(biāo)記利用PCR擴(kuò)增中引物5?端保守性差的特點(diǎn)，將31 bp外源DNA序列添加至Fgr-NF引物的5?端，將Badh2基因第7外顯子突變類(lèi)型的非香型和香型特征條帶差異由8 bp擴(kuò)大至41 bp，通過(guò)瓊脂糖凝膠就能準(zhǔn)確、清晰、快速地檢測(cè)出水稻植株中香味基因的純合、雜合和無(wú)3種基因型。利用該三引物分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增結(jié)果表明：該標(biāo)記在香型水稻中擴(kuò)增出一條115 bp的特征條帶，在非香型水稻中擴(kuò)增出一條156 bp的特征條帶，而在雜合型水稻中能同時(shí)擴(kuò)增出115 bp和156 bp兩條特征條帶。本研究利用該三引物功能標(biāo)記對(duì)30個(gè)水稻品種香味基因型進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)出香味純合植株9株，非香純合植株20株，該檢測(cè)結(jié)果與2種表型鑒定結(jié)果相符;雜合植株1株，這是由于水稻香味基因是隱性基因，雜合型水稻葉片表現(xiàn)為非香，部分籽粒表現(xiàn)為香;使用傳統(tǒng)的香味鑒定方法容易對(duì)香味雜合型水稻產(chǎn)生誤判，而通過(guò)基因檢測(cè)結(jié)果和表型驗(yàn)證表明新開(kāi)發(fā)香味三引物功能標(biāo)記準(zhǔn)確可靠;利用三引物功能標(biāo)記對(duì)94個(gè)F₂代單株的香味基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)出香味純合植株23株，非香純合植株44株，雜合植株27株，符合1∶2∶1孟德?tīng)栠z傳的分離比例。該研究既避免了水稻香味鑒定與檢測(cè)中KOH法和咀嚼法的主觀誤差，也解決了聚丙烯酰胺凝膠電泳的毒性強(qiáng)、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題，大幅度地提高了香型水稻品種的選擇效率。

關(guān)鍵詞：水稻;香味基因;分子標(biāo)記中圖分類(lèi)號(hào)：S511.2 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Development and Application of a New Functional Marker of Fragrant Gene in Rice （Oryza sativaL.）

LIU Wenjing HU Wenbin ZHOU Zheng LIU Ye ZHAO Zhenghong XU Qingguo

1. Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China; 2. Hunan Rice Research Institute， Changsha， Hunan 410125， China; 3. State Key Laboratory of Hybrid Rice， Changsha， Hunan 410125， China

Abstract： Fragrance is an important trait which affects the quality of rice. The mutation ofBadh2 is the main contribution of fragrance in rice， and there are mainly several types of exon mutation， such as the second exon， the fourth exon， the fifth exon， the seventh exon and the eighth exon ofBadh2， and the mutation of the seventh exon is the most studied one. In order to improve the accuracy， safety and efficiency of rice fragrant detection， the molecular marker with three primers （3-primer marker）was designed based on the mutation of the seventh exon ofBadh2 （eight bp deletion and three bp mutation）， and three primers were named Fgr-FF， Fgr-NF and Fgr-R respectively. The mutation of the seventh exon ofBadh2could be detected accurately by the three3-primers molecular marker， and the homozygous and heterozygous of fragrant rice were identified. This marker took advantage of the poor conservation of the 5'end of primers in polymerase chain reaction （PCR）， added the 31 bp exogenous deoxyribonucleic acid （DNA） to the 5'end of the primer Fgr-NF. This marker enlarged the differences of length between the non-fragrant and fragrant bands of PCR from 8 bp to 41 bp， and the homozygous， heterozygous and non-fragrant genotypes of rice could be accurately， clearly and quickly detected by agarose gel electrophoresis. The results of PCR amplification with the three-primer marker indicated that： 115 bp DNA fragment in the fragrant rice， 156 bp DNA fragment in the non-fragrant rice， both 115 bp and 156 bp DNA fragments in the heterozygous rice. The 30 rice varieties were detected by the 3-primer marker. And the results showed that： there were nine fragrant homozygous genotype varieties and twenty non-fragrant homozygous genotype varieties， which were consistent with the two phenotypic identification methods， KOH method and chewing method. There was one heterozygous genotype variety， and its genotype identification results was inconsistent with the phenotypic identification results， because the fragrant gene of rice was recessive gene， the leaves of heterozygous rice were non-fragrant， while some grains were fragrant. The traditional fragrant identification methods were easy to misjudge the fragrance of heterozygous rice. However， These results of gene detection and phenotypic verification showed that the 3-primer marker designed by this study was accurate and reliable. The 94 individual plants from F₂generation were detected by the 3-primer marker， and the results also showed that there were 23 fragrant homozygous plants， 44 non-fragrant homozygous plants and 27 heterozygous plants， which accorded with the 1∶2∶1 ratio of Mendelian genetic law. This study not only excluded the subjective error of KOH method and chewing method， but also avoided the toxicity and time consuming of polyacrylamide gel electrophoresis， and greatly improved the breeding efficiency of fragrant rice varieties.

Keywords： rice; fragrant gene; molecular marker

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.04.003

香味是水稻品質(zhì)的一個(gè)重要性狀^[1]，具有香味的稻米深受消費(fèi)者喜愛(ài)^[2-3]，價(jià)格也比普通大米高^[4-5]。香稻不僅品種多，而且類(lèi)型復(fù)雜。為了進(jìn)一步了解香稻香味的形成原因，早在20世紀(jì)80年代，研究人員就對(duì)水稻香味的成分、形成機(jī)理和遺傳特點(diǎn)開(kāi)展研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香稻含有200多種香味物質(zhì)，但與水稻香味直接相關(guān)的是2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrrolin， 2-AP）^[6-8]，而2-AP的含量與水稻香味基因Badh2有關(guān)^[9]。BARDBURY等^[9]通過(guò)分析水稻DNA序列發(fā)現(xiàn)，Badh2基因在香型水稻和非香型水稻間有很明顯的差異，并認(rèn)為Badh2基因突變是水稻香味形成的主要基因。SHI等^[10]通過(guò)對(duì)24份香稻材料測(cè)序發(fā)現(xiàn)，與非香型水稻相比，香型水稻Badh2基因的第2外顯子存在7個(gè)堿基缺失。CHEN等^[11]分析了香味形成的3個(gè)候選基因，發(fā)現(xiàn)只有Badh2基因與水稻香味有關(guān)。已有大量研究表明，位于水稻第8號(hào)染色體上的Badh2基因編碼甜菜堿醛脫氫酶（betaine aldehyde dehydrogenase homologue 2， BADH2），Badh2基因的突變或者缺失，可引起甜菜堿醛脫氫酶減少甚至消失，造成作用底物2-AP代謝途徑中斷，以致2-AP前體物增加，進(jìn)而2-AP在水稻中不斷累積，產(chǎn)生香味^[12-17]。

在香稻新品種育種中，研究人員常采用熱水法^{[5， 18]}、KOH法^[19]、咀嚼法^[20]和儀器測(cè)定法^[21-22]等進(jìn)行香味鑒定，這些方法主觀影響大、準(zhǔn)確性低、重復(fù)性差、效率不高。如何高效、安全、準(zhǔn)確地鑒定水稻香味成為育種工作者急需解決的問(wèn)題。隨著香味基因的發(fā)現(xiàn)，分子標(biāo)記逐漸成為香味檢測(cè)的重要手段。本研究通過(guò)分析水稻中Badh2基因第7外顯子突變基因序列，同時(shí)利用PCR引物5?端保守性差的特點(diǎn)，引入外源DNA序列，擴(kuò)大片段大小差異，從而設(shè)計(jì)出通過(guò)普通PCR和瓊脂糖凝膠就能分辨出香味基因的純合、雜合和無(wú)3種狀態(tài)的分子標(biāo)記，為今后水稻香味基因分子標(biāo)記輔助選擇提供支持。

1 ?材料與方法

1.1? 材料

本研究選用了124個(gè)水稻材料品種或種質(zhì)材料，其中常規(guī)水稻品種27個(gè)，雜交水稻品種3個(gè)，‘湘晚秈13號(hào)ב谷梅4號(hào)的F₂代單株材料94個(gè)。所有供試材料均于2019年6—11月種植在湖南省長(zhǎng)沙市高橋基地，采用起壟濕潤(rùn)育秧，人工移栽，移栽規(guī)格20 cm×20 cm，1粒谷/蔸，常規(guī)水肥管理和病蟲(chóng)防治。所用試劑均購(gòu)自于北京聚合美生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1? 水稻香味鑒定? 分蘗盛期，采用KOH浸泡法鑒定葉片的香味情況，具體操作：分別取約2?g的新鮮葉片，剪碎放入20?mL離心管中，然后加入1.7% KOH溶液10?mL并立即蓋上蓋子，室溫下放置10?min，打開(kāi)瓶蓋由3人輪流聞香味的有無(wú)^{[19， 23-24]};每個(gè)材料重復(fù)5次。成熟后，采用咀嚼法鑒定種子的香味情況，具體操作：隨機(jī)取曬干種子15粒，人工一粒一粒放入嘴里慢慢嚼碎，然后吸一口氣，讓氣流通過(guò)鼻子呼出，判斷米粒香味情況;咀嚼每一粒之后用純凈水漱口。若米粒全無(wú)香味，則判定該材料為非香型;若米粒全有香味，則判定該材料為香型;若同時(shí)存在香型和非香型2種情況，則判定該材料屬于雜合型^{[20， 23-24]}。

1.2.2 ?分子標(biāo)記 ?通過(guò)NCBI（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/gene/4345606）獲得Badh2基因的全序列;根據(jù)該基因第7外顯子的突變序列特征，同時(shí)結(jié)合PrimerPremier 5.0軟件：在突變位點(diǎn)處設(shè)計(jì)1條香型正向引物和1條非香型正向引物，在突變位點(diǎn)下游設(shè)計(jì)1條共用反向引物;3條引物擴(kuò)增的DNA片段均控制在200 bp以?xún)?nèi);在非香型正向引物中加入31 bp T-DNA序列，擴(kuò)大香型和非香型擴(kuò)增產(chǎn)物差異。

1.2.3? DNA提取、PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)? 采用CTAB法（十六烷基三甲基溴化銨法）提取水稻葉片DNA^[25]。PCR反應(yīng)體系：總體積為20 μL，其中10×PCR Buffer 2.0 μL，10 mmol/L dNTPs 2.0?μL，10 μmol/L引物Fgr-FF和Fgr-R各0.4 μL，10 μmol/L引物Fgr-NF 1 μL，5 U/μLTaq DNA聚合酶0.2 μL，ddH₂O 13 μL， DNA模板1 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min;95℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，共34個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min，?20℃保存。

電泳檢測(cè)：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)（W/V）為2.5%～3.0%瓊脂糖凝膠，按體積比1∶10000（Gelred：瓊脂糖凝膠）加入無(wú)毒染料Gelred，7 V/cm電泳30?min;電泳完成后，拍照保存。

2? 結(jié)果與分析

2.1 水稻香味基因三引物功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

根據(jù)水稻Badh2基因第7外顯子突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)了非香型正向引物CTGGTAAAAAGATTATG GCTTCAG、香型正向引物CTGGTATATATTTC AGCTG（Fgr-FF）和共用反向引物AGAAAAGG ACAACATTGAGA（Fgr-R），引物位置見(jiàn)圖1;再利用PCR擴(kuò)增中引物5?端保守性差的特點(diǎn)，將來(lái)源于農(nóng)桿菌T-DNA的DNA序列ACAGGATTC AATCTTAAGAAACTTTATTGCC（31 bp）添加至非香型正向引物的5?端，即ACAGGATTCAAT CTTAAGAAACTTTATTGCCCTGGTAAAAAGATTATGGCTTCAG（Fgr-NF），構(gòu)成香味檢測(cè)的三引物功能標(biāo)記。該標(biāo)記（Fgr-NF、Fgr-FF和Fgr-R）在香味純合植株中，能擴(kuò)增出115 bp特異條帶;在非香型植株中能擴(kuò)增出156 bp特異條帶;在雜合植株中能同時(shí)擴(kuò)增出115?bp和156 bp特征條帶。新設(shè)計(jì)的香味標(biāo)記中，擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)多余條帶，且特異條帶差異達(dá)41 bp，通過(guò)瓊脂糖凝膠就能準(zhǔn)確清晰地檢測(cè)出水稻香、非香及雜合3種狀態(tài)，提高了香味檢測(cè)的準(zhǔn)確性和效率。

2.2 水稻香味基因三引物功能標(biāo)記的應(yīng)用與驗(yàn)證

2.2.1? 不同品種水稻的香味基因檢測(cè) ?為了驗(yàn)證新標(biāo)記的準(zhǔn)確性，采用香味三引物功能標(biāo)記對(duì)30個(gè)水稻品種葉片香味基因進(jìn)行檢測(cè)（圖2），然后采用KOH法和咀嚼法分別對(duì)葉片和籽粒的香味情況進(jìn)行驗(yàn)證。由圖2可看出，材料1、2、8等9個(gè)品種均擴(kuò)增出115 bp的香型特征條帶，且這9個(gè)品種的籽粒和葉片均為香（表1）;材料3、

4、5等20個(gè)品種均擴(kuò)增出156 bp的非香型特征條帶，且這20個(gè)品種的籽粒和葉片均為非香（表1）;材料11為雜交稻，同時(shí)擴(kuò)增出115 bp和156 bp特征條帶，葉片表現(xiàn)為非香，部分籽粒表現(xiàn)為香（表1）;雜交稻的2種表型鑒定結(jié)果不一致，由于水稻香味基因?yàn)殡[性基因^{[12， 14]}，雜合型植株的香味性狀發(fā)生分離，既有香型，也有非香型。通過(guò)基因檢測(cè)結(jié)果和表型驗(yàn)證可發(fā)現(xiàn)，新開(kāi)發(fā)香味三引物功能標(biāo)記準(zhǔn)確可靠，能滿(mǎn)足香稻品種培育的要求。

2.2.2 ?水稻不同F(xiàn)₂代株系的香味基因檢測(cè)? 利用三引物功能標(biāo)記對(duì)94個(gè)單株的葉片香味進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖3，編號(hào)4、12、13等23個(gè)單株均擴(kuò)增出115 bp的特征條帶，且這23個(gè)單株的籽粒和葉片均為香（表2）;編號(hào)2、7、8等27個(gè)材料均擴(kuò)增出156 bp的特征條帶，且這27個(gè)單株的籽粒和葉片均為非香（表2）;編號(hào)1、3、5等44個(gè)單株同時(shí)擴(kuò)增出115 bp和156 bp特征條帶，這44個(gè)單株的葉片表現(xiàn)為非香，部分籽粒表現(xiàn)為香（表2）。94個(gè)F₂代單株是‘湘晚秈13號(hào)（香）與‘谷梅4號(hào)（不香）雜交植株F₁的自交種子，通過(guò)三引物功能標(biāo)記檢測(cè)，結(jié)果發(fā)

現(xiàn)香味純合植株有23株，非香純合植株有44株，雜合植株有27株，符合1∶2∶1分離比例;并且基因雜合植株葉片不香，部分籽粒香的特征，進(jìn)一步表明香味基因是典型的隱性基因。

3 ?討論

水稻Badh2基因的缺失和變異導(dǎo)致2-AP積累，產(chǎn)生香味，但外界環(huán)境如溫度、土壤等因素影響著水稻香味的濃度^{[15， 26]}。魏曉東等^[27]在研究遺傳與環(huán)境對(duì)水稻香味形成的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，除Badh2基因外，氣候、土壤、栽培等也會(huì)影響水稻香味物質(zhì)的合成。陽(yáng)樹(shù)英等^[28]和徐振江等^[29]在比較不同地域的香稻品質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，溫度、光照影響稻米食味品質(zhì)和香味濃度，特別是灌漿結(jié)實(shí)期的溫度。另外，土壤中的礦物質(zhì)（如氮、鉀、鋅、錳、鑭等微量元素）含量、水分和有機(jī)質(zhì)含量也影響水稻香味物質(zhì)的累積^[30-37]。溫度、土壤、栽培等因素對(duì)水稻香味物質(zhì)濃度的影響，降低了感官鑒定的準(zhǔn)確性，增加了香味植株篩選的難度。

自Badh2基因被克隆以來(lái)，水稻香味基因的研究和應(yīng)用也更加深入，BARDBURY等^[38]利用Badh2基因第7外顯子8堿基缺失和3堿基突變位點(diǎn)，在基因內(nèi)部設(shè)計(jì)了4種引物，通過(guò)等位基因擴(kuò)增分析，借助1%瓊脂糖凝膠準(zhǔn)確地區(qū)分香與非香水稻基因型，該法能夠同時(shí)分析香型水稻基因序列中的單核苷酸多態(tài)性、缺失或插入座位，但是四引物明顯提高了引物合成的成本，并且在讀取結(jié)果時(shí)需要借助高昂價(jià)格的紫外儀。王豐等^[39]根據(jù)Badh2基因發(fā)生的缺失片段設(shè)計(jì)出分子標(biāo)記GRFM04，僅通過(guò)1對(duì)引物就能檢驗(yàn)香型材料粵豐B和非香型材料振豐B的F₂分離群體，以及其他22份材料的香味基因型，其中香型和非香型材料標(biāo)記分別為201 bp和209 bp，剛好相差8 bp，因此，電泳檢測(cè)時(shí)必須要借助高毒的8%聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)。閆影等^[40]針對(duì)Badh2基因第7外顯子處8堿基缺失和3堿基突變特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)了四引物分子標(biāo)記YY5-YY8檢測(cè)香型和非香型水稻材料，通過(guò)2%瓊脂糖凝膠結(jié)果顯示，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物為583、169 bp時(shí)，材料為香型;當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物為591、449 bp時(shí)，材料為非香型。與王豐等^[39]的標(biāo)記方法相比，該分子標(biāo)記方法操作簡(jiǎn)單，但也需要設(shè)計(jì)4條引物，并且在讀取結(jié)果時(shí)條帶較多，容易出現(xiàn)錯(cuò)亂。徐小龍等^[24]根據(jù)Badh2基因第7外顯子突變?cè)O(shè)計(jì)出四引物分子標(biāo)記引物M7，分別對(duì)香稻‘W香99075和非香稻‘261S等材料進(jìn)行電泳檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，香型和非香型材料分別擴(kuò)增出780 bp和2100 bp條帶，雜合型水稻同時(shí)擴(kuò)增出780 bp和2100 bp條帶;孫平勇等^[41]根據(jù)香味基因序列特征設(shè)計(jì)1對(duì)引物的功能性分子標(biāo)記E7，通過(guò)對(duì)10份香稻品種和2份非香稻品種的基因型檢測(cè)，準(zhǔn)確鑒定了Badh2基因顯性純合、隱性純合和雜合3種基因型，但此方法設(shè)計(jì)擴(kuò)增出香型和非香型產(chǎn)物大小分別為267 bp和275 bp，也需要通過(guò)8%聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)，雖然這些方法都各有千秋，但為香味基因的應(yīng)用提供了技術(shù)支持。本研究根據(jù)水稻Badh2基因第7外顯子突變序列特征，利用PCR擴(kuò)增中引物5?端保守性差的特點(diǎn)，將31 bp外源DNA序列添加至非香型引物的5?端，構(gòu)成水稻香味三引物功能新標(biāo)記;該標(biāo)記將Badh2基因第7外顯子突變類(lèi)型的非香型和香型特征條帶差異擴(kuò)大至41 bp，僅通過(guò)3%無(wú)毒瓊脂糖凝膠，就可在無(wú)多余條帶的基礎(chǔ)上準(zhǔn)確反映待測(cè)的類(lèi)型，香稻中香味基因的純合、雜合和無(wú)3種狀態(tài)，用時(shí)較短，所需儀器簡(jiǎn)單，方便操作。不僅避免了KOH法和咀嚼法的主觀誤差，也避免了采用毒性高、耗時(shí)長(zhǎng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，并且唯一的條帶更加有助于結(jié)果的讀取，顯著提高了香味植株鑒定的準(zhǔn)確性和效率，為優(yōu)質(zhì)香稻的培育提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

標(biāo)記開(kāi)發(fā)后，育種家們通過(guò)香味與抗性、優(yōu)質(zhì)等基因標(biāo)記的結(jié)合，培育既有香味還具有抗性好、品質(zhì)優(yōu)的水稻新品種。閆影等^[42]聚合水稻抗條紋葉枯病基因QSTV-11b和香味基因fgr，結(jié)合田間抗性鑒定，育成了香型高抗條紋葉枯病，且高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的早熟晚粳新品種類(lèi)型‘滬香粳151;韋敏益等^[43]和李虎等^[44]利用fgr基因標(biāo)記ESP、IFAP、INSP、EAP和抗稻瘟病標(biāo)記M-Pi5F、M-Pi5R、Pia-F、Pia-R等輔助選擇，結(jié)合田間農(nóng)藝性狀和抗性鑒定，育成了同時(shí)具有抗稻瘟病基因Pi5、Pita、Pia、Pi2和香味基因fgr的豐產(chǎn)性?xún)?yōu)質(zhì)香稻‘桂野香占和‘桂香99;李榮田等^[45]將香味分子標(biāo)記篩選和田間選擇相結(jié)合，培育出莖葉直立、抗倒伏、高產(chǎn)、有香味的水稻新品種‘黑大香1。香味分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)對(duì)香稻資源創(chuàng)制、新品種培育具有重要意義，利用香味分子標(biāo)記和農(nóng)藝性狀相結(jié)合的方法，有望培育更多香型優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的水稻新品種材料。

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