豬鏈球菌2型分離鑒定及其對小鼠的致病性分析

劉娜 于江 李建達(dá) 張玉玉 楊靈芝 任素芳 叢雁芳

摘要：為了解豬鏈球菌2型菌株對昆明小鼠的致病性，并建立其感染昆明小鼠模型，本試驗(yàn)分別取2頭疑似患鏈球菌病的病死豬腦組織、血液分別涂布于含5%胎牛血清的TSA固體培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)菌分離;并對分離獲得的細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)觀察、PCR鑒定、藥物敏感性試驗(yàn)、小鼠致病性試驗(yàn)及組織病理切片觀察。結(jié)果顯示，分離菌為革蘭氏陽性短鏈球菌，經(jīng)PCR鑒定為豬鏈球菌2型，命名為LY株;藥敏試驗(yàn)證實(shí)LY株對青霉素、紅霉素、氯霉素、苯唑西林、環(huán)丙沙星、諾氟沙星敏感，對四環(huán)素、多粘菌素B、克林霉素不敏感;LY株對小鼠致死劑量為2.2×109cfu/只;組織病理切片觀察發(fā)現(xiàn)小鼠肺臟、脾臟及心肌均出現(xiàn)不同程度的病變。本研究明確了山東省豬鏈球2型毒株的毒力，為疫苗候選菌株的篩選提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌2型;分離鑒定;小鼠;致病性

豬鏈球菌（Streptococcussuis）2型是一種能夠引起人獸共患的病原菌，臨床上主要引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥和突發(fā)死亡等癥狀[1，2]。根據(jù)豬鏈球菌莢膜抗原的多樣性，可將豬鏈球菌分為35個(gè)血清型（1～34型及1/2型）[3，4]，其中主要致病血清型為1、2、7、9型[5，6]。1998年夏季在江蘇省部分豬群暴發(fā)豬鏈球菌2型疾病，對人畜健康造成嚴(yán)重威脅[7]。2005年夏季四川省暴發(fā)豬鏈球菌2型疾病，造成人員傷亡[8]。該菌是一種革蘭氏陽性菌，在自然界分布廣泛，不僅可以引起豬，還可以引起人、馬、牛、羊、禽等多種動(dòng)物感染[9]。人感染豬鏈球菌與職業(yè)有密切關(guān)系，但未見人與人直接傳染的報(bào)道[10]。該病多呈地方性流行，一年均可發(fā)生感染，但多暴發(fā)于4～11周齡的豬群[11，12]。

本研究于2019年從山東省某豬場送檢的具有后肢跛行劃水樣癥狀的2頭40日齡發(fā)病仔豬中分離并鑒定出豬鏈球菌2型菌株，通過藥物敏感性試驗(yàn)確定其對藥物的敏感性。由于豬體試驗(yàn)周期長、操作不方便、費(fèi)用高、免疫抑制病等在攻毒試驗(yàn)中常常影響結(jié)果[13]，而小鼠作為動(dòng)物模型費(fèi)用低、操作簡易，因此本研究采用昆明小鼠建立豬鏈球菌2型LY株感染動(dòng)物模型，以確定臨床分離株豬鏈球菌2型LY株致死劑量及毒力。

1材料與方法

1.1病料來源

病料采集于2019年山東省某豬場送檢的臨床癥狀疑似豬鏈球菌2型的2頭40日齡發(fā)病仔豬，臨床表現(xiàn)后肢跛行，死前有劃水樣癥狀。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

昆明小鼠，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司;TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000DNAMarker等，購自寶生物工程（大連）有限公司;TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基，購自美國BD公司;藥敏紙片，購自O(shè)XOID公司;鏈球菌細(xì)菌生化編碼鑒定管，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3細(xì)菌的分離純化

取病死豬血液、腦組織分別劃線接種于含5%胎牛血清的TSA培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18h，挑取菌落，進(jìn)行革蘭氏染色鑒定。繼續(xù)傳至第三代，挑取單菌落接種于7mL含5%胎牛血清的TSB培養(yǎng)基，37℃搖床180r/min培養(yǎng)8h。

1.4菌液PCR鑒定

取100μL菌液進(jìn)行PCR鑒定，以CPS2J基因特異性引物（表1）進(jìn)行擴(kuò)增[14]，擴(kuò)增目的片段為124bp。菌液PCR反應(yīng)體系（25μL）：10×TaqBuffer（含Mg2+）2.5μL，dNTPs2.0μL，10μmol/L的上、下游引物各1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，無菌水15μL，DNA模板3μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10min;95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，34個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。

1.5生長曲線及OD600值與其活菌數(shù)相關(guān)性曲線的建立

挑取單菌落，接種于含5%胎牛血清的TSB培養(yǎng)液中，37℃搖床180r/min培養(yǎng)12h，作為種子液。取種子液1mL，加入99mLTSB培養(yǎng)液中，37℃、180r/min培養(yǎng)，分時(shí)取菌進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和吸光度OD600的測定，建立生長曲線及OD600值與其活菌數(shù)的相關(guān)性曲線。

1.6藥敏試驗(yàn)

采用藥敏紙片法檢測該細(xì)菌對臨床常用青霉素、紅霉素、氯霉素、苯唑西林、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、四環(huán)素、多粘菌素B、克林霉素共9種藥物的敏感性，具體試驗(yàn)方法按照說明書進(jìn)行操作。

1.7攻毒菌液制備

挑取豬鏈球菌2型LY株凍干粉劃線接種于TSA平板（5%胎牛血清），置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20h，作為F1代。挑取F2代單菌落，密集劃線于TSA平板（5%胎牛血清），37℃培養(yǎng)14h，沖洗菌體后，根據(jù)吸光度OD600與活菌數(shù)的線性關(guān)系，計(jì)算菌液濃度，并稀釋至所需濃度。

1.8小鼠致病性試驗(yàn)

將40只昆明小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，其中3組分別腹腔注射1.1×1010、1.1×109、1.1×108cfu/mL不同梯度菌液0.2mL，另一組作為空白對照，腹腔注射PBS0.2mL，攻毒后連續(xù)觀察7d。

1.9組織病理切片觀察

分別將小鼠的心臟、脾臟、肺臟經(jīng)4%甲醛溶液固定后，按照常規(guī)包埋，制備石蠟切片，HE染色，鏡檢觀察。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)病仔豬剖檢結(jié)果

2頭發(fā)病仔豬均表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎，并有纖維素性滲出，心肌內(nèi)膜黏連，關(guān)節(jié)積液，胸腔積液，脾梗死（圖1）。

2.2細(xì)菌形態(tài)特征

在含有5%胎牛血清的TSA平板上生長出大量透明、光滑、圓潤的小菌落。挑取疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察顯示為革蘭氏陽性菌，呈鏈狀（圖2）。

2.3PCR鑒定

取100μL菌液進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增條帶與目的條帶大小一致（圖3）。

2.4生長曲線及OD600值與活菌數(shù)的相關(guān)性曲線的建立

2.4.1生長曲線的建立 如圖4所示，豬鏈球菌2型LY株在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3h左右開始進(jìn)入對數(shù)生長期，6～8h達(dá)到高峰，8h后活菌數(shù)逐漸下降，進(jìn)入衰退期。

2.4.2活菌數(shù)與OD600值相關(guān)關(guān)系的建立 根據(jù)分時(shí)測定的活菌數(shù)和OD600值，在細(xì)菌生長遲緩期和對數(shù)期，活菌數(shù)和OD600值呈線性關(guān)系（圖5），相關(guān)性表示為y=24.6590x-1.0761（R2=0.9967）。

2.5藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，分離菌株LY株對青霉素、紅霉素、氯霉素、苯唑西林、環(huán)丙沙星、諾氟沙星敏感，對四環(huán)素、多粘菌素B、克林霉素不敏感。

2.6小鼠致病性試驗(yàn)

小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示試驗(yàn)組小鼠表現(xiàn)出不同程度的精神萎靡，被毛糙亂。感染劑量為2.2×109cfu/只小鼠在24h內(nèi)全部死亡;2.2×108cfu/只攻毒組在48h死亡4只;2.2×107cfu/只攻毒組在48h死亡1只;對照組小鼠狀態(tài)良好（表3）。將死亡的小鼠剖檢，取肺臟劃線接種于TSA平板（5%胎牛血清），分離的細(xì)菌經(jīng)形態(tài)觀察、PCR鑒定，證明為豬鏈球菌2型菌株。

2.7組織病理切片觀察

組織病理切片結(jié)果顯示，肺部血管發(fā)生玻璃樣變，血管壁增厚，肺泡腔中可見淡粉色漿液滲出（圖6A）;脾臟紅髓區(qū)域淋巴細(xì)胞大量減少，組織中還可見較多圓形空腔，空腔中有嗜堿性顆粒物（圖6B）;心肌纖維間隙增寬，血管擴(kuò)張，充滿紅細(xì)胞（圖6C）。

3討論與結(jié)論

豬鏈球菌是一種具有莢膜的革蘭氏陽性菌，其中2型為35個(gè)血清型中最常見且毒力最強(qiáng)的血清型[15]。豬鏈球菌自然感染的部位為豬的上呼吸道，尤其是扁桃體和鼻腔[16]。

近年來，隨著豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）和豬圓環(huán)病毒病（PCV）等免疫抑制性疾病的流行，導(dǎo)致豬鏈球菌病2型感染率上升，然而對豬鏈球菌2型的生長特性卻鮮有報(bào)道[17]。本研究從發(fā)病仔豬的肺部病灶分離菌株，經(jīng)細(xì)菌形態(tài)學(xué)和PCR鑒定為豬鏈球菌2型。通過液體培養(yǎng)的方法對豬鏈球菌2型LY株的生長曲線及OD600值進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，豬鏈球菌2型LY株在TSB液體培養(yǎng)基（含5%胎牛血清）中37℃培養(yǎng)3h后進(jìn)入對數(shù)生長期，在8h后進(jìn)入衰減期。

豬鏈球菌2型的毒力、致病性和免疫性一直是研究者十分關(guān)心的問題，目前已有豬鏈球菌2型感染模型的報(bào)道[18-20]。本研究選用昆明小鼠作為動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用分離的LY株進(jìn)行攻毒，小鼠出現(xiàn)精神抑郁、食欲下降、死亡等癥狀，感染劑量為2.2×109cfu/只時(shí)小鼠死亡率為100%。對死亡小鼠進(jìn)行組織病理切片觀察，分別在肺臟、脾臟和心肌中發(fā)現(xiàn)不同程度的病變。

豬鏈球菌作為一種典型的革蘭氏陽性菌，對各種抗菌藥的抵抗力并不強(qiáng)。但由于日常生產(chǎn)中抗生素的濫用，導(dǎo)致大量耐藥菌株的出現(xiàn)。通過藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本研究分離到的豬鏈球菌2型菌株對多粘菌素B和克林霉素完全耐藥，對四環(huán)素輕度耐藥，而對青霉素、紅霉素、氯霉素、苯唑西林、環(huán)丙沙星、諾氟沙星敏感。本研究結(jié)果與鄧智丹[21]、劉澤文[22]、徐引弟[23]等研究結(jié)果不完全相同，說明抗生素的普遍使用，造成臨床上菌株的耐藥性差異，進(jìn)一步驗(yàn)證了在豬鏈球菌的防治過程中，藥敏試驗(yàn)的重要性與必要性。

綜上所述，本研究建立了豬鏈球菌2型生長曲線，明確了該菌的生長特性和毒力，為疫苗候選菌株的篩選提供了理論依據(jù)。