楊迎霞 葛賢宏 孫德嶺 金慶東 陸國(guó)清 姚星偉

摘? ? 要：CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已經(jīng)在許多農(nóng)作物上成功應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了許多重要農(nóng)藝性狀的精準(zhǔn)改良。本研究參考甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）遺傳轉(zhuǎn)化體系，以花椰菜（Brassica oleracea L.var .botrytis）育種材料‘FQ-36為受體，以花青素合成關(guān)鍵基因BoANS為目標(biāo)基因，構(gòu)建CRISPR/Cas9表達(dá)載體，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花椰菜基因編輯技術(shù)體系，并獲得22株再生植株，經(jīng)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)13株為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株，轉(zhuǎn)化效率為59.09%。與野生型相比，3株陽(yáng)性株花球表面紫色呈現(xiàn)不同程度的消退，初步說(shuō)明BoANS被成功編輯。花椰菜CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系的建立對(duì)后續(xù)開展基因功能研究和目標(biāo)性狀精準(zhǔn)改良具有重要意義。目前該技術(shù)體系正在應(yīng)用到花椰菜優(yōu)異資源的創(chuàng)制中。

關(guān)鍵詞：花椰菜;甘藍(lán)型油菜;CRISPR/Cas9;基因編輯

中圖分類號(hào)：S565.4? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.04.002

Construction of Efficient CRISPR/Cas9 Genome Editing Technology System in Cauliflower

YANG Yingxia1， GE Xianhong2， SUN Deling1，3， JIN Qingdong2， LU Guoqing1， YAO Xingwei1，3

（1.Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300384， China; 2.College of Plant Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070，China; 3.Tianjin Key Laboratory of Vegetable Genetics and Breeding， The State Key Laboratory of Vegetable Germplasm Innovation， Tianjin 300384，China）

Abstract： CRISPR / Cas9 gene editing technology has been successfully applied in many cropsand achieved the accurate improvement of important agronomic traits. Referred to the genetic transformation system of Brassica napus L.， the CRISPR/Cas9 expression vector was constructed of key anthocyanin biosynthesis gene BoANS and introduced intothe breeding material'FQ-36' of Brassica oleracea L. var. botrytis. The Agrobacterium mediated gene editing technology system in cauliflower was established. As a result， 22 regenerated plants were obtained and 13 （59.09%）positive strains were obtained by PCR detection.Particularly，the purple color on the curd surface of the three plants faded in varying degrees compared to the wild type. The established CRISPR / Cas9 gene editing technology system in cauliflower will be of great significance for subsequent gene function research and accurate genetic improvement.The genome editing technology system in cauliflower is been applying successfully to create cauliflower wonderful breeding materials.

Key words： cauliflower; Brassica napus; CRISPR/Cas9; genome editing

花椰菜（Brassica oleracea L.var .botrytis）又名花菜、菜花，屬于十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的一個(gè)變種，其味道鮮美、口感甜脆、營(yíng)養(yǎng)豐富，同時(shí)具有抗癌防癌保健功能，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。我國(guó)花椰菜栽培面積和產(chǎn)量均位列世界第一，2019年我國(guó)花椰菜（包括青花菜）種植面積達(dá)5.467×105 hm2，約占世界總面積40%;產(chǎn)量達(dá)1.071×1010 kg，占世界總產(chǎn)量的40.67%[1]，花椰菜在我國(guó)蔬菜生產(chǎn)中占有重要地位。

我國(guó)花椰菜分子育種研究雖然起步較晚，但是花椰菜全基因組序列圖譜的公布和釋放[2-3]，極大地推動(dòng)了花椰菜基因功能研究及生物育種技術(shù)的發(fā)展，對(duì)定位花椰菜重要農(nóng)藝性狀，揭示花球發(fā)育機(jī)制以及開展高效、精準(zhǔn)分子聚合育種有著里程碑式的作用。建立高效、成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系是所有作物開展生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，特別是近年來(lái)基因編輯技術(shù)在許多農(nóng)作物上的成功應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了大量重要農(nóng)藝性狀精準(zhǔn)改良，構(gòu)建高效、成熟的植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系顯得尤為重要。

目前，基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CRISPR/Cas9技術(shù)體系已經(jīng)成功應(yīng)用于水稻、玉米、大豆等農(nóng)作物[4]。在甘藍(lán)類蔬菜作物功能基因的研究過(guò)程中，研究者已利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得早花、雄性不育、無(wú)葉片蠟質(zhì)層等具備優(yōu)良性狀的育種材料[5-7]，此方法可快速地將優(yōu)異基因變異向育種材料中累積，為高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗新品種的培育提供了新的技術(shù)儲(chǔ)備[8]。然而目前該技術(shù)在花椰菜上的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究參照甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系[9]，以花椰菜‘FQ-36為受體材料，以花青素合成途徑中的關(guān)鍵功能基因BoANS為靶標(biāo)基因，構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行靶向編輯，擬構(gòu)建花椰菜高效CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系，整合花椰菜基因編輯技術(shù)、全基因組生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)和種質(zhì)資源表型數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)搭建4.0版本花椰菜分子設(shè)計(jì)育種平臺(tái)具有極大的推動(dòng)作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

花椰菜育種材料‘FQ-36，由天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。該品系秋季栽培成熟期130 d，株型直立上沖緊湊，波浪型葉片，葉色深綠色，花球周正緊實(shí)、細(xì)嫩、平整，不抗黑腐病和霜霉病，遇低溫、高溫、強(qiáng)光等逆境脅迫花球表面易呈現(xiàn)著色不均的紫色。

1.2 載體

過(guò)渡載體（pCBC-DT1T2）和植物表達(dá)載體（35S-pKSE401）菌株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室戴成老師提供。大腸桿菌為DH5α感受態(tài)細(xì)胞。根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）為GV3101感受態(tài)細(xì)胞。

1.3 sgRNA設(shè)計(jì)與CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

利用CRISPR-PV2.0在線軟件（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）對(duì)BoANS基因（Bol014986）序列進(jìn)行靶位點(diǎn)分析。靶位點(diǎn)選擇標(biāo)準(zhǔn)：（1）位于基因外顯子上;（2）GC含量不低于40%;（3）靠近基因編碼區(qū)5端;（4）特異性好、脫靶效應(yīng)低[10]。

CRISPR載體構(gòu)建具體方法步驟詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11]。以pCBC -DT1T2 為模板進(jìn)行引物 PCR 擴(kuò)增，得到含兩個(gè)靶點(diǎn)（DT1 和 DT2）序列的gRNA表達(dá)盒，柱式DNA片段純化試劑盒純化后，用BsaI酶切PCR純化產(chǎn)物和pKSE401并用T4DNA ligase 連接，得到最終載體。載體于-80 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花椰菜遺傳轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花椰菜遺傳轉(zhuǎn)化體系以及使用的培養(yǎng)基配方主要參考甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法[9]，具體如下：切取0.8～1 cm左右的下胚軸作為外植體，用含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液（OD=0.5）侵染外植體30 min，轉(zhuǎn)入M1培養(yǎng)基上在25 ℃、黑暗條件下共培養(yǎng)2～3 d，再轉(zhuǎn)入含卡那霉素的愈傷組織誘導(dǎo)M2培養(yǎng)基上，在26/22 ℃、16 h 光照/8 h 黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)21 d，然后將外植體轉(zhuǎn)入芽分化M3培養(yǎng)基上，在26/22 ℃、16 h 光照/8 h 黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)14 d，最后切取幼芽，轉(zhuǎn)入M4生根培養(yǎng)基，溫度為26/22 ℃、光照條件為16 h 光照/8 h 黑暗。生根后移入基質(zhì)，培養(yǎng)室內(nèi)煉苗，移栽至大田繼續(xù)培養(yǎng)，收獲種子。

1.5 CRISPR/Cas9編輯植株的分子檢測(cè)與表型鑒定

采用改良的CTAB法提取待檢測(cè)植株的基因組DNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ND-1000檢測(cè)，DNA濃度調(diào)至100 ng·μL-1備用。以其為模板，使用載體特異性引物U626-IDF 、U629-IDR（U626-IDF：TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC;U629-IDR：AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：Premix Taq（KaRaTaqTM Version 2.0）5 μL、DNA模板1 μL（20 ng）、上下游引物各0.2 μL（0.2 μM）、ddH2O 3.6 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min;95 ℃10 s，61 ℃15 s，72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物由1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并計(jì)算轉(zhuǎn)化效率（轉(zhuǎn)化效率=轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株數(shù)/總成株數(shù)）。對(duì)基因編輯陽(yáng)性植株的表型進(jìn)行觀察和記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建

根據(jù)在線軟件CRISPR-PV2.0分析結(jié)果，基于靶位點(diǎn)選擇標(biāo)準(zhǔn)，在BoANS基因上選取了2個(gè)靶位點(diǎn)，即5'-GTCTTGTTTATCCTGAAGAC-3'，5'-GTCTTCAGGATAAACAAGAC-3'。并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了用于CRISPR/Cas9載體構(gòu)建的引物序列（表1）。

使用CRISPR-ANS-BsF、CRISPR-ANS-F0，CRISPR-ANS-R0、CRISPR-ANS-BsR 4對(duì)引物對(duì)過(guò)渡載體pCBC-DT1T2進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測(cè)并回收純化。純化后的質(zhì)粒通過(guò)邊酶切邊連接方法連接到pKSE401載體上，成功獲得pKSE401-sgRNA重組質(zhì)粒。

2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花椰菜遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系的建立

參照甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，經(jīng)過(guò)60 d左右的培養(yǎng)，獲得了花椰菜遺傳轉(zhuǎn)化再生植株（圖1）。

2.3 花椰菜再生植株的載體插入陽(yáng)性檢測(cè)

將生根的幼苗移栽到華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜工程中心轉(zhuǎn)基因基地，共移栽24株，其中22株成活。對(duì)成活的再生植株收集幼嫩葉片提取DNA，利用U26啟動(dòng)子引物對(duì)這些植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)13株陽(yáng)性株，對(duì)應(yīng)泳道分別為1、2、3、4、5、6、7、11、12、13、15、16、21，這13株陽(yáng)性株都擴(kuò)增出726 bp的特異性條帶（圖2），與陽(yáng)性對(duì)照（重組質(zhì)粒）的擴(kuò)增結(jié)果一致，由此初步判斷這些為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化效率為59.09%。

2.4 轉(zhuǎn)基因花椰菜植株的田間表型鑒定

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，13株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株均能正常結(jié)球，與野生型（圖3-A）相比，有3株陽(yáng)性植株花球紫色明顯減弱，尤其是編號(hào)21號(hào)陽(yáng)性株（圖3-B）紫色減退非常明顯，初步說(shuō)明這些植株BoANS基因發(fā)生了突變。遺憾的是，由于武漢新冠疫情的暴發(fā)沒(méi)有對(duì)這些植株的編輯位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，也沒(méi)能從這些植株上收獲種子。

3 結(jié)論與討論

目前基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)已經(jīng)在多種植物中成功應(yīng)用，建立高效、成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)植物開展關(guān)鍵基因功能解析以及精準(zhǔn)分子設(shè)計(jì)育種至關(guān)重要。蕓薹屬作物中結(jié)球甘藍(lán)、芥藍(lán)已經(jīng)建立了成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系并實(shí)現(xiàn)了資源改良創(chuàng)制[12-13]，花椰菜是遺傳轉(zhuǎn)化體系比較成熟，遺傳轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較高的蕓薹屬作物[14-15]，但目前還未見(jiàn)花椰菜基因編輯技術(shù)方面的相關(guān)報(bào)道。

ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ζ-carotene desaturase，ZDS）是植物類胡蘿卜素生物合成途徑的關(guān)鍵酶，當(dāng)編碼ZDS的基因沉默后，植物新生葉片將出現(xiàn)明顯白化現(xiàn)象。鄭愛(ài)紅等[16]巧妙地把芥藍(lán)BoZDS作為目標(biāo)基因，以再生植株白化表型標(biāo)記和Sanger測(cè)序檢驗(yàn)編輯體系突變效率，成功構(gòu)建了芥藍(lán)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系，轉(zhuǎn)化效率達(dá)68.42%，本研究篩選的試驗(yàn)受體材料以及選擇的目標(biāo)基因與鄭愛(ài)紅試驗(yàn)設(shè)計(jì)有相似之處。本試驗(yàn)材料為‘FQ-36，前期預(yù)試驗(yàn)表明其再生率顯著高于其它花椰菜品系，是非常理想的遺傳轉(zhuǎn)化受體材料，此外該材料極易受環(huán)境影響，當(dāng)遇到高溫、低溫、強(qiáng)光照等逆境脅迫花球極易變紫，因此花球是否變紫可作為驗(yàn)證基因編輯體系的表型標(biāo)記?；ㄇ嗨睾铣擅福ˋNS，anthocyanin synthase）是植物花青素合成的關(guān)鍵酶，催化花青素生物合成的倒數(shù)第2步，使無(wú)色花色素轉(zhuǎn)變成有色花色素。ANS基因變異和表達(dá)量差異使植物呈現(xiàn)紫色、紅色、粉色、黃色、白色等顏色，并且已經(jīng)在覆盆子、石榴、草莓等多種植物中證明ANS基因突變是導(dǎo)致植物組織變成白色的重要原因[17-19 ]。前期試驗(yàn)通過(guò)代謝組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，驗(yàn)證了ANS等是調(diào)控低溫花球變紫的關(guān)鍵基因[20]，本試驗(yàn)以BoANS為目標(biāo)基因?qū)RISPR/Cas9技術(shù)在花椰菜上的應(yīng)用進(jìn)行了初步探索，并成功構(gòu)建了花椰菜基因編輯技術(shù)體系，轉(zhuǎn)化效率達(dá)59.09%。

天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院與華中農(nóng)業(yè)大學(xué)通過(guò)項(xiàng)目合作，將甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系成功應(yīng)用于花椰菜中[9]，建立了花椰菜基因編輯遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，并已經(jīng)成功應(yīng)用于花椰菜優(yōu)異資源的創(chuàng)制中。

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