樺樹皮中樺木醇重結(jié)晶純化工藝優(yōu)化

李镕基 鄭克煒 陳海燕

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130000；2. 浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316000；3. 長春科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130000)

白樺(Betulapubescens.)為耐寒落葉喬木，分布于北亞、北美、北歐的寒帶、寒溫帶地區(qū)，在中國東北、華北、西北、西南等地均有生長[1-2]。樺樹皮中含有三萜類、揮發(fā)油類、鞣質(zhì)類、甾體類化合物等多種化學(xué)成分[3-4]，具有清熱利濕、鎮(zhèn)咳祛痰等功效[5-7]，可用于治療燒燙傷、炎癥、疥瘡、黃疸、乳癰等疾病，且在降血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等方面表現(xiàn)出了較強(qiáng)的生理活性[8-9]。樺木醇(Betulin)屬于羽扇豆烷型的五環(huán)烯類化合物，又名白樺脂醇，是一種生物活性因子，在白樺樹皮中含量尤為豐富，為白色晶體粉末，熔點(diǎn)256 ℃，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯和氯仿等有機(jī)溶劑。

李志興等[10]研究表明，樺木醇對機(jī)體體力疲勞具有緩解作用。Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，樺木醇具有較高的抗氧化效果，針對FRAP、DPPH、ABTS等自由基均表現(xiàn)出清除能力。剛小青等[12]通過皮下注射宮頸癌細(xì)胞系c4-1建立異種移植瘤模型，經(jīng)白樺脂醇治療后發(fā)現(xiàn)，樺木醇可提高存活率是因為抑制了裸鼠體內(nèi)c4-1移植瘤體積的增長。Rzeski等[13]利用體外培養(yǎng)評價樺木醇在人類腫瘤細(xì)胞系和原代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中的抗癌活性，證明了樺木醇在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中具有顯著的抗增殖作用。

目前樺木醇的提取方法主要有超臨界萃取法、溶劑回流提取法、超聲提取法、連續(xù)提取法等。丁為民等[14]采用超臨界CO2法萃取樺樹皮中的樺木醇，當(dāng)萃取溫度為32 ℃、萃取壓力為8 MPa、萃取時間為1 h、CO2流量為20 kg/h時，樺木醇得率為16.96%，含量可達(dá)74.88%。易金娥等[15]采用甲醇作為溶劑，通過加熱回流法，并用堿溶液處理提取物體系，再經(jīng)減壓蒸干，乙醇溶解，過濾后留上層液體，最后經(jīng)減壓濃縮制取樣品。殷涌光等[16]采用超聲波技術(shù)對樺褐孔菌中的樺木醇進(jìn)行優(yōu)化提取，當(dāng)采用丙酮作溶劑時，樺木醇的提取質(zhì)量比最高為9.868 g/kg。馬博玉等[17]采用液泛提取設(shè)備對白樺樹皮中的樺木醇進(jìn)行連續(xù)提取，從而優(yōu)化了液泛連續(xù)提取樺木醇的工藝條件。肖涵[18]曾采用超聲提取法提取樺木醇，提取率為92.6%，而采用索氏提取法可以顯著提高樺木醇提取率。

研究擬以長白山地區(qū)的白樺樹皮為原料，經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇浸提后采用索式提取及無水乙醇重結(jié)晶法聯(lián)合純化樺木醇，并分析其體外抗氧化活性，旨在為后期樺木醇的研究及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

白樺樹皮：經(jīng)長春科技學(xué)院生藥教研室鑒定為樺木科樺木屬白樺種落葉喬木(Betulapubescens.)的干燥樹皮，市售；

大孔吸附樹脂：AB-8型，山東東鴻化工有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

樺木醇標(biāo)準(zhǔn)品、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、乙醇、香草醛、冰乙酸、抗壞血酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀：分析純，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：JJ50型，常熟市雙杰測試儀器廠；

循環(huán)水真空泵：SHZ-D(III)型，邦西儀器科技(上海)有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：GZX-9140MBE型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HHS-21-6型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

紫外可見分光光度計：UVmini-1280型，島津儀器(蘇州)有限公司；

超高效液相色譜—電噴霧四級桿串聯(lián)質(zhì)譜連用儀：Waters UPLC-Quattro Premier XE型，美國 AquityTM Waters 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樺木醇粗品得率、純度及綜合收率計算 分別按式(1)～式(3)進(jìn)行計算。

(1)

式中：

P——樺木醇得率，%；

m0——樺樹皮粉末重量，g；

m1——容器重量，g；

m2——干燥后樺木醇和容器的重量，g。

(2)

式中：

S——樺木醇純度；

Sq——樺木醇峰面積；

b——標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；

K——標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；

C——配液濃度。

Y=P×50%+S×50%，

(3)

式中：

Y——綜合收率，%。

1.2.2 樺木醇提取單因素試驗

(1) 乙醇體積分?jǐn)?shù)：固定料液比(m白樺樹皮∶V乙醇)1∶30 (g/mL)、提取時間1.5 h、提取溫度95 ℃，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(70%，75%，80%，85%)對樺木醇提取率的影響。

(2) 料液比：固定提取時間1.5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度95 ℃，考察料液比[m白樺樹皮∶V乙醇分別為1∶25，1∶30，1∶35，1∶40 (g/mL)]對樺木醇提取率的影響。

(3) 提取溫度：固定料液比(m白樺樹皮∶V乙醇)1∶30 (g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取時間1.5 h、考察提取溫度(90，95，100 ℃)對樺木醇提取率的影響。

(4) 提取時間：固定料液比(m白樺樹皮∶V乙醇)1∶30 (g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度95 ℃，考察提取時間(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h)對樺木醇提取率的影響。

1.2.3 樺木醇提取工藝響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù) Box-Behnken中心組合設(shè)計原理[19-21]，以樺木醇提取率為響應(yīng)值，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時間為響應(yīng)因素，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面分析試驗。

1.2.4 樺木醇結(jié)晶得率計算 將抽濾所得樺木醇結(jié)晶于50 ℃干燥5 h，按式(4)計算樺木醇結(jié)晶得率。

(4)

式中：

P——樺木醇結(jié)晶得率，%；

m0——結(jié)晶前樺木醇質(zhì)量，g；

m1——結(jié)晶出的樺木醇質(zhì)量，g。

1.2.5 樺木醇純化試驗方案 根據(jù)1.2.3所得優(yōu)化提取方案，選擇將 15 g干燥的白樺樹皮剪成近似1 cm2的方形碎片，用95%乙醇溶液，液固比為50∶1 (mL/g)浸泡120 h，過濾，50 ℃加熱回流5 h，減壓蒸餾，將液體轉(zhuǎn)移到坩堝中繼續(xù)蒸干，得初提物，待重結(jié)晶備用。

(1) 甲醇—氯仿重結(jié)晶法：參照文獻(xiàn)[22]的方法并修改。取0.50 g初提物，將提取液減壓蒸餾后用乙醇重結(jié)晶3次，再用甲醇/氯仿(V甲醇∶V氯仿為1∶1)，按V甲醇—氯仿溶液∶m固體=40∶1 (mL/g)進(jìn)行重結(jié)晶，靜置過夜，抽濾，得白色針狀的樺木醇固體。

(2) 無水乙醇重結(jié)晶法：參照文獻(xiàn)[23]的方法并修改。取0.50 g初提物，以70 mL乙酸乙酯為溶劑，加熱回流90 min，趁熱過濾。于坩堝中50 ℃濃縮至干。以無水乙醇為溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，V無水乙醇∶m固體=30∶1 (mL/g)，-20 ℃重結(jié)晶，室溫過濾，50 ℃烘干。

(3) 吸附層析法：參照文獻(xiàn)[23]的方法并修改。取0.50 g 初提物，用AB-8型大孔吸附樹脂吸附層析，使用乙酸乙酯洗脫，洗脫液回收乙酸乙酯至干，加入15倍無水乙醇加熱溶解，0 ℃以下冷沉，過濾，干燥。

1.2.6 樺木醇含量測定 采用香草醛—冰乙酸顯色法[18]。

1.2.7 樺木醇LC-MS檢測

(1) 液相條件：色譜柱為Acquity BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×50 mm；流動相A為0.01%甲酸溶液，流動相B為甲醇；柱溫45 ℃；流速0.25 mL/min。

(2) 質(zhì)譜條件：Quattro Premier XE；ESI正離子檢測方式；離子對443.7/191.1；脫溶劑溫度380 ℃、源溫110 ℃、毛細(xì)管電壓3.00 kV、錐氣孔大小80 L/Hr、脫溶劑氣大小600 L/Hr。

1.2.8 樺木醇的抗氧化試驗

(1) DPPH自由基清除能力：參照金建等[24]的方法。

(2) 羥基自由基清除能力：參照楊艷等[25]的方法。

(3) 總還原力：參照毛跟年等[26]的方法。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用Origin 8.0 軟件對分析后的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樺木醇提取單因素試驗

由圖1(a)可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時，樺木醇提取率最高，繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，樺木醇提取率降低，故選擇80%為乙醇最佳體積分?jǐn)?shù)。由圖1(b)可知，當(dāng)料液比為1∶30 (g/mL)時，樺木醇提取率最高，繼續(xù)增大料液比，樺木醇提取率降低，故選擇1∶30 (g/mL)為最佳提取料液比。由圖1(c)可知，在試驗范圍內(nèi)提取溫度對提取率的影響不明顯，可能是由于90～100 ℃皆高于乙醇的沸點(diǎn)，乙醇溶液的蒸發(fā)速率相差不大，考慮節(jié)約能源成本和提取效果，選擇95 ℃為最佳提取溫度。由圖1(d)可知，當(dāng)索氏提取時間為1.5 h時，樺木醇的提取率最高，時間過長可能會導(dǎo)致除目標(biāo)物以外的其他成分也會被提取出來，因此最佳提取時間設(shè)定為1.5 h。

圖1 各因素對樺木醇提取率的影響Figure 1 The influence of various factors on the extraction rate of betulin

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化樺木醇提取工藝

2.2.1 試驗設(shè)計與結(jié)果 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時間為影響因素，以樺木醇提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 10軟件進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，優(yōu)化樺木醇提取工藝。試驗因素水平設(shè)計見表1，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Response surface test factor level table

表2 樺木醇提取響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results of betulin extraction scheme

表3 回歸模型方差分析?Table 3 Analysis of variance of regression model

應(yīng)用Box-Behnken試驗設(shè)計原理對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得二次多元回歸方程：

Y=66.02+1.38A-0.061B+2.14C+1.04D+2.50E-0.03AB-0.90AC+0.83AD-1.53BC+0.024BD-0.40CD-3.37A2-2.81B2-4.27C2-5.40D2。

(5)

2.2.2 響應(yīng)曲面分析 由圖2可知，各因素交互作用對樺木醇提取率均有一定影響，其中以提取溫度和料液比的交互作用所形成的曲面相對陡峭，表明其對試驗結(jié)果的影響最為顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖2 各因素相互作用對樺木醇提取率的影響Figure 2 The influence of various factors on the extraction rate of betulin

2.2.3 驗證實(shí)驗 經(jīng)響應(yīng)面分析優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)80.928%、料液比1∶29.621 (g/mL)、提取溫度96.199 ℃、提取時間1.551 h，此時樺木醇提取率為66.455%?？紤]實(shí)際操作的可行性，將工藝參數(shù)修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶30 (g/mL)、提取溫度95 ℃、提取時間1.5 h，實(shí)測樺木醇提取率為66.21%，與預(yù)測值較接近，證明此優(yōu)化方案可行，在實(shí)際應(yīng)用中具有可操作性。

2.3 樺木醇的重結(jié)晶方法比較

由表4可知，甲醇—氯仿重結(jié)晶法得到的白色針狀固體為0.04 g，重結(jié)晶率為 8%。大孔吸附樹脂層析法得到的奶白色固體粉末為0.19 g，重結(jié)晶率為38%。無水乙醇重結(jié)晶法得到的白色粉末狀固體為0.40 g。重結(jié)晶率為80%。

表4 樺木醇初提物重結(jié)晶的產(chǎn)量及產(chǎn)率Table 4 Yield and yield of recrystallization of the initial extract of betulin

2.4 樣品中樺木醇鑒定

采用LC-MS方法對所提取的樺木醇樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，樺木醇樣品色譜出峰時間為6.12 min，峰面積為749，與其他成分所形成的峰完全分離，通過與樺木醇標(biāo)品對比可知，樣品中含有目標(biāo)物樺木醇。

圖3 樺木醇樣品LC-MS檢測圖Figure 3 LC-MS detection of betulin samples

2.5 樺木醇的抗氧化活性

2.5.1 DPPH自由基清除能力 由圖4可知，當(dāng)樺木醇溶液質(zhì)量濃度為0.2～0.6 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率逐漸增加，當(dāng)樺木醇溶液質(zhì)量濃度>0.6 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除效果不再顯著提升。與維生素C對DPPH自由基的清除能力相比而言，樺木醇溶液同樣也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的清除效果。

圖4 樺木醇對DPPH自由基的清除作用Figure 4 DPPH radical scavenging effect of betulin

2.5.2 羥基自由基清除能力 由圖5可知，當(dāng)樺木醇溶液質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時，其對羥基自由基無清除效果，但隨著樺木醇質(zhì)量濃度的增大，其對羥基自由基的清除作用逐漸增強(qiáng)。樺木醇的抗氧化性可能是樺木醇與自由基相結(jié)合，阻止了自由基的鏈?zhǔn)窖趸磻?yīng)。

圖5 樺木醇對羥基自由基的清除作用Figure 5 Hydroxyl radical scavenging effect of betulin

2.5.3 總還原力 由圖6可知，隨著樺木醇質(zhì)量濃度的增加，溶液的吸光度值逐漸上升，但上升趨勢較為緩慢。在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，維生素C的總還原能力強(qiáng)于樺木醇。

圖6 樺木醇的總還原力Figure 6 Results of total reducing power of betulin

3 結(jié)論

白樺樹皮中樺木醇的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶30 (g/mL)、提取溫度95 ℃、提取時間1.5 h，在此條件下樺木醇提取率為66.21%。以無水乙醇為溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，V無水乙醇∶m固體=30∶1 (mL/g)，-20 ℃重結(jié)晶，重結(jié)晶產(chǎn)率可達(dá)80.00%，最高純度達(dá)99.81%?？寡趸囼灡砻鳎瑯迥敬季哂休^強(qiáng)的總抗氧化活性，但總還原能力及對羥基自由基、DPPH自由基清除能力均低于維生素C。后續(xù)可進(jìn)一步探究混合溶劑重結(jié)晶對樺木醇純度的影響，同時從生物活性角度，探究其體內(nèi)抗氧化活性及抗衰老能力，并對其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。