楊凱業(yè) 陳俊松 劉光榮 林麗 韓萍 馬詩經(jīng) 譚譯楷 吳顯儀 張藍月 杜志云

本研究通過DNFB模擬的特應(yīng)性皮炎（AD）模型，基于南沙參多糖、枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖以及黃芩多糖良好的免疫調(diào)節(jié)以及抗炎功效，將5種多糖配方組合制備成5種天然多糖組合物，研究該多糖組合物的抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等機制，探索利用天然多糖緩解AD的作用及機理。

關(guān)鍵詞：天然多糖組合物;特應(yīng)性皮炎;抗炎

皮膚是保護人體免受外界傷害與刺激的重要保護層，當(dāng)外界刺激給人體造成損傷時，皮膚的免疫系統(tǒng)會啟動信號，促進炎癥因子（如白介素等）以及組胺過度表達[2]，引起血流加快、細胞的通透性增加，導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)緊繃和發(fā)紅、瘙癢、脫屑甚至燒灼和刺痛等癥狀[3]。

特應(yīng)性皮炎（atopicdermatitis，AD）是以慢性、炎癥性、瘙癢性為主要表現(xiàn)的皮膚病。過去30年，AD患病率在全球范圍內(nèi)逐步上升，歐美國家兒童患病率為7%～30%，成人1%～10%。我國2015年一項流行病學(xué)調(diào)查顯示，1～7歲兒童AD患病率為12.94%，而成人AD的患病率尚無大樣本流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)[1]。

臨床上對于AD治療主要應(yīng)用糖皮質(zhì)激素類外用藥物進行，但是長期應(yīng)用激素類外用藥物會導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)萎縮、色素沉著以及毛細血管擴張等不良現(xiàn)象[6-8]，進一步對皮膚加以損害。

2，4-二硝基氟苯（DNFB）模擬的AD模型，可通過破壞皮膚的屏障功能達到表皮厚度增加和表皮出現(xiàn)紅斑等癥狀來模擬AD癥狀[4-5]。本研究通過DNFB模擬的AD模型，基于南沙參多糖、枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖以及黃芩多糖良好的免疫調(diào)節(jié)以及抗炎功效，將5種多糖配方組合制備成5種天然多糖組合物，研究該多糖組合物的抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等機制，探索利用天然多糖緩解AD的作用及機理。

沙參在歷代本草中都有記載，《本草從新》首次把沙參分為南沙參和北沙參。南沙參性甘，微寒;歸肺、胃經(jīng);有養(yǎng)陰清肺，化痰，益氣等功效，用于肺熱燥咳，陰虛勞嗽，干咳痰黏，氣陰不足，燥熱口干。枸杞子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品?！侗静菥V目》對枸杞子的功效記載頗為詳細，可補腎生精，養(yǎng)肝，明目，堅筋骨，去疲勞，易顏色，明目安神，令人長壽[9]。云芝隸屬真菌門擔(dān)子菌亞門多孔菌科栓菌屬，具有增強免疫、抗氧化等功效[10]。玫瑰在《藥性考》中有記載，可行血破積，損傷瘀痛，浸酒飲。黃芩是中醫(yī)臨床常用藥材，具有清熱解毒、活血祛瘀、消腫止痛之功效[11]。

南沙參多糖能夠?qū)ρ蹇贵w的水平產(chǎn)生顯著的提高作用，從而對免疫有一定的調(diào)節(jié)作用[12];枸杞多糖作為枸杞子中主要化學(xué)成分及活性成分，具有多種生物活性，有很好的消炎止痛作用，且不良反應(yīng)小、藥物依賴性弱[13];云芝多糖能提高機體免疫功能，增強機體抗感染能力，對自身免疫性疾病、感染性疾病的治療有重要意義[14];玫瑰多糖可以增強鼠巨噬細胞的白細胞介素6的產(chǎn)生，具有有效的免疫調(diào)節(jié)活性[15-16]。

01材料與方法

1.1主要材料、試劑、儀器與試驗動物

丙二醇（≥99.9%），華韻生物;九水合硫化鈉（≥99.9%），阿法埃莎;生理鹽水（0.9%），廣州美侖生物科技有限公司;無水乙醇，廣州化學(xué)試劑廠;多聚甲醛（4%），阿拉丁;橄欖油（酸度≤0.3%），黛尼;DNFB（98%），麥克林;蒸餾水，實驗室自制。

超高壓均質(zhì)機JN-02HC，廣州聚能納米有限公司;電熱恒溫水浴鍋DK-S22，上海精宏試驗設(shè)備有限公司;離心機Z326K，德國賀默公司;數(shù)控超聲波清洗器KQ3200DE，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2天然多糖的制備、篩選及多糖組合物的復(fù)配

1.2.1天然多糖的提取

參考王淑萍等的實驗方法[17]，取曬干之后的南沙參，粉碎后取20g，與200mL體積分數(shù)為95%的乙醇溶液混合，密閉靜置過夜。后過濾加入150mL純化水，置于90℃恒溫水浴鍋恒溫加熱3h，用300目濾袋過濾得懸濁液，靜置2h后，將懸濁液用雙層中速定性離心紙過濾，得到植物多糖水溶液，烘干得到植物多糖提取物。枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖、黃芩多糖的提取方法與南沙參多糖提取方法相同，均為水提醇沉法提取。

1.2.2天然多糖的含量測定

移取一定量植物多糖水溶液至100mL容量瓶，用純化水定容至刻度線，移取2mL該溶液至試管，再各加5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，然后加入5.0mL濃H2SO4使其充分混勻，置于沸水浴中加熱15min，取出后在冰浴中冷卻至室溫。取100μL溶液于96孔板中，在酶標(biāo)儀中在490nm處對樣品測定吸光值。將吸光度與多糖標(biāo)準曲線對比，得出該溶液多糖含量。

1.2.3天然多糖組合物復(fù)配

多糖組合物包括復(fù)配1～5：枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖組合形成復(fù)配1;黃芩多糖、南沙參多糖、云芝多糖組合形成復(fù)配2;南沙參多糖、枸杞多糖、玫瑰多糖組合形成復(fù)配3;黃芩多糖、云芝多糖、玫瑰多糖組合形成復(fù)配4;黃芩多糖、枸杞多糖、南沙參多糖組合形成復(fù)配5。以上5種復(fù)配的多糖質(zhì)量濃度均為0.5%（w/v）。

1.3AD動物模型及給藥方法

參考MotoyamaK等的實驗方法[18]，取BALB/c雄性小鼠70只，4周齡，體重20～25g，購自廣東省醫(yī)學(xué)試驗動物中心【動物批號：SCXK（粵）2016-0041】。小鼠標(biāo)準環(huán)境飼養(yǎng)，室溫維持在（24±0.2）℃，保持晝夜12h節(jié)律，自由飲水、攝食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。小鼠隨機分為空白組、模型組、復(fù)配1、2、3、4、5組（共7組，每組10只）。實驗前一周剔除小鼠背部毛發(fā)（面積約2cm×4cm），直至皮膚完全顯露。脫毛次日，除空白組外，其余各組用0.5%DNFB涂抹小鼠背部脫毛皮膚，每只100μL，連續(xù)涂抹7d。造模第7天，模型穩(wěn)定，各給藥組開始給予相應(yīng)的受試物，連續(xù)給藥15d。給藥期間，除正常組外，其余各組每周3次動物背部及右耳涂抹0.2%DNFB，其中背部100μL，右耳50μL。各治療組從造模第7天開始外用涂抹給藥，1次/d，連續(xù)15d，將受試物少量涂于患病右耳及背部皮膚，模型組及空白組不涂抹。

1.4PASI評分

觀察各組小鼠每天的背部皮損變化情況，依據(jù)PASI評分標(biāo)準給予小鼠皮損處紅斑（erythema）、鱗屑（scales）和浸潤增厚程度（thickness）0～4的積分：0，無;1，輕度;2，中度;3，重度;4，極重度。將三者積分相加得到總積分（0～12），對各組小鼠積分取平均值后繪制趨勢線。

1.5H&E染色

將耳部及背部皮膚組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水后，石蠟包埋。將修整好的蠟塊放置在石蠟切片機上切成厚度為4μm的切片。切片漂浮于攤片機40℃溫水上，將組織展平，用載玻片將組織撈起，并放進60℃烘箱內(nèi)烤片。待水烤干蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆?。切片于顯微鏡下觀察并隨機選取視野進行拍照并測量其厚度。

1.6甲苯胺藍染色測定皮膚肥大細胞密度

用于實驗的石蠟切片的皮膚組織用曲別針反貼固定在硬質(zhì)塑料卡上，防止組織固定時卷曲。經(jīng)10%福爾馬林固定后，進行石蠟包埋和常規(guī)切片，甲苯胺藍染色法對小鼠皮膚組織石蠟切片進行染色，觀察各組小鼠患部皮膚組織中肥大細胞數(shù)量變化。使用ImageJ1.48軟件在放大倍率200×下進行肥大細胞計數(shù)。

1.7實時熒光定量PCR檢測

將受試小鼠處死后剪去受試小鼠背部皮膚約1cm×1cm的面積（>100mg）的全層皮膚組織。檢測皮膚組織中IL-6mRNA、MCP-1mRNA、cAMPmRNA表達。使用總RNA提取試劑盒，從小鼠皮膚組織中提取mRNA，測定RNA含量、純度符合要求。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以GADPH作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt算法進行各組mRNA表達量檢測。引物由廣州賽維爾生物科技有限公司合成，總RNA提取試劑盒購自賽維爾，貨號：G3013。引物序列見表1。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果采用單因素方差分析，采用GraphPad軟件作圖。使用ImageJ軟件處理甲苯胺藍染色圖片，所有數(shù)值均用“均數(shù)±標(biāo)準誤差”。各組間差異比較用單因素方差分析（One-WayANOVA），進行組間兩兩多重比較。

02結(jié)果

2.1多糖提取及含量測定結(jié)果

5種植物提取的多糖如表2所示，其中枸杞多糖固重達到8.44g，多糖含量達到43.85%;黃芩多糖固重達到7.10g，多糖含量達到35.50%。

2.2DNFB模型小鼠背部皮膚PASI評分

與空白組比較，模型組小試背部皮膚出現(xiàn)紅、腫等癥狀;與模型組比較，各多糖復(fù)配組紅、腫等癥狀明顯好轉(zhuǎn);其PASI評分如圖所示。各多糖復(fù)配組的第17天PASI評分均明顯低于模型組。

2.3DNFB模型小鼠背部皮膚厚度測量及統(tǒng)計

通過對小鼠背部皮膚HE染色，測量其背部皮膚厚度，結(jié)果如圖2所示。與空白組比較，模型組小鼠背部表皮厚度增厚;與模型組比較，各多糖復(fù)配組的小鼠背部表皮厚度均顯著下降，其中復(fù)配3組的小鼠背部表皮厚度接近空白組。

2.4DNFB模型小鼠耳部皮膚厚度測量及統(tǒng)計

通過對小鼠耳部皮膚HE染色，測量其耳部皮膚厚度，結(jié)果如圖3所示，圖3A中刺激為涂抹了98%DNFB的小鼠右耳，未刺激為沒有涂抹98%DNFB的小鼠左耳。涂抹了98%DNFB的模型組小鼠與空白組比較，模型組小鼠耳部表皮厚度增厚;與模型組比較，各多糖復(fù)配組的小鼠耳部表皮厚度均顯著下降，其中復(fù)配1、復(fù)配4組的小鼠耳部表皮厚度接近空白組。

2.5各天然多糖組合物復(fù)配對小鼠背部炎癥皮膚組織中肥大細胞密度抑制情況

與空白組比較，模型組肥大細胞密度顯著升高;與模型組比較，各多糖復(fù)配組肥大細胞密度均顯著降低，見圖4。

2.6CAMP、MCP-1、IL-6在mRNA中的表達量

實時熒光定量PCR結(jié)果表明，與模型組相比，給予多糖復(fù)配1的小鼠背部全層皮膚組織中CAMPmRNA的表達量顯著升高，如圖5所示。

與空白組比較，模型組小鼠背部全層皮膚組織中MCP-1mRNA的表達量顯著升高。與模型組相比，給予多糖復(fù)配1、3、4、5組的小鼠背部全層皮膚組織中MCP-1mRNA的表達量明顯降低，給予多糖復(fù)配2、4組的小鼠背部全層皮膚組織中IL-6mRNA的表達量明顯降低。

03討論

患AD后，皮膚免疫屏障受損，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)下降，體內(nèi)肥大細胞活化，炎癥反應(yīng)增強[19-22]。肥大細胞是炎癥的主要啟動細胞，發(fā)生炎癥反應(yīng)時，肥大細胞向外周組織過度浸潤加劇、放大炎癥反應(yīng)[23-24]。

有研究表明，AD患者外周血中肥大細胞的數(shù)量增多。

AD慢性期，免疫屏障受損，白介素-6等Th1型細胞因子和趨化因子表達水平提高，Th2細胞因子蛋白表達受抑制，刺激肥大細胞、巨噬細胞等炎癥細胞增多[25-28]。但同時，患AD后，巨噬細胞的遷移過程受阻，吞噬作用降低，導(dǎo)致無法抵御污染源，MCP-1在巨噬細胞的遷移過程中起到至關(guān)重要的作用。研究表明，cAMP參與了多種重要炎癥信號通路的調(diào)控，如MAPKs、NF-κB、JAKSTAT等通路。

本研究通過DNFB誘導(dǎo)小鼠成功模擬AD模型。結(jié)果表明，通過給予多糖復(fù)配的小鼠皮膚狀況顯著好轉(zhuǎn)，明顯抑制了小鼠耳部及背部紅、腫等癥狀。

從組織學(xué)結(jié)果可以看出，南沙參多糖、枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖以及黃芩多糖組合物通過調(diào)節(jié)提升小鼠體內(nèi)Th1/Th2平衡，從而抑制了肥大細胞的活化，降低肥大細胞密度。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，多糖組合物提升了cAMP在mRNA中的表達水平，同時調(diào)節(jié)MAPKs、NF-κB通路中MCP-1的表達，增強了皮膚角質(zhì)層屏障功能，修復(fù)了受損細胞。同時，多糖組合物通過抑制白介素-6在mRNA的表達量，使機體Th1/Th2平衡得以調(diào)節(jié)以及巨噬細胞的活化，從而有效緩解了AD的癥狀。