鐘麗紅， 丘創(chuàng)華， 彭紫元， 佘吉佳

（1.深圳市第二人民醫(yī)院干部保健科，廣東 深圳 518000；2. 深圳市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518000）

目前，2型糖尿病的患病率持續(xù)升高。食用富含飽和游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）是導(dǎo)致肥胖和2型糖尿病的主要環(huán)境因素之一。為了維持正常的血糖水平，肥胖者對胰腺β細(xì)胞產(chǎn)生胰島素的需求很高，導(dǎo)致β細(xì)胞功能和存活受到不利影響。β細(xì)胞的再生潛力相對較低，受到損傷后可能會對葡萄糖穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生不利影響[1]。長期暴露于飽和FFA會引起β細(xì)胞中凋亡蛋白與生存蛋白之間的失衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡并可能導(dǎo)致2型糖尿病。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitinproteasome system，UPS）是生理未折疊蛋白反應(yīng)的一部分，可緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。有研究結(jié)果顯示，2型糖尿病患者胰島中的泛素化蛋白（ubiquitinated protein，Ub）水平顯著升高，高水平的蛋白質(zhì)泛素化與β細(xì)胞凋亡有關(guān)[2]，而蛋白質(zhì)泛素化增加和β細(xì)胞凋亡是否是UPS失活的繼發(fā)因素仍未知。本研究通過分析FFA引起的UPS失活是否構(gòu)成β細(xì)胞凋亡的上游信號通路，探討脂毒性應(yīng)激對B淋巴細(xì)胞瘤（B-cell lymphoma，Bcl）-2蛋白誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 小鼠飼養(yǎng)

將12只C57BL/6（野生型）小鼠飼養(yǎng)于37 ℃ 12 h明暗循環(huán)的房間中，可以自由獲取食物和水。以6只C57BL/6小鼠構(gòu)建PUMA-/-小鼠。給小鼠喂食高脂肪飲食（澳大利亞Specialty Feeds公司）72 h，營養(yǎng)成分為17.6%（W/W）蛋白質(zhì)、27%（W/W）脂肪，脂肪成分為14.59%的飽和脂肪、11.66%的單不飽和脂肪和0.53%的多不飽和脂肪。

1.2 小鼠胰島細(xì)胞和小鼠胰島瘤MIN6細(xì)胞培養(yǎng)

采用膠原酶P（瑞士R o c h e公司）和Histopaque-1077密度梯度分離液（美國Sigma公司）分離小鼠胰島β細(xì)胞。PUMA-/-小鼠胰島經(jīng)過洗滌，手工挑選，使用CMRL培養(yǎng)基1066[美國Invitrogen公司，含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS；美國JRH Biosciences公司）]在37 ℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。MIN6細(xì)胞購自美國ThermoFisher Scientific公司，使用Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司，含10%FBS）在37 ℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

1.3.1 處理組 分別用棕櫚酸酯（美國Sigma公司）、蛋白酶體抑制劑MG132（美國Sigma公司）處理MIN6細(xì)胞0（即刻）、2、4、8、24 h，檢測細(xì)胞蛋白酶體活性和細(xì)胞活性，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測活化轉(zhuǎn)錄因子（activated transcription factor，ATF）4 mRNA、重鏈結(jié)合蛋白（heavy-chain binding protein，Bip）mRNA、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，Chop）mRNA、p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子（p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）mRNA表達(dá)量，采用免疫印跡法檢測Bcl-2、Bcl-XL、髓細(xì)胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB；又稱Akt）蛋白表達(dá)量。用蘿卜硫烷（sulforaphan，SFN）、棕櫚酸酯、SFN+棕櫚酸酯分別處理小鼠胰島β細(xì)胞0（即刻）、2、4、8、24 h，檢測ATF 4 mRNA、Bip mRNA、Chop mRNA、PUMA mRNA和Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Akt表達(dá)以及細(xì)胞活性。具體處理方法：采用含1%FBS和1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的DMEM培養(yǎng)小鼠胰島細(xì)胞和MIN6細(xì)胞。將棕櫚酸酯溶于90%乙醇中，終濃度為0.5 mmol/L（含1%BSA），使未結(jié)合的FFA濃度在nmol/L級別[3]。將蛋白酶體抑制劑MG132和抗氧化劑SFN溶解在二甲基亞砜（美國Sigma公司）中，MG132和SFN的使用濃度均為10 μmol/L，均在培養(yǎng)基加入棕櫚酸酯前2 h加入。

1.3.2 對照組 按相同步驟培養(yǎng)和處理小鼠胰島細(xì)胞和MIN6細(xì)胞，但不加入MG132和SFN，僅加入等體積的二甲基亞砜溶劑。

1.4 蛋白酶體活性檢測

用10 μmol/L FFA或10 μmol/L棕櫚酸酯處理后，再使用含0.5% NonidetP-40的磷酸鹽緩沖液制備MIN6細(xì)胞裂解物，4 ℃ 10 000×g離心10 min，以清除細(xì)胞核和未裂解的細(xì)胞碎片。采用蛋白酶體活性測定試劑盒（美國BioVision公司，貨號K245-100）測定澄清的裂解物中的蛋白酶體活性。將7-氨基-4-甲基香豆素標(biāo)準(zhǔn)品、陽性對照和不同處理方式得到的MIN6細(xì)胞裂解樣本一式兩份裝入96孔板中，采用EnSpire多模式讀板器（美國Perkin Elmer公司）（激發(fā)波長350 nm、發(fā)射波長445 nm）在60 min內(nèi)平行測定樣本的蛋白酶體活性。嚴(yán)格按試劑盒和儀器說明書操作。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR

使用NucleoSpin RNA XS（德國 Macherey-Nagel公司）制備小鼠胰島細(xì)胞和MIN6細(xì)胞的RNA。使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Applied Biosystems公司）將600 ng RNA制備First strand cDNA。將制備的cDNA用去離子水1∶20稀釋。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測ATF4 mRNA、Bip mRNA、PUMA mRNA和Chop mRNA表達(dá)量。TaqMan PCR Master Mix試劑盒購自美國ABI公司，檢測儀器為RotorGene RG-3000熒光定量PCR儀（德國 Qiagen公司）。反應(yīng)體系：總體積為20 μL，包括SYBR mix 10 μL、H2O 5 μL、引物4 μL、Template 1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，42個循環(huán)；58 ～ 95 ℃收集熒光，通過熔解曲線評估PCR的特異性。收集目的基因Cq值，計(jì)算ΔCt值，分別與內(nèi)參基因β-actin的ΔCt值比較，得到-ΔΔCt值。

1.6 免疫印跡法

MIN6細(xì)胞培養(yǎng)和處理后，用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解總蛋白。12 000×g離心5 min后，用蛋白質(zhì)檢測試劑盒（美國伯樂公司）檢測蛋白質(zhì)濃度。用等量的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene floride，PVDF）膜上，4 ℃與一抗孵育過夜。一抗（美國ThermoFisher Scientific公司）分別為抗Bcl-2抗體（1∶1 000）、抗Bcl-XL抗體（1∶1 000）、抗Mcl-1抗體（1∶1 000）、抗Chop抗體（1∶1 000）、抗Akt抗體（1∶1 000）、抗Ub抗體（1∶1 000）。將PVDF膜與二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體，美國ThermoFisher Scientific公司）孵育2 h。最后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（南京諾維贊公司）檢測印跡，以β-actin為參照，分析Bcl-2、Mcl-1、Akt、Bcl-XL、Chop和Ub蛋白的表達(dá)量。

1.7 細(xì)胞活性評估

用胰蛋白酶將小鼠胰島β細(xì)胞和MIN6細(xì)胞分散成單個細(xì)胞，采用碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色分析DNA片段。采用DNA染料Hoechst-33342（含10 μg/mL Hoechst-33342）和PI（5 μg/mL）染色后，在BM-38XD型倒置熒光顯微鏡（上海彼愛姆公司）下觀察至少600個細(xì)胞，計(jì)算小鼠胰島β細(xì)胞和MIN6細(xì)胞凋亡的百分比。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad prism 6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用配對t檢驗(yàn)或ANOVA分析，然后進(jìn)行Bonferroni校正。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組MIN6細(xì)胞Ub水平、蛋白酶體活性和細(xì)胞活性比較

棕櫚酸酯組和FFA組的Ub水平分別為1.42±0.11、1.37±0.12，顯著高于對照組（1.01±0.03）（P＜0.05）。

與處理0 h比較，采用棕櫚酸酯處理MIN6細(xì)胞不同時(shí)間的蛋白酶體活性下降，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；采用MG132處理MIN6細(xì)胞8 h的蛋白酶體活性顯著降低（P＜0.05）；MG132處理MIN6細(xì)胞24 h的Ub水平顯著升高（P＜0.05）。棕櫚酸酯組和MG132組處理24 h后，MIN6細(xì)胞凋亡數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同處理組MIN6細(xì)胞Ub水平的比較及細(xì)胞凋亡情況

2.2 不同處理組MIN6細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)基因、蛋白表達(dá)量的比較

與0 h比較，棕櫚酸酯和MG132處理24 h后MIN6細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物ATF4 mRNA、Bip mRNA和Chop mRNA的表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同處理組MIN6細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)量比較

與0 h比較，棕櫚酸酯和MG132處理24 h后MIN6細(xì)胞Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。Mcl-1蛋白表達(dá)量呈先升后降趨勢，棕櫚酸酯處理2 h時(shí)Mcl-1蛋白表達(dá)量最高，顯著高于0 h（P＜0.05），處理24 h時(shí)顯著低于0 h（P＜0.05）；MG132處理2 h時(shí)Mcl-1表達(dá)量顯著高于0 h（P＜0.05），處理8 h時(shí)Mcl-1蛋白表達(dá)量最高，但處理24 h時(shí)Mcl-1蛋白表達(dá)量仍顯著高于0 h（P＜0.05）。見圖3。

圖3 不同處理組MIN6細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的比較

與0 h比較，棕櫚酸酯和MG132處理24 h后MIN6細(xì)胞的Akt蛋白表達(dá)量均顯著下降（P＜0.05），PUMA mRNA表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）。采用MG132處理野生型小鼠胰島細(xì)胞和PUMA-/-小鼠胰島細(xì)胞24 h后，野生型小鼠胰島細(xì)胞凋亡率顯著高于PUMA-/-小鼠（P＜0.05）。見圖4。

圖4 不同處理組MIN6細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、蛋白表達(dá)量的比較和不同小鼠胰島細(xì)胞凋亡情況

2.3 不同處理組β細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)基因、蛋白表達(dá)量的比較

棕櫚酸酯組β細(xì)胞凋亡率均顯著高于SFN組、SFN+棕櫚酸酯組和對照組（P＜0.05），SFN組、SFN+棕櫚酸酯組及對照組之間β細(xì)胞凋亡率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。棕櫚酸酯組AFT4蛋白、Chop蛋白、Bip蛋白和PUMA mRNA均顯著高于對照組（P＜0.05），而SFN+棕櫚酸酯組與對照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 棕櫚酸酯組、SFN組、SFN+棕櫚酸酯組及對照組之間β細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)基因、蛋白表達(dá)量的比較

3 討論

2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂所致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在胰島β細(xì)胞功能損傷中的作用和機(jī)制近年來逐漸引起學(xué)者們的重視。營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、脂質(zhì)過度負(fù)荷、脂蛋白合成增加以及病毒感染均可打破內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激包括3個反應(yīng)：未折疊蛋白反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)和固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應(yīng)。胰島β細(xì)胞具有高度發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最為敏感的細(xì)胞之一。ATF6、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶和Ⅰ型跨膜蛋白激酶/核糖核酸內(nèi)切酶是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的3種跨膜蛋白。正常情況下，這些跨膜蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白Bip穩(wěn)定結(jié)合，處于未激活狀態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過誘導(dǎo)Chop基因的表達(dá)，激活下游促凋亡基因表達(dá)，ATF4、ATF6和蛋白50（protein 50，p50）可增加Chop基因的表達(dá)。Chop促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡的機(jī)制包括：（1）下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)，Bcl-2主要存在于線粒體內(nèi)膜，可以抑制線粒體細(xì)胞色素c的釋放，從而減少胞質(zhì)細(xì)胞色素c激活半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶9導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡；（2）Chop基因表達(dá)增加可產(chǎn)生耗竭谷胱甘肽、促進(jìn)活性氧簇產(chǎn)生等效應(yīng)[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可通過Tribbles同源蛋白3、Akt和叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型（forkhead box O3a，F(xiàn)oxO3a）的復(fù)雜途徑引起B(yǎng)H3蛋白的PUMA活化，參與p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。有研究結(jié)果顯示，BH3蛋白PUMA在棕櫚酸酯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用[4]。

在脂毒性作用下，β細(xì)胞中UPS的失活機(jī)制可能包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制。有研究結(jié)果顯示，棕櫚酸酯可誘導(dǎo)人胰島中PSMC4和PSMA7基因上調(diào)及PSMD8和PSMB10基因下調(diào)[5]，這些基因與蛋白酶體的功能和活性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)FA和棕櫚酸酯可顯著提升氧化應(yīng)激相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)量，同時(shí)Ub表達(dá)量顯著升高、蛋白酶體活性降低，提示在脂毒性作用下，β細(xì)胞的蛋白酶體活性降低，與SHANG等[6]的研究結(jié)論（由于FFA和棕櫚酸酯的氧化增加了活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致UPS發(fā)生轉(zhuǎn)錄后失活，改變了蛋白酶體的圓柱結(jié)構(gòu)）一致。有研究結(jié)果顯示，在給小鼠喂食高脂飼料或人類食用高脂肪飲食后會產(chǎn)生過量的飽和脂肪，過量飽和脂肪可能會抑制與UPS相關(guān)的酶的活性[7]。另外，U3泛素連接酶活性改變等替代途徑也可能有助于棕櫚酸酯誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)泛素化[8]。本研究結(jié)果顯示，棕櫚酸酯處理24 h后MIN6細(xì)胞ATF4 mRNA、Bip mRNA和Chop mRNA表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），與文獻(xiàn)報(bào)道[9]一致，提示棕櫚酸酯可增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物ATF4、Chop和Bip的表達(dá)，介導(dǎo)β細(xì)胞凋亡。棕櫚酸酯處理24 h后Akt表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），PUMA mRNA表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），棕櫚酸酯組β細(xì)胞凋亡率均顯著高于SFN組、SFN+棕櫚酸酯組和對照組（P＜0.05），SFN組、SFN+棕櫚酸酯組及對照組之間β細(xì)胞凋亡率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），證實(shí)SFN可預(yù)防棕櫚酸酯誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。本研究中，棕櫚酸酯組AFT4蛋白、Chop蛋白、Bip蛋白和PUMA mRNA均顯著高于對照組（P＜0.05），而SFN+棕櫚酸酯組與對照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明SFN能夠降低棕櫚酸酯誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物AFT4、Chop、Bip和PUMA的表達(dá)，提高蛋白折疊能力，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)擔(dān)，有利于恢復(fù)β細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和維持β細(xì)胞存活。

值得注意的是，UPS失活引起的細(xì)胞死亡與SFN激活的蛋白酶體相反。蛋白酶體激活劑SFN在研究中被建議作為針對各種糖尿病并發(fā)癥（腎病和主動脈損傷等）的可能治療方法[10]。β細(xì)胞中SFN保護(hù)的機(jī)制包括Ub減少、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕、PUMA激活以及Bcl-2蛋白上調(diào)。SFN還可通過滅活氧化應(yīng)激來誘導(dǎo)β細(xì)胞保護(hù)[11]。長時(shí)間的SFN暴露可以減弱胰島β細(xì)胞中葡萄糖刺激的胰島素分泌[12]。

綜上所述，F(xiàn)FA和棕櫚酸酯可產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致UPS調(diào)節(jié)失活，Ub水平升高，引起蛋白酶體結(jié)構(gòu)改變，活性降低，從而導(dǎo)致相關(guān)凋亡基因啟動，促使胰島β細(xì)胞凋亡。SFN能夠降低氧化應(yīng)激標(biāo)志物的表達(dá)水平，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，激活蛋白酶體活性，從而減少胰島β細(xì)胞的凋亡。本研究闡明了FFA誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為2型糖尿病的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。