楊慧　王琳　萬慧偉　周雯雯　李鐵山

[摘要]目的比較關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射A型肉毒毒素（BoNT/A）和倍他米松對單碘乙酸鈉（MIA）誘導的大鼠骨關(guān)節(jié)炎疼痛的作用。方法向大鼠踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA誘導骨關(guān)節(jié)炎模型，將造模成功的大鼠隨機分為生理鹽水組、倍他米松組、BoNT/A組，每組15只，分別向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入生理鹽水25 μL、復(fù)方倍他米松25 μL、BoNT/A 25 μL（5 U），并于給藥后0、1、3、7、14、21 d評估大鼠患肢機械性刺激撤足閾值（PWT）及負重情況;應(yīng)用蛋白印跡法檢測給藥7、14、21 d后大鼠脊髓背角內(nèi)P2X4R的表達情況。結(jié)果倍他米松組大鼠給藥后3、7 d的PWT值較生理鹽水組改善明顯（F=2.74、3.14，P<0.05），給藥后各時間點大鼠后肢支撐力百分比與生理鹽水組相比差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;BoNT/A組大鼠給藥后14、21 d的PWT值較生理鹽水組改善明顯（F=11.90、13.25，P<0.01），后肢支撐力百分比在給藥7、14、21 d改善明顯（F=2.80～127.02，P<0.05）。BoNT/A能抑制脊髓背角內(nèi)P2X4R的表達（F=43.04～150.36，P<0.05），而倍他米松對其無影響。結(jié)論與倍他米松相比，BoNT/A治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛起效時間慢，但其鎮(zhèn)痛作用持續(xù)時間更長，鎮(zhèn)痛效果更明顯。

[關(guān)鍵詞]骨關(guān)節(jié)炎;A型肉毒毒素;倍他米松;關(guān)節(jié)痛;受體，嘌呤能P2X4

[中圖分類號]R684.3[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2022）02-0279-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.043[開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20220311.1335.014.html;2022-03-1414：41：55

COMPARISON OF THE ANALGESIC EFFECTS BETWEEN BOTULINUM TOXIN A AND BETAMETHASONE IN RATS WITH OSTEOARTHRITIS? YANG Hui， WANG Lin， WAN Huiwei， ZHOU Wenwen， LI Tieshan（The Second Department of Rehabi-litation， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo compare the analgesic effects of intra-articular injection of botulinum toxin A （BoNT/A） and betamethasone on rats with osteoarthritis pain induced by sodium monosodium iodoacetate （MIA）. MethodsThe rats received intra-articular injection of MIA to their ankles to induce an osteoarthritis model. The model rats were randomly divided into normal saline group （n=15）， betamethasone group （n=15）， and BoNT/A group （n=15）， which received intra-articular injection of 25 μL of normal saline， 25 μL of compound betamethasone， and 25 μL （5 U） of BoNT/A， respectively. The mechanical paw withdrawal threshold and weight bearing of the affected limb were evaluated on the 0， 1st， 3rd， 7th， 14th， and 21st day after administration. Western blot was used to determine the expression of P2X4R in the spinal dorsal horn of rats on 7，14， and 21 d after administration. ResultsOn days 3 and 7 after administration， the rats in the betamethasone group had significantly improved mechanical paw withdrawal threshold compared with those in the normal saline group （F=2.74，3.14;P<0.01）. At each time point after administration， there was no significant difference in the percentage weight-bearing of the affected limb between the rats in the betamethasone group and the normal saline group （P>0.05）. The rats in the BoNT/A group had significantly improved mechanical paw withdrawal threshold compared with those in the normal saline group on days 14 and 21 after administration （F=11.90，13.25;P<0.01） and significantly improved percentage weight-bearing of the affected limb on days 7，14， and 21 after administration （F=2.80-127.02，P<0.05）. BoNT/A inhibited the expression of P2X4R in the spinal dorsal horn （F=43.04-150.36，P<0.05）， while betamethasone had no effect on it. ConclusionCompared with betamethasone， BoNT/A has a slower onset time in the treatment of osteoarthritis pain， but it exhibits a longer and better analgesic effect.

[KEY WORDS]osteoarthritis; botulinum toxin type A; betamethasone; arthralgia; receptors， purinergic P2X4

骨關(guān)節(jié)炎疼痛是最常見的慢性疼痛之一[1]，雖止痛治療辦法多，但多存在效果差、持續(xù)時間短、副作用大等缺陷[2]，因此需尋求新的鎮(zhèn)痛藥物。近年來A型肉毒毒素（BoNT/A）的鎮(zhèn)痛作用受到了人們越來越多的關(guān)注[3-5]，其具有單次給藥、鎮(zhèn)痛作用時間長、副作用少等優(yōu)點。本研究擬觀察關(guān)節(jié)腔注射BoNT/A對大鼠骨關(guān)節(jié)炎疼痛的鎮(zhèn)痛作用，并與常用關(guān)節(jié)腔注射藥物倍他米松進行比較，以進一步評估BoNT/A對骨關(guān)節(jié)炎疼痛的治療效果，并探討B(tài)oNT/A可能的鎮(zhèn)痛機制。

1材料與方法

1.1實驗材料

雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量170～200 g，由青島大學實驗動物中心提供。所有大鼠均飼養(yǎng)在青島大學實驗動物中心，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，大鼠可以自由獲得食物和水。室內(nèi)溫度維持在22 ℃，明暗交替12 h/12 h。適應(yīng)喂養(yǎng)7 d后用于實驗。纖毛機械痛刺激儀（美國North Coast公司）;通道式鼠足支撐力測量儀（濟南益延科技有限公司）;凝膠成像分析系統(tǒng)（美國UVP公司）。BoNT/A（美國Allergan公司）;復(fù)方倍他米松（濃度為7 g/L，杭州默沙東制藥有限公司），單碘乙酸鈉（MIA，購自美國Sigma公司），兔抗大鼠P2X4嘌呤受體（P2X4R）抗體、FITC標記山羊抗兔 IgG（BiossAntibodies公司）。

1.2動物模型制備及分組

參照HAVELIN等[6]方法建立大鼠踝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎疼痛模型。消毒大鼠踝關(guān)節(jié)周圍的皮膚，按住大鼠左腿，定位腓骨外踝窩，用28號針垂直插入皮膚，然后插入左脛骨跗骨關(guān)節(jié)腔，向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射80 g/L的MIA 50 μL構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎模型。同時隨機選取12只大鼠向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射50 μL生理鹽水作為對照組。21 d后測量大鼠造模側(cè)及對側(cè)后爪的機械刺激撤足閾值（PWT）及負重情況，測量3次，將出現(xiàn)PWT及負重較對測后肢明顯下降的行為學表現(xiàn)穩(wěn)定者納入實驗并作為模型組。造模21 d后，將模型組SD大鼠隨機分為生理鹽水組（A組）、倍他米松組（B組）、BoNT/A組（C組），每組15只，分別向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射25 μL生理鹽水、25 μL復(fù)方倍他米松以及5 U的BoNT/A（25 μL）。

1.3疼痛行為學測試

分別于造模前1 d，造模后21 d及給藥后0、1、3、7、14、21 d，從各組中隨機抽取6只大鼠進行疼痛行為學測定。①PWT測定：將大鼠放置在一個底部為網(wǎng)格的特殊樹脂玻璃格子（26 cm×20 cm×14 cm）中適應(yīng)20 min后，應(yīng)用一系列強度遞增的纖毛（0.4、0.6、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 g）按up and down的方法[7]從2.0 g開始垂直刺激大鼠左側(cè)足底部皮膚，每次刺激足底時間維持5 s，若在規(guī)定時間內(nèi)大鼠出現(xiàn)縮足、舔腳等陽性反應(yīng)時更換相鄰小一級的纖毛測試，若無反應(yīng)則更換大一級的纖毛測試，每次刺激間隔為5 min，測試上限和下限的纖毛強度分別為15.0 g和0.4 g。計算50%縮足反應(yīng)的閾值，以此結(jié)果作為PWT評估指標。②后肢支撐力百分比測定：訓練大鼠通過隧道爬到一個有角度的樹脂玻璃室的平臺，使大鼠的后肢分開放置在兩個稱量梯架上，安靜穩(wěn)定停留5 s后，使用儀器分別計算雙下肢的支撐力，測量3次取平均值，數(shù)據(jù)結(jié)果規(guī)范化為左/（左+右）的百分比，正常值為50%表明雙側(cè)后肢重量分布是相等的。

1.4蛋白印跡法檢測P2X4R蛋白表達

分別于造模21 d及給藥后7、14、21 d，各組隨機取3只大鼠，用100 g/L水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后處死動物，迅速分離大鼠L4～L6脊髓節(jié)段，研磨成勻漿，制成蛋白懸液，取等量的組織蛋白樣品（含組織蛋白40 μg）加到聚丙烯酰胺凝膠電泳槽中，濃縮膠恒壓80 V約30 min，質(zhì)量濃度為150 g/L分離膠恒壓100 V 約90 min，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），恒流200 mA電轉(zhuǎn)移 90 min，于50 g/L脫脂奶粉封閉液中室溫下?lián)u床封閉 2 h，加入山羊抗大鼠P2X4R和GAPDH抗體孵育過夜，使用TBST漂洗后，將FITC標記山羊抗兔IgG室溫搖床孵育2 h，使用TBST漂洗后滴加發(fā)光液顯色成像，通過Image J 1.36軟件分析目標條帶灰度值。以P2X4R/GAPDH的灰度比值表示P2X4R的相對表達量。

1.5統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料結(jié)果以x±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗;多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析和重復(fù)測量雙因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠不同時間PWT比較

造模前，各組大鼠注射側(cè)后足PWT差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。關(guān)節(jié)腔內(nèi)MIA 注射21 d后，對照組、模型組大鼠注射側(cè)后足的PWT值分別為（18.67±5.68）、（0.70±0.64）g，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=7.699，P<0.01）。重復(fù)測量雙因素方差分析顯示，大鼠PWT不同組別、時間及組別與時間交互作用差異均有顯著意義（F=7.96，F(xiàn)=22.55，F(xiàn)=3.73，P<0.01）。組內(nèi)比較，倍他米松組及BoNT/A組大鼠各時間點PWT比較差異有顯著性（F=3.58、17.02，P<0.05），其中倍他米松組大鼠PWT在給藥后逐漸上升，7 d時達到高峰，隨后逐漸下降;而BoNT/A組大鼠PWT在給藥后逐漸上升，21 d時達到峰值，且有繼續(xù)上升的趨勢; 生理鹽水組大鼠給藥后各時間點PWT差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。組間不同時間點比較，倍他米松組大鼠給藥后3 d和7 d 時PWT較生理鹽水組改善明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（F=2.74、3.14，P<0.05），而14 d和21 d差異無顯著性（P>0.05）;BoNT/A組大鼠給藥后14、21 d時PWT較生理鹽水組改善明顯（F=11.90、13.25，P<0.01）。見表1。

2.2各組大鼠不同時間后肢支撐力百分比比較

造模前，各組大鼠左側(cè)后肢支撐力百分比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。關(guān)節(jié)腔內(nèi)MIA注射21 d后，對照組、模型組大鼠左側(cè)后肢支撐力百分比分別為（51.27±5.22）%、（35.03±1.67）%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=7.261，P<0.001）。重復(fù)測量雙因素方差分析顯示，后肢支撐力百分比不同組別、時間及組別與時間交互作用差異均有顯著性（F=102.89，F(xiàn)=25.63，F(xiàn)=5.15，P<0.01）。組內(nèi)比較，各組大鼠給藥后后肢支撐力百分比隨給藥時間逐漸變化，差異有顯著性（F=8.21～150.55，P<0.01）。組間比較，各時間點倍他米松組大鼠后肢支撐力百分比與生理鹽水組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;BoNT/A組給藥后7、14、21 d大鼠后足支撐力百分比均較生理鹽水組改善明顯（F=2.80～127.02，P<0.05）。見表2。

2.3各組P2X4R表達比較

關(guān)節(jié)腔內(nèi)MIA注射21 d，對照組、模型組大鼠脊髓背角內(nèi)P2X4R蛋白表達量分別為0.68±0.26、1.20±0.11，兩組比較差異有顯著性（t=-3.178，P<0.05）。與生理鹽水組相比，給藥后7、14、21 d時BoNT/A組大鼠脊髓背角內(nèi)P2X4R蛋白表達減少，差異有統(tǒng)計學意義（F=43.04～150.36，P<0.05）;而各時間點倍他米松組與生理鹽水組比較，脊髓背角內(nèi)P2X4R的蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

3討論

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的關(guān)節(jié)退行性疾病，疼痛是其最主要的癥狀，嚴重影響了病人的日常生活。目前對骨關(guān)節(jié)炎疼痛的治療主要包括藥物及非藥物治療，藥物治療包括口服（非甾體類抗炎藥、骨關(guān)節(jié)炎慢作用藥、軟骨保護劑及阿片類藥物等）、關(guān)節(jié)腔注射（糖皮質(zhì)激素（激素）、透明質(zhì)酸等），非藥物治療包括衛(wèi)生宣教、體育鍛煉、減肥和針灸等[8]。雖然治療方法比較多，但存在疼痛緩解不足、藥物副作用大等問題。對骨關(guān)節(jié)炎疼痛的治療仍是一個急需解決的問題。

本文研究采用踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA方法誘導大鼠骨關(guān)節(jié)炎疼痛，結(jié)果顯示，MIA能夠?qū)е麓笫驪WT及后肢支撐力百分比明顯下降，這與相關(guān)研究結(jié)果相一致[9];關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射倍他米松在給藥后早期（3、7 d）能明顯改善大鼠患側(cè)后肢PWT（評估誘發(fā)性疼痛指標），但對大鼠后肢支撐力的變化（評估非誘發(fā)性疼痛指標）無明顯影響;但關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射BoNT/A對大鼠PWT及后肢支撐力均有改善作用，并且這種作用可持續(xù)至給藥后21 d，甚至更久，但其起效時間較倍他米松晚（7 d以后）。本文結(jié)果還顯示，BoNT/A組大鼠注射側(cè)后肢PWT及支撐力百分比明顯高于倍他米松組。以上結(jié)果表明，倍他米松與BoNT/A對骨關(guān)節(jié)炎疼痛均具有鎮(zhèn)痛作用，相較于倍他米松，雖然BoNT/A治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛起效時間較慢，但其鎮(zhèn)痛作用持續(xù)時間更長、效果更明顯。

倍他米松是關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療最常用的激素之一，其能抑制炎癥遞質(zhì)IL-6和IL-8等的表達，從而消除關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥，減輕組織水腫而迅速發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[10]，這可能與倍他米松注射早期即可改善大鼠患側(cè)后肢PWT有關(guān)。但骨關(guān)節(jié)炎并不是單純的炎癥性疼痛，許多臨床及前臨床試驗證實骨關(guān)節(jié)炎中還存在神經(jīng)病理性疼痛[11-13];本實驗所使用的MIA誘導的動物模型同樣被證實存在關(guān)節(jié)周圍神經(jīng)的損傷[6，14-15]。而倍他米松缺乏對神經(jīng)病理性痛的調(diào)節(jié)作用，這可能是其對后肢支撐力（更能反映神經(jīng)病理性痛中自發(fā)性疼痛特點）的變化無明顯影響的原因。P2X4R是一種主要表達于脊髓小膠質(zhì)細胞上、與神經(jīng)病理性痛產(chǎn)生和維持密切相關(guān)的嘌呤受體。當周圍神經(jīng)損傷后，脊髓背角內(nèi)小膠質(zhì)細胞上的P2X4R表達明顯上調(diào)，與脊髓背角內(nèi)增多的ATP相結(jié)合后誘導脊髓小膠質(zhì)細胞活化，活化的脊髓小膠質(zhì)細胞釋放神經(jīng)源性營養(yǎng)因子BDNF，作用于中間抑制神經(jīng)元上的TRK-B受體，使中間抑制神經(jīng)元超極化，產(chǎn)生去抑制作用，從而使神經(jīng)元興奮性增高，產(chǎn)生痛覺過敏及痛覺超敏[16-17]。抑制P2X4R或敲除大鼠P2X4R基因能使坐骨結(jié)扎大鼠疼痛行為缺失[17-18]。本實驗同樣顯示關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA 21 d后L4～L6脊髓節(jié)段內(nèi)P2X4R的表達上調(diào)，表明MIA誘導的骨性關(guān)節(jié)炎中可能存在神經(jīng)病理性痛;而關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射BoNT/A能明顯逆轉(zhuǎn)這種MIA誘導的P2X4R蛋白表達的升高，表明BoNT/A有可能通過影響P2X4R蛋白的表達而對骨關(guān)節(jié)炎的神經(jīng)病理性痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。而BoNT/A如何影響P2X4R蛋白水平，是否能對其產(chǎn)生直接的作用仍需進一步的研究。有研究顯示，BoNT/A不僅能在注射部位發(fā)揮作用，還能通過逆向軸漿運輸?shù)竭_背根神經(jīng)節(jié)，影響TRPV1的表達產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果[19]。更有實驗發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射BoNT/A可逆向軸漿運輸至脊髓背角內(nèi)[20]。既往研究表明，BoNT/A不僅能作用于神經(jīng)元細胞，還能作用于脊髓小膠質(zhì)細胞，調(diào)節(jié)兩者之間的相互作用而對神經(jīng)病理性痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[21]。已有體外實驗結(jié)果顯示，BoNT/A能夠逆轉(zhuǎn)Lipopolysaccharide誘導的脊髓小膠質(zhì)細胞的激活[22]，說明BoNT/A對小膠質(zhì)細胞有直接作用。我們小組既往研究結(jié)果顯示，BoNT/A在分子構(gòu)型上與P2X4R有很強的親和力[23]。提示BoNT/A有可能通過逆向軸漿運輸?shù)郊顾鑳?nèi)對P2X4R產(chǎn)生直接的調(diào)節(jié)作用。此外，我們前期研究也顯示，在CFA誘導的難治性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射BoNT/A能通過抑制踝關(guān)節(jié)腔滑膜內(nèi)炎癥遞質(zhì)IL-1β的釋放，減輕局部滑膜炎癥，從而緩解大鼠疼痛相關(guān)行為[24]，表明BoNT/A還存在抗炎作用。也就是說BoNT/A不僅能對骨關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥性疼痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，還能對骨關(guān)節(jié)炎大鼠的神經(jīng)病理性痛進行調(diào)節(jié)，這可能是BoNT/A鎮(zhèn)痛作用優(yōu)于倍他米松的原因。但BoNT/A關(guān)節(jié)腔注射后需要經(jīng)神經(jīng)末梢吸收發(fā)揮作用，BoNT/A是一種大分子蛋白，經(jīng)神經(jīng)末梢吸收緩慢，這可能是其鎮(zhèn)痛作用相較于倍他米松滯后的原因。

綜上所述，倍他米松以及BoNT/A均能緩解MIA誘導的骨關(guān)節(jié)炎大鼠的疼痛行為;但相較于倍他米松，BoNT/A治療的鎮(zhèn)痛作用更明顯，作用時間更長，并且在實驗過程中未觀察到明顯不良反應(yīng)。倍他米松的鎮(zhèn)痛作用更多依賴于其抗炎作用，隨著抗炎效果的消退，其鎮(zhèn)痛作用也逐漸減退。BoNT/A不僅具有抗炎作用，還能通過調(diào)節(jié)脊髓背角內(nèi)P2X4R蛋白的表達而緩解骨關(guān)節(jié)炎的神經(jīng)病理性痛，而且BoNT/A在體內(nèi)神經(jīng)元中的活性可持續(xù)長達5個月[25]，可對脊髓背角內(nèi)P2X4R蛋白的表達產(chǎn)生持久的調(diào)節(jié)作用，這可能是BoNT/A相較于倍他米松具有更持續(xù)鎮(zhèn)痛效果的原因。因此，就骨關(guān)節(jié)炎治療遠期效果而言，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射BoNT/A優(yōu)于倍他米松。

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（本文編輯黃建鄉(xiāng)）