袁兆豐，楊秀梅，王 丹

北大荒完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司，黑龍江哈爾濱150000

0 引言

牛乳中主要包含酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白和乳鐵蛋白等。其中酪蛋白是乳蛋白的主要存在形式，占乳蛋白總量的80%，含有人體必需的8 中氨基酸[1]；β-酪蛋白是一種主要的酪蛋白，由209 個(gè)氨基酸殘基組成，磷酸化前的一級結(jié)構(gòu)分子質(zhì)量為23.6 kDa[2]，占牛乳蛋白總量的24%～28%[3]。

A2β-酪蛋白是現(xiàn)代奶牛β-酪蛋白的天然原型。早期所有家養(yǎng)奶牛只含有A2β-酪蛋白，后因自然基因突變，出現(xiàn)了A1β-酪蛋白的變體，經(jīng)過長期的繁衍，導(dǎo)致全球奶牛普遍出現(xiàn)了A1 型奶牛、A1A2型奶牛和A2型奶牛。A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)區(qū)別主要是第67位的氨基酸不同[4]，A1 β-酪蛋白是組氨酸，分子量155 Da，A2β-酪蛋白是脯氨酸，分子量115.13 Da。A1 β-酪蛋白和 A2 β-酪蛋白的分子量相差39.87 Da，占β-酪蛋白分子量23.6 kDa的0.17 %。A1 β-酪蛋白和 A2 β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差非常小，不到千分之二。

通過消化酶的作用，A1β-酪蛋白可能產(chǎn)生β-酪啡肽-7（BCM-7），而A2β-酪蛋白不會產(chǎn)出或很少產(chǎn)出β-酪啡肽-7（BCM-7）[5]。BCM-7是一種外啡肽，可與機(jī)體多種系統(tǒng)相互作用。多項(xiàng)研究表明，A1β-酪蛋白或BCM-7與部分嬰兒的I型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)升高[6]，免疫反應(yīng)功能性障礙、消化功能紊亂、呼吸功能障礙以及易得自閉癥之間存在關(guān)聯(lián)[7]。另有研究表明，A2β-酪蛋白不僅不會生成BCM-7，而且與母乳中的β-酪蛋白相似，更有利于促進(jìn)嬰幼兒的生長發(fā)育。

本試驗(yàn)在原有檢測方法的基礎(chǔ)上，只改變柱溫和梯度洗脫中部分時(shí)間段的流動相比例，使A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白能夠更好的分離，為牛乳中A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白的進(jìn)一步研究和嬰幼兒配方乳粉開發(fā)提供參考。

1 原理與方法流程

1.1 原理

乳及其制品加水溶解后，吸取1 mL液態(tài)樣品加入一定量的蛋白質(zhì)變性劑鹽酸胍和還原劑二硫蘇糖醇等化學(xué)藥品，經(jīng)前處理后高速低溫離心，離心結(jié)束后取出離心管，快速除去表層乳脂，取下清液加入鹽酸胍溶液后過濾膜上機(jī)檢測，在柱溫50 ℃條件下，使用0.1 %三氟乙酸溶液和乙腈，通過梯度洗脫分離上機(jī)樣液中的A1β-酪蛋白、A2β-酪蛋白，高效液相紫外色譜儀214 nm波長下檢測，外標(biāo)法定量。

1.2 步驟

1．2．1 試劑耗材

乙腈（C2H3N）（色譜純），三氟乙酸（色譜純），雙-三羥甲基氨基甲烷（分析純），鹽酸胍（分析純），檸檬酸鈉（分析純），二硫蘇糖醇（分析純），β-酪蛋白（β-Casein，CAS號：9000-71-9），純度≥98 %，C8色譜柱，4.6 mm×150 mm，3.6 μm。

1．2．2 試劑配制

試劑I：分別稱取雙-三羥甲基氨基甲烷0.2092 g，鹽酸胍5.7318 g，檸檬酸鈉0.0139 g，二硫蘇糖醇0.0301 g，加0.1%三氟乙酸溶液5 mL，充分溶解后定容10.0 mL，混勻得雙-三羥甲基氨基甲烷0.1 mol/L，鹽酸胍6 mol/L，檸檬酸鈉5.37 mmol/L，二硫蘇糖醇19.5 mmol/L混合溶液。

試劑II：稱取鹽酸胍4.2989 g，加0.1 %三氟乙酸溶液5.00 mL充分溶解后定容10.0 mL，混勻得4.5 mol/L鹽酸胍溶液。

流動相A 0.1 %三氟乙酸水溶液：吸取1.00 mL三氟乙酸于1 000 mL容量瓶中，水定容，混勻；流動相B純乙腈。

β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：將大塊的β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分成小片絮狀后放入25 mL小燒杯，在使用注射器加水時(shí)有助于更好的溶解，水平晃動燒杯，不可渦漩，防止泡沫產(chǎn)生[8]，溶解后轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶用超純水定容，混勻后1.0 mL分裝在1.5 mL離心管中，-20 ℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)取，避免反復(fù)融化冷凍，可穩(wěn)定保存3 個(gè)月。

1．2．3 試樣處理

稱取1 g固體試樣，溫水溶解，冷卻后定容10 mL，混勻。

液體奶試樣不用稀釋，吸取液態(tài)樣品1.00 mL轉(zhuǎn)入2.00 mL離心管中，向2.00 mL離心管中加入1 mL試劑I振蕩混勻后，靜置1 h，轉(zhuǎn)速6 000 r/min、4 ℃離心10 min，離心結(jié)束后取出離心管，快速除去表層乳脂，取底層溶液300.0 μL轉(zhuǎn)移到新的2.00 mL離心管中，加入試劑II 900.0 μL，混勻，過針式濾膜上機(jī)備用。

1．2．4 檢測條件

檢測波長214 nm，柱溫50 ℃，流動相A （0.1 %三氟乙酸水溶液），流動相B（乙腈），梯度洗脫條件如表1。

表1 梯度洗脫條件

1.3 線性相關(guān)

配制β-酪蛋白系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，5 個(gè)濃度點(diǎn)3 個(gè)平行上機(jī)檢測，以各濃度為橫坐標(biāo)，各濃度峰面積平均值為縱坐標(biāo)繪制線性方程。

1.4 正確度、精密度

β-酪蛋白含量做低、中、高三水平加標(biāo)回收試驗(yàn)，各濃度水平6 個(gè)平行，按試樣處理方法處理加標(biāo)樣品，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.5 結(jié)果計(jì)算

A2β-酪蛋白和 A1β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差非常小，不到千分之二，其性質(zhì)非常接近，兩目標(biāo)峰比較接近（圖1），A1β-酪蛋白濃度占比與A1 β-酪蛋白峰面積占比相當(dāng)，A2β-酪蛋白濃度占比與A2β-酪蛋白峰面積占比相當(dāng)。β-酪蛋白的主要成分為A1型和A2型，通過面積歸一化法，A1β-酪蛋白和 A2β-酪蛋白峰面積和為總峰面積，A1β-酪蛋白峰面積占總峰面積百分比w1，A2β-酪蛋白峰面積占總峰面積百分比w2。計(jì)算公式見公式（1），公式（2）。

圖1 β 酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在不同檢測條件下的峰型比較

計(jì)算公式：

公式（1）、（2）中：

w1----A1 β-酪蛋白濃度修正系數(shù)，單位百分比（%）；

w2----A2 β-酪蛋白濃度修正系數(shù)，單位百分比（%）；

i----標(biāo)準(zhǔn)曲線的中第i個(gè)濃度級別，（i取1、2、3、···、n）；

n----標(biāo)準(zhǔn)曲線中濃度級別的個(gè)數(shù)，（n取1、2、3、···、n）；

Sa----積分得A1 β-酪蛋白峰面積；

Sb----積分得A2 β-酪蛋白峰面積；

Σ----求和函數(shù)符號，i從1開始到n取整數(shù)。

標(biāo)準(zhǔn)系列工作液β-酪蛋白濃度為A1β-酪蛋白與A2β-酪蛋白濃度的和。則A1β-酪蛋白濃度占比為w1，A2β-酪蛋白濃度占比為w2，β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)系列工作液各濃度點(diǎn)的w1、w2取平均值分別作為A1 β-酪蛋白和 A2β-酪蛋白的修正系數(shù)。

通過標(biāo)準(zhǔn)系列工作液β-酪蛋白濃度計(jì)算的A1 β-酪蛋白與A2β-酪蛋白在乘以各自的修正系數(shù)后，即為樣品中檢測的A1β-酪蛋白與A2β-酪蛋白濃度，根據(jù)稱樣質(zhì)量，定容體積計(jì)算樣品中A1β-酪蛋白與A2β-酪蛋白的含量。計(jì)算公式見公式（3）。

公式（3）中：

X----試樣中A1β-酪蛋(A2β-酪蛋白)含量，單位毫克每克（mg/g）；

c----由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中β-酪蛋白的濃度，單位毫克每毫升（mg/mL）；

V----試樣定容體積，單位毫升（mL）；

f----稀釋倍數(shù)；

V1----液態(tài)試樣取樣體積，單位毫升（mL）

V2----加入試劑I的體積，單位毫升（mL）；

V3----樣液離心后提取澄清液的體積，單位毫升（mL）；

V4----加入試劑II的體積，單位毫升（mL）；

w----試樣中A1 β-酪蛋（A2 β-酪蛋白）濃度修正系數(shù)，單位%；

m----樣品的稱樣質(zhì)量，單位克（g）。

2 檢測結(jié)果分析

2.1 不同檢測條件的檢測結(jié)果比較

相同條件下，只改變柱溫和部分時(shí)間段的流動相比例，柱溫45 ℃，A流動相占比：12 min時(shí)59 %、15 min時(shí)61.5 %（圖1紅色線圖譜）；柱溫50 ℃，A流動相占比：12 min時(shí)60 %、15 min時(shí)58.5 %（圖1黑色線圖譜），梯度洗脫中改變乙腈的變化趨勢，提高柱溫，能夠更好的分離A1β-酪蛋白與A2β-酪蛋白。

2.1 線性關(guān)系

使用β酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，流動相B（乙腈），A（0.1 %三氟乙酸水溶液），流速0.5 mL/min梯度洗脫，柱溫50 ℃，反相色譜柱進(jìn)行分離，紫外檢測器214 nm檢測。A1 β-酪蛋白與A2 β-酪蛋白的出峰時(shí)間穩(wěn)定（圖2），回歸方程：A1 β-酪蛋白，y=1.25×106x-1.44×105，R2=0.9985，R=0.9992；A2 β-酪蛋白y=3.16×106x-3.16×105，R2=0.9988，R=0.9994。A1 β-酪蛋白在0.16～1.65 mg/mL和A2 β-酪蛋白在0.34～3.35 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2、 A1β-酪蛋白、A2β-酪蛋白各濃度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)工作液

2.2 精密度、正確度

對奶樣做三水平加標(biāo)回收試驗(yàn)，A1β-酪蛋白精密度小于2.0 %，回收率范圍96.4%～105.0%；A 2 β-酪蛋白精密度小于2.0 %，回收率范圍97.5%～105.0%。圖3為β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和奶樣中A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白。

圖3 β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與奶樣中A1 β-酪蛋白和A2 β-酪蛋白的峰型及出峰時(shí)間比對

3 結(jié)論

奶樣經(jīng)前處理后，在低溫離心機(jī)離心后，吸取下層的酪蛋白，經(jīng)稀釋后上機(jī)檢測。在柱溫50 ℃時(shí)，梯度洗脫條件下，在4.6 mm×150 mm，3.6 μm的C8色譜柱中，A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白能夠有效的分離，通過β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量，再通過A1β-酪蛋白與A2β-酪蛋白修正系數(shù)，對A1 β-酪蛋白與A2β-酪蛋白的含量做修正計(jì)算。通過分析檢測結(jié)果，說明檢測方法線性關(guān)系良好，具有較好的精密度和正確度，可以對乳制品中的A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白做定量分析，具有較高的穩(wěn)定新。C