王涵，艾合買提江·艾海提

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046)

胡桃又叫核桃，被譽為“萬歲子”、“長壽果”[1]，是一種營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價值都很高的珍貴果木[2]。胡桃葉含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素B、維生素C及胡蘿卜素等，也含有豐富的生物活性物質(zhì)，如核桃醌、核桃甙等。胡桃葉的藥理功能在我國民間早有記載，其制劑能改善新陳代謝，促進(jìn)機體強壯，對患維生素缺乏癥、皮膚病等均有較好療效[3-4]。隨著胡桃的生產(chǎn)，胡桃葉在短時間內(nèi)大量堆積，通常處理方法是堆砌焚燒，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源的極大浪費。為了使這一巨大自然資源得到更合理的利用，需對胡桃葉資源進(jìn)行深度開發(fā)研究。目前國內(nèi)外對胡桃葉的研究有Abbasi Z等[5]和Jelodar G等[6]表明胡桃葉色素的藥理功能,Vieira V等[7]表明葡萄牙東北部胡桃葉具有抑菌活性，翟梅枝等[8]研究胡桃葉的化學(xué)組成，而對胡桃葉色素的相關(guān)研究相對較少。

植物色素的提取方法有很多：溶劑提取法、超臨界流體萃取法、超聲輔助提取法等。溶劑提取法是植物色素提取常用的方法，但仍存在效率低、提取效果不佳等弊端；超臨界流體萃取法設(shè)備復(fù)雜、價格昂貴，而超聲輔助提取法能縮短提取時間，易操作。目前多見于提取黑玉米色素、青花椒色素和洋蔥色素等，用于胡桃葉色素的提取還未見報道[9-10]。

胡桃葉中含有多種酚類化合物如萘醌類及其衍生物、黃酮類、鞣質(zhì)等[11]。表明胡桃葉色素具有強大的抗氧化性。為更好開發(fā)胡桃葉色素提供理論依據(jù)，通過單因素試驗和響應(yīng)面分析法，對胡桃葉色素的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，同時對得到的胡桃葉色素抗氧化活性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胡桃葉：采自于新疆阿克蘇地區(qū)；無水乙醇、檸檬酸、氫氧化鈉(粒)、甲醇、石油醚、硫酸亞鐵、30% H2O2、水楊酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)標(biāo)準(zhǔn)品：以上試劑除注明外均為分析純。

RHP-1000A型高速多功能粉碎機 吳哲食品機械廠；SB-3200DTD型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；FA1004B型電子天平 上海越平科學(xué)儀器(蘇州)制造有限公司；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Multiskan Sky酶標(biāo)儀 ThermoFisher Scientific公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱、XMTD-4000型電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 試驗內(nèi)容

1.2.1 原料預(yù)處理

將清凈的胡桃葉放置于50 ℃的恒溫干燥箱內(nèi)，干燥至恒重，粉碎，過80目篩，在干燥器中保存待用。

1.2.2 最佳提取溶劑及最佳吸收波長的確定

準(zhǔn)確稱取2.0 g胡桃葉粉6份，置于6個50 mL離心管中，分別加入20 mL蒸餾水、0.5%檸檬酸、3%氫氧化鈉、50%乙醇、甲醇、石油醚，然后于室溫振蕩50 min，抽濾，觀察色澤差異與溶解性。抽濾，取濾液1 mL定容至100 mL，進(jìn)行全波長掃描，確定最佳提取溶劑及最佳吸收波長。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計

1.2.3.1 乙醇濃度對色素提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取2.0 g胡桃葉粉共5份，分別置于5個50 mL離心管中，分別加入30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，液固比5∶1(mL/g)，超聲時間50 min，超聲功率108 W，抽濾，取1 mL稀釋100倍，在231 nm處測其吸光度。

1.2.3.2 超聲時間對色素提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取2.0 g胡桃葉粉共5份，分別置于5個50 mL離心管中，在50%乙醇濃度條件下，液固比5∶1(mL/g)，分別超聲30，40，50，60，70 min，超聲功率108 W，抽濾，取1 mL稀釋100倍，在231 nm處測其吸光度。

1.2.3.3 液固比對色素提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取2.0 g胡桃葉粉共5份，分別置于5個50 mL離心管中，在50%乙醇濃度和超聲時間50 min的條件下，液固比分別為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1(mL/g)，超聲功率108 W，抽濾，取1 mL稀釋100倍，在231 nm處測其吸光度。

1.2.3.4 超聲功率

準(zhǔn)確稱取2.0 g胡桃葉粉共5份，分別置于5個50 mL離心管中，在50%乙醇濃度、超聲時間50 min和液固比5∶1(mL/g)的條件下，超聲功率分別為72，90，108，126，144 W，抽濾，取1 mL稀釋100倍，在231 nm處測其吸光度。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

對單因素試驗結(jié)果進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上，選取色素提取試驗中的乙醇濃度、超聲時間、液固比和超聲功率4個因素為自變量,以提取色素的吸光度值為響應(yīng)值R，采用Design Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析, 預(yù)測胡桃葉色素提取最佳工藝，具體因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取試驗的因素與水平值Table 1 The factors and levels of response surface optimization for ultrasonic-assisted extraction test

1.3 胡桃葉色素提取物的抗氧化活性分析

1.3.1 胡桃葉色素提取物對羥自由基(·OH)清除能力的測定

羥自由基(·OH)清除能力的測定參考王玢[12]的方法，將胡桃葉色素濃縮液用超純水稀釋，配制成25，50，75，100，125，150，175，200 mg/L的待測溶液。向25 mL比色管中加入2 mol/L FeSO43 mL，1 mol/L H2O23 mL搖勻；其中H2O2是最后加入并啟動整個反應(yīng),接著加入6 mol/L水楊酸3 mL，搖勻,于37 ℃水浴加熱15 min后取出，在510 nm處測其吸光度A0。然后加入待測液1.0 mL搖勻，繼續(xù)水浴加熱15 min，取出測其吸光度AX。為消除后加的1.0 mL待測液所造成的體系吸光度值的降低，方法同上。恒溫15 min后測其吸光度值A(chǔ)00，加1 mL蒸餾水，搖勻后再測一次其吸光度AXX，A降低=A00-AXX。按照下式計算羥自由基清除率。

羥自由基清除率(%)=(A0-AX-A降低)/A0×100%。

1.3.2 胡桃葉色素對DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定參考鄭嵐等[13]的方法。將胡桃葉色素濃縮液用超純水稀釋，配制成25，50，75，100，125，150，175，200 mg/L的待測溶液。用移液槍抽取不同濃度的待測樣品液2 mL與DPPH溶液2 mL，把它們加入同一試管中，混勻后避光反應(yīng)30 min，于波長517 nm處測定其吸光度A。用移液槍抽取不同濃度的待測樣品液2 mL與2 mL乙醇溶液，把它們加入同一試管中，混勻后避光反應(yīng)30 min,測定其吸光度A0。用移液槍抽取2 mL去離子水與2 mL DPPH乙醇溶液，把它們加入同一試管中，混勻后避光反應(yīng)30 min，測定其吸光度A1。按照下式計算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A-A0)/A1]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇和最大波長的確定

不同種類溶劑對胡桃葉色素的溶解性見表2。

表2 不同種類溶劑對胡桃葉色素的溶解性Table 2 The solubility of different kinds of solvents on pigments from walnut leaves

由表2可知，0.5%檸檬酸、3%氫氧化鈉、50%乙醇的萃取效果較好，因此，選用0.5%檸檬酸、50%乙醇、3%氫氧化鈉的提取液進(jìn)行全波長掃描。

選用0.5%檸檬酸、50%乙醇、3%氫氧化鈉的提取液進(jìn)行全波長掃描，見圖1。

圖1 胡桃葉色素最佳吸收波長的確定Fig.1 The determination of optimum absorption wavelength of pigments from walnut leaves

由圖1可知，3種溶劑的提取液均在231 nm處有明顯的吸收峰，50%乙醇的提取液在最大波長處的吸光值大于其他溶劑。因此，選取50%乙醇為胡桃葉色素的提取溶劑，231 nm作為提取色素的定量波長。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對色素提取的影響

由圖2可知，胡桃葉色素的吸光度開始隨著乙醇濃度的增大而明顯增加，當(dāng)濃度達(dá)到50%時，胡桃葉色素的吸光度最大；當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加時，吸光度反而下降。可能是由于乙醇濃度越大時，胡桃葉中的其他醇溶性、脂溶性雜質(zhì)溶出增加，競爭性地減少了提取劑中色素的含量，從而使胡桃葉色素提取液的吸光值呈逐漸下降的趨勢。因此，乙醇濃度控制在50%為宜[14]。

圖2 乙醇濃度對胡桃葉色素提取的影響Fig.2 Effect of the ethanol concentration on the extraction of pigments from walnut leaves注：不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)，下圖同。

2.2.2 超聲時間對色素提取的影響

由圖3可知，超聲時間在30～50 min范圍內(nèi)，吸光值隨著時間的增加而顯著變大，50 min時達(dá)到最大值，隨后吸光值明顯下降。這可能是由于隨著時間的延長，有效物質(zhì)不斷從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外溶解，50 min時基本達(dá)到濃度平衡；隨后吸光值開始減小，可能是由于高溫下提取時間過長，導(dǎo)致色素在空氣中被氧化，成分被破壞[15]。故超聲時間選擇50 min比較適宜。

圖3 超聲時間對胡桃葉色素提取的影響Fig.3 Effect of the ultrasonic time on the extraction of pigments from walnut leaves

2.2.3 液固比對色素提取的影響

由圖4可知，液固比在3∶1～4∶1(mL/g)時，吸光度隨著液固比的增大呈上升趨勢，液固比增加到5∶1(mL/g)時，色素提取液的吸光度達(dá)到最大，液固比大于5∶1(mL/g)時，色素提取的吸光度隨著液固比的增加而明顯下降，這是由于當(dāng)物料一定時，增加提取溶劑的用量，能夠增加有效成分的溶出，當(dāng)提取溶劑增加到一定程度后，大部分有效成分已基本溶出[16]，繼續(xù)增加溶劑用量對提取效果沒有提高的效果，造成提取溶劑的浪費[17]。所以，本試驗選擇液固比為5∶1(mL/g)。

圖4 液固比對胡桃葉色素提取的影響Fig.4 Effect of the liquid-solid ratio on the extraction of pigments from walnut leaves

2.2.4 超聲功率對色素提取的影響

由圖5可知，隨著超聲功率從72 W開始增加，色素的吸光度也開始顯著增加，當(dāng)超聲功率為108 W時，色素的吸光度值達(dá)到了最大；繼續(xù)增大超聲功率，提取胡桃葉色素的溶液吸光度反而下降。對胡桃葉色素提取的這種影響可能是由于超聲功率過高，超聲波對胡桃葉的組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了破壞作用[18]，所以本試驗選擇超聲功率為108 W。

圖5 超聲功率對胡桃葉色素提取的影響Fig.5 Effect of the ultrasonic power on the extraction of pigments from walnut leaves

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果和考慮綜合因素確定最佳條件，決定用乙醇濃度、超聲時間、液固比、超聲功率4個因素(分別用A、B、C、D表示)，以胡桃葉色素吸光度為響應(yīng)值R設(shè)計四因素三水平共29個試驗點的組合試驗，利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行處理，試驗結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 3 Response surface experimental results

續(xù) 表

2.3.1 模型的建立及方差分析

利用統(tǒng)計分析軟件Design Expert 8.0.6對表3的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合后，得到乙醇濃度(A)、超聲時間(B)、液固比(C)、超聲功率(D)與吸光度值(R)之間的二次多元回歸方程為：R=0.51-0.9583E-003A+0.022B-7.000E-003C+0.013D-0.017AB-0.026AC+0.022AD-0.018BC+0.015BD+3.750E-003CD-0.038A2-0.071B2-0.026C2+0.012D2。

由表4可知，模型極顯著(P<0.01)，失擬項的P為0.0981，差異不顯著，說明該模型對優(yōu)化胡桃葉色素超聲提取工藝有實際應(yīng)用意義。對回歸方程系數(shù)進(jìn)行F檢驗和方差分析，結(jié)果表明B、D、AC、AD、A2、B2、C2對吸光值的影響極顯著(P<0.01)；A、AB、BC、BD、D2對吸光值的影響顯著(P<0.05)；影響因素的主次順序為超聲時間>超聲功率>乙醇濃度>液固比。

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation

續(xù) 表

2.3.2 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對胡桃葉色素吸光度的影響見圖6。

圖6 各因素交互作用對胡桃葉色素吸光度影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagrams of interaction of various factors on the absorbance of pigments from walnut leaves

由圖6可知乙醇濃度和超聲時間、乙醇濃度和液固比、乙醇濃度和超聲功率、超聲時間和液固比兩兩因素間的交互作用。響應(yīng)圖中曲線越陡峭，說明該因素對吸光度的影響越大，反之越小[19]。由圖6可知，乙醇濃度和超聲時間、乙醇濃度和液固比、乙醇濃度和超聲功率、超聲時間和液固比的交互作用比較好，而超聲時間和超聲功率的交互作用比較弱，與之前方差分析結(jié)果一致[20]。

2.3.3 驗證試驗

通過上述試驗分析，得到最佳提取條件為：乙醇濃度60.69%，液固比5.22∶1(mL/g),超聲時間43.19 min，超聲功率126 W，此時吸光度理論值為0.513。綜合考慮實際操作性，將條件修正為：乙醇濃度60%，液固比5∶1(mL/g)，超聲時間43 min，超聲功率126 W。在此優(yōu)化工藝下進(jìn)行3次平行試驗，實際測得平均吸光值為0.506，與模型預(yù)測值相對誤差為1.36%，表明采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的工藝可行[21]。

2.4 胡桃葉色素提取物的抗氧化活性分析

2.4.1 胡桃葉色素提取物對羥自由基(·OH)清除能力的測定

羥自由基是一種氧化能力很強的自由基，可以發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，奪取氫原子和羥基化等反應(yīng)。按照前述公式計算清除率，不同濃度的胡桃葉色素樣品對羥自由基的清除率見圖7。

由圖7可知，濃度為25，50，75，100，125，150，175，200 mg/L胡桃葉色素對羥自由基有一定的清除作用，其清除效果與胡桃葉色素濃度在一定范圍內(nèi)呈一定的量效關(guān)系。隨著胡桃葉色素濃度的不斷增加，清除率也隨之不斷增加。胡桃葉色素濃度為200 mg/L時清除作用達(dá)到最大值64.0%。胡桃葉色素的半數(shù)清除率EC50為135.46 mg/L。

圖7 胡桃葉色素對·OH清除能力的測定Fig.7 Determination of the scavenging ability of pigments from walnut leaves on ·OH

2.4.2 胡桃葉色素對DPPH自由基清除能力的測定

當(dāng)自由基清除劑存在時，DPPH自由基接受一個電子或氫原子，形成穩(wěn)定的化合物，使其溶液從深紫色變?yōu)榈S色，變色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可通過吸光度大小來判斷清除能力[22]。由圖8可知，胡桃葉色素對DPPH自由基都有清除能力，且隨著樣品濃度的增加，DPPH自由基的清除能力增強。胡桃葉色素濃度為200 mg/L時清除作用達(dá)到最大值95.7%。胡桃葉色素濃度>175 mg/L時，胡桃葉色素清除DPPH自由基的能力趨于穩(wěn)定。胡桃葉色素的半數(shù)清除率EC50為49.17 mg/L。

圖8 胡桃葉色素對DPPH自由基清除能力的測定Fig.8 Determination of the scavenging ability of pigments from walnut leaves on DPPH radicals

3 結(jié)論

以胡桃葉為原料提取色素，并對其提取工藝和抗氧化活性進(jìn)行相關(guān)研究。由響應(yīng)面法得到最佳提取條件為乙醇濃度60%，液固比5∶1(mL/g)，超聲時間43 min，超聲功率126 W，預(yù)測最大吸光度為0.513，實際吸光度的平均值為0.506。在一定濃度范圍內(nèi)，胡桃葉色素提取物有較好的抗氧化活性，羥自由基、DPPH自由基的EC50分別為135.46，49.17 mg/L。胡桃葉色素提取物對羥自由基的清除能力強于DPPH自由基。因此，作為天然抗氧化劑在實際生產(chǎn)應(yīng)用時，應(yīng)選擇適宜的劑量范圍，以使其達(dá)到最佳的抗氧化效果。