陳志寧 劉曉俊 唐梁 梁偉海 林國偉

廣州市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科，廣州 511458

腦卒中是最常見的腦血管病之一。腦卒中患者不僅會有運(yùn)動及感覺方面出現(xiàn)障礙，還可能出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙［1］。根據(jù)卒中后認(rèn)知障礙（PSCI）的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)主要診斷為“癡呆”，全國名老中醫(yī)劉茂才教授經(jīng)長期臨床工作總結(jié)出癡復(fù)康方，用于治療認(rèn)知功能障礙患者。研究表明，癡復(fù)康方無論在臨床或?qū)嶒?yàn)中均有明顯的療效［2?3］。石菖蒲、遠(yuǎn)志為癡復(fù)康方成分之一，石菖蒲具有開竅豁痰、醒神益智之功，遠(yuǎn)志有養(yǎng)血寧心、散痰涎之功，均為治療癡呆的常用中藥。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生障礙是動脈粥樣硬化的起始環(huán)節(jié)，氧化型低密度脂蛋白（oxidized low?density lipoprotein，ox?LDL）可促進(jìn)動脈粥樣硬化的進(jìn)展［4］。2021年1月至8月，本實(shí)驗(yàn)選取癡復(fù)康方中的石菖蒲、遠(yuǎn)志，探討其對ox?LDL損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的影響，進(jìn)一步探討癡復(fù)康方的機(jī)制。

材料與方法

1、主要材料和儀器

1.1、材料 石菖蒲、遠(yuǎn)志（廣州市藥材公司中藥飲片廠，批號：YPA8C0001，YPA8G0002）；ox?LDL（廣州奕元生物技術(shù)公司，批號YB?002）；胎牛蛋白（美國Gibco公司，批號1027?106）；胰蛋白酶（武漢博士德生物公司，批號PYG14190）；Propidium Iodide/碘化丙啶（上海碧云天生物技術(shù)公司，批號ST512）；RNase A酶（美國SIGMA公司，批號R4875；高純總RNA快速提取試劑盒（美國BIOTEKE公司，批號BP1201）；HiScriptⅡQRTSuperMix for qPCR（+gDNA）（美 國Vazyme公 司，批 號R223?01）；HieffTMqPCR SYBP?Green Master Mix（LoW Rox Plus）（上海翊圣生物公司，批號11202ES08）；DL2000 DNA marker（美國TAKARA公司，批號3427B）；DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司，批號SH30809.01B）；PBS粉劑（武漢博士德生物公司，批號1027?106）；CCK?8試劑盒（碧云天）；trypsin?EDTA溶液（BIOSHARP，批號WH0518）；雙抗（青霉素/鏈霉素原液）（TBD，批號PS2004HY）；Annexin V?APC/7AADkit：（聯(lián)科生物，批號4224750）。

1.2、儀器 CW?CJ?2F型凈化工作臺（蘇州凈化有限公司）；水套式二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；普通光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；流式分析儀（愛森生物有限公司）；水平離心機(jī)（湖南湘義離心機(jī)儀器有限公司）；渦旋混勻器（其林貝爾儀器制造有限公司）；熒光定量PCR儀（杭州博日科技公司）；Tanon?1600凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技公司）；JY200C電泳儀（北京君意電泳設(shè)備公司）；超微量核算分析儀Nano?200（杭州奧盛儀器公司）。

1.3、HUVECs培養(yǎng) 無菌條件下，取新生兒臍帶，用0.25%胰酶注入靜脈腔內(nèi)消化靜脈內(nèi)皮8 min，收集消化液放至含1 ml血清的離心管，1 000 r/min離心7 min，棄上清液，混勻后放置培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）培養(yǎng)24 h，再次換液，待細(xì)胞融合后用0.05%胰酶進(jìn)行細(xì)胞消化傳代，培養(yǎng)后置于培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）待用。

2、石菖蒲、遠(yuǎn)志對ox?LDL誘導(dǎo)HUVECs增殖和相對活率的影響

在96孔板中接種2 000個HUVECs懸液（100.0μl/孔），置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h（37℃，5%CO2），棄上清，用PBS緩沖液洗2次，隨機(jī)分成5組：空白組（正常培養(yǎng)的HUVECs），模型組（加入80μg/ml ox?LDL的培養(yǎng)液），樣品組［加入80μg/ml ox?LDL的培養(yǎng)液及不同濃度（5、10、20 mg/ml）的石菖蒲、遠(yuǎn)志或石菖蒲+遠(yuǎn)志的DMEM培養(yǎng)液］。將其置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入10.0μl CCK?8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5～1.0 h，最后用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度檢測各孔的光密度值（A）。

3、HUVECs凋亡的測定

細(xì)胞消化，收集藥物處理后的細(xì)胞，PBS、1×Binding Buffer依次洗1次，取細(xì)胞懸液，重懸細(xì)胞，隨機(jī)分成5組，每組設(shè)3個復(fù)孔：空白組（正常培養(yǎng)的HUVEC），模型組（空白對照組中加入80μg/ml ox?LDL誘導(dǎo)），石菖蒲組（模型組中加入5 mg/L石菖蒲水煎煮物），遠(yuǎn)志組（模型組中加入5 mg/ml遠(yuǎn)志水煮物），石菖蒲+遠(yuǎn)志組（模型組中加入5 mg/L的石菖蒲+遠(yuǎn)志水煎煮物）。石菖蒲組、遠(yuǎn)志組、石菖蒲+遠(yuǎn)志組加入水煮物的濃度均為細(xì)胞相對活率實(shí)驗(yàn)中得出的最佳濃度。每個樣品中加入100.0μl 1×Binding Buffer，加入5.0μl Annexin V?APC和10μl 7AAD，混勻后室溫下避光孵育15 min，再每管加入485.0μl預(yù)冷1×Binding Buffer重懸混合。流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，使用Flowjo進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

4、HUVECs周期的測定

取生長狀況良好、密度適中的細(xì)胞，設(shè)5組，具體分組同上，每組設(shè)3個復(fù)孔，超凈臺上消化收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS液洗細(xì)胞2次。加預(yù)冷70%乙醇重懸，4℃環(huán)境下固定過夜，或?20℃長期固定待用；離心收集細(xì)胞，1 ml預(yù)冷PBS液洗細(xì)胞1次，加入500.0μl含5μg/ml碘化丙錠、0.2%Triton X?100、100μg/ml RNaseA的PBS，4℃避光培養(yǎng)30 min；流式細(xì)胞儀標(biāo)準(zhǔn)流程檢測，保證計數(shù)1×105個細(xì)胞以上；結(jié)果用細(xì)胞周期擬合軟件Flowjo分析。

5、實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法鑒定Bax、Bcl?2 mRNA的表達(dá)

取生長狀況良好、密度適中的細(xì)胞，細(xì)胞分組同上，設(shè)5組，每組設(shè)3個復(fù)孔，引物設(shè)計見表1，提取總RNA，超凈臺上收集各組細(xì)胞沉淀，提取RNA，準(zhǔn)備PCR反應(yīng)管，依次在管中加入20.0μl反應(yīng)體系，具體流程為7.4μl ddH2O在94℃下預(yù)變性1 min，10.0μl SYBR在94℃下變性15 s，1.0μl cDNA在60℃下退火20 s，1.6μl在72℃延伸20 s，變性、退火、延伸流程循環(huán)40次，結(jié)果用相對定量法進(jìn)行分析。

6、統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(±s)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法鑒定Bax、Bcl?2 mRNA的表達(dá)的引物設(shè)計

結(jié) 果

1、細(xì)胞增殖與細(xì)胞相對活率

模型組與空白組相比較，其相對活率下降，提示ox?LDL誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型制備成功。不同濃度的單種藥組中，5 mg/ml石菖蒲、5 mg/ml遠(yuǎn)志細(xì)胞增殖OD值及細(xì)胞活率最佳；聯(lián)合用藥組以5 mg/ml的效果最優(yōu)；其中，相同的藥物濃度下，聯(lián)合用藥組細(xì)胞活率優(yōu)于單種藥。單藥和聯(lián)合用藥，隨著用藥濃度增加，細(xì)胞相對活率均下降。此步驟得出石菖蒲低劑量組、遠(yuǎn)志低劑量組、石菖蒲+遠(yuǎn)志藥對低劑量組為最佳濃度。見表2。

表2 石菖蒲、遠(yuǎn)志對ox?LDL誘導(dǎo)HUVECs增殖和相對活率的影響（±s）

表2 石菖蒲、遠(yuǎn)志對ox?LDL誘導(dǎo)HUVECs增殖和相對活率的影響（±s）

注：與空 白 組 比 較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；ox?LDL為氧化型低密度脂蛋白，HUVECs為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；“?”表示無數(shù)據(jù)

組別空白組模型組石菖蒲低劑量組石菖蒲中劑量組石菖蒲高劑量組遠(yuǎn)志低劑量組遠(yuǎn)志中劑量組遠(yuǎn)志高劑量組石菖蒲遠(yuǎn)志藥對低劑量組石菖蒲遠(yuǎn)志藥對中劑量組石菖蒲遠(yuǎn)志藥對高劑量組細(xì)胞增殖OD值0.899±0.003?0.973±0.008a 0.966±0.052a 0.878±0.042 0.977±0.012a 0.794±0.054a 0.605±0.025a 0.940±0.035 0.803±0.029a 0.544±0.017a細(xì)胞相對活率98.733±0.451 88.1±0.608a 93±0.721ab 89.567±2.237 83.9±4.014 93.4±1.114 75.9±5.142 57.8±2.339ab 103.06±2.815 76.767±2.730a 52.033±1.678ab

2、細(xì)胞凋亡

數(shù)據(jù)顯示，模型組的凋亡率較空白組顯著增高，提示模型制備成功。與模型組相比，石菖蒲組的凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；遠(yuǎn)志組、石菖蒲+遠(yuǎn)志組的凋亡率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖1、表3。

圖1 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡結(jié)果；A為空白組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡結(jié)果，B為模型組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡結(jié)果，C為石菖蒲組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡結(jié)果，D為遠(yuǎn)志組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡結(jié)果，E為石菖蒲+遠(yuǎn)志組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡結(jié)果

表3 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率比較（±s）

表3 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率比較（±s）

注：與空白組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05

組別空白組模型組石菖蒲組遠(yuǎn)志組石菖蒲+遠(yuǎn)志組凋亡率（Q2+Q3%）0.338±0.001 4.319±0.124a 2.694±0.561ab 2.278±0.914ab 2.250±0.699ab

3、細(xì)胞周期

與空白組相比，模型組、石菖蒲組、遠(yuǎn)志組的（S+G2）%期降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與模型組相比，石菖蒲組、遠(yuǎn)志組、石菖蒲+遠(yuǎn)志組的（S+G2）%期增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與石菖蒲組相比，石菖蒲+遠(yuǎn)志組的（S+G2）%期增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與遠(yuǎn)志組相比，石菖蒲+遠(yuǎn)志組的（S+G2）%期增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2、表4。

表4 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（S+G2）%期比較（±s）

表4 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（S+G2）%期比較（±s）

注：與空白組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05

組別空白組模型組石菖蒲組遠(yuǎn)志組石菖蒲+遠(yuǎn)志組（S+G2）%64.145±3.033 42.745±4.052a 52.055±2.920ab 54.867±1.880ab 62.065±1.881b

4、Bax、Bcl?2 mRNA表達(dá)量

石菖蒲、遠(yuǎn)志及其配伍對ox?LDL誘導(dǎo)HUVECs下Bax、Bcl?2 mRNA的表達(dá)量與空白組相比，模型組的Bax mRNA表達(dá)量升高，Bcl?2表達(dá)量下降，提示模型制備成功。與模型組相比，石菖蒲組、遠(yuǎn)志組、石菖蒲+遠(yuǎn)志組的Bax mRNA表達(dá)量下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與模型組相比，石菖蒲組、遠(yuǎn)志組、石菖蒲+遠(yuǎn)志組的Bcl?2表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表5。

表5 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Bax、Bcl?2 mRNA表達(dá)量比較（±s）

表5 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Bax、Bcl?2 mRNA表達(dá)量比較（±s）

注：與模型組比較，a P＜0.05

組別空白組模型組石菖蒲組遠(yuǎn)志組石菖蒲+遠(yuǎn)志組n3 3 3 3 3 Bax表達(dá)量0.373 3±0.040 4 1.040 0±0.020 0 0.856 7±0.068 1a 0.756 7±0.061 1a 0.623 3±0.030 6a Bcl?2表達(dá)量3.330 0±0.080 0 1.056 7±0.086 2 1.563 3±0.165 0a 1.940 0±0.045 8a 2.086 7±0.129 0a

討 論

動脈粥樣硬化是由多個因素作用下發(fā)生的慢性炎癥過程，血液中的多種脂質(zhì)均可對血管內(nèi)皮造成損傷，尤其是低密度脂蛋白（LDL）發(fā)生氧化后對動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展起到極其重要的作用［5］。由于動脈粥樣硬化導(dǎo)致血管管腔狹窄甚至閉塞，從而出現(xiàn)缺血性腦卒中等血管性疾?。?］。有研究表明，缺血性腦卒中后的患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率可高達(dá)80.97%［7］。同時有研究表明，高脂血癥可導(dǎo)致血管炎性反應(yīng)，腦血流量調(diào)節(jié)功能受損，從而影響PSCI的發(fā)生［8］。因此，抑制高脂血癥導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在PSCI患者中尤其重要。

圖2 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（S+G2）%期；A為空白組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（S+G2）%期，B為模型組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（S+G2）%期，C為石菖蒲組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（S+G2）%期，D為遠(yuǎn)志組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（S+G2）%期，E為石菖蒲+遠(yuǎn)志組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（S+G2）%期

癡復(fù)康方是全國名老中醫(yī)劉茂才教授數(shù)十年經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出的治療癡呆的代表方，由石菖蒲、遠(yuǎn)志、天麻、法半夏、黃芪、當(dāng)歸、何首烏、紫河車、巴戟天等藥物組成。石菖蒲具有開竅豁痰、醒神益智的功效，中藥石菖蒲的主要有效成分為β?細(xì)辛醚，具有保護(hù)血管內(nèi)皮、調(diào)血脂、降低血液黏度、抗血小板聚集等作用［9］。研究表明，β?細(xì)辛醚可有效抑制ox?LDL對ECV304的損傷［10］。還有研究顯示，β?細(xì)辛醚減少細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過穩(wěn)定線粒體膜來實(shí)現(xiàn)的［11］。遠(yuǎn)志具有養(yǎng)血寧心、散痰涎的功效，具有抗癡呆、腦保護(hù)等療效［12］。遠(yuǎn)志的主要活性成分是遠(yuǎn)志皂苷元，具有抗氧化、抗衰老、改善阿爾茨海默病的藥理作用［13?14］。石菖蒲?遠(yuǎn)志為常用的中藥藥對，現(xiàn)代藥理學(xué)表明，其可通過多種成分、多個靶點(diǎn)、多條路徑改善阿爾茨海默?。?5］，同時可通過調(diào)節(jié)Aβ和自噬水平改善慢性顱腦低灌注［16］。

有研究表明，Bax與Bcl?2兩種蛋白在細(xì)胞凋亡與生長周期中具有拮抗作用，Bcl?2具有抗凋亡作用，而Bax具有促凋亡作用［17］。研究可采用Bax與Bcl?2蛋白來評估血管內(nèi)皮細(xì)胞受損情況［18］。本研究結(jié)果顯示，ox?LDL損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞可使細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞增殖下降。予適量石菖蒲、遠(yuǎn)志及其配伍水提物干預(yù)后可使細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞增殖指數(shù)升高，同時Bax mRNA表達(dá)量下降、Bcl?2 mRNA的表達(dá)量升高，提示石菖蒲、遠(yuǎn)志及其配伍水提物可能通過調(diào)控兩種凋亡蛋白的表達(dá)來抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

本實(shí)驗(yàn)中，通過對癡呆復(fù)康方拆方，探討石菖蒲、遠(yuǎn)志及其藥對配伍對血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，認(rèn)為石菖蒲、遠(yuǎn)志均對血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，其配伍藥對優(yōu)于單味中藥。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突