王祎哲, 韓朝婕,卜世勛,韓 旭,周文禮,賈旭穎

(天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

引 言

小球藻屬(Chlorella)微藻作為目前微藻中應(yīng)用開發(fā)較多的種類，不僅具有較高的生長(zhǎng)速度，還蘊(yùn)含豐富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，如蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)和類胡蘿卜素等[10]，細(xì)胞中所含有的類胡蘿卜素可作為抗氧化劑[11]，在增強(qiáng)免疫系統(tǒng)[12]，預(yù)防心血管疾病[13]、白內(nèi)障[14]等方面具有巨大的潛力。因其豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和醫(yī)療保健作用，小球藻被認(rèn)定為是一種及其重要的微藻資源[15]。除此之外，在魚類育苗、養(yǎng)殖生產(chǎn)中，小球藻作為水體中重要的生物組分部分，既可以在工廠化人工育苗技術(shù)中作為最常用的基礎(chǔ)生物餌料[16-18]，又可以吸收水體中的氨氮等其他有害物質(zhì)[19]。

賁月等[20]的研究表明：選取海藻酸鈉對(duì)銅綠微囊藻有顯著的固定效果，對(duì)藻類的生長(zhǎng)有促進(jìn)效果。具備較好的傳質(zhì)能、機(jī)械強(qiáng)度、避免生物分解的能力，且對(duì)生物無害的優(yōu)點(diǎn)，是較好的固定化細(xì)胞的材料。本文選取海藻酸鈉作為固定化載體，研究固定化與液體懸浮態(tài)兩種培養(yǎng)方式小球藻對(duì)生長(zhǎng)、光合色素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響，以期為此后的微藻培養(yǎng)技術(shù)找到一種高效、便捷的方法。

1 材料與方法

1.1 微藻及培養(yǎng)

小球藻由天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為海水配制的經(jīng)120℃ 條件下滅菌20 min的f/2培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)良好的小球藻按照藻液∶培養(yǎng)基=1∶1的比例在超凈工作臺(tái)內(nèi)接種，在恒定培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行靜置培養(yǎng)，設(shè)定培養(yǎng)箱溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為50 μmol/(m2·s)，光照周期為12 L∶12 D，每天定時(shí)至少搖動(dòng)3次藻液防止貼壁或沉淀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小球藻的固定化培養(yǎng)

將培養(yǎng)在f/2培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況良好的小球藻，5000 r/min離心10 min，把上清液棄除后，將小球藻混合于4% 的海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻后，利用10 mL注射器在距離預(yù)冷后的CaCl2溶液水面20 cm處滴入，形成小球狀，靜置1 h后，滅菌蒸餾水洗滌多次備用，放入配制好的f/2培養(yǎng)基中于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.1。

1.2.2 小球藻膠球解固定

從培養(yǎng)液中取出一定數(shù)量的膠體小球，滴加一定量的3%的檸檬酸鈉溶液，靜置至膠球完全溶解。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 細(xì)胞密度測(cè)定

采用血球計(jì)數(shù)板法對(duì)藻細(xì)胞密度進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 色素含量測(cè)定

參考乙醇法對(duì)藻類進(jìn)行葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量測(cè)定。

取樣品5 mL經(jīng)5000 r/min離心10 min去掉上清液，加入5 mL 95%乙醇溶液后于4℃冷藏24 h后，經(jīng)5000 r/min離心10 min取上清，測(cè)定各波長(zhǎng)下吸光值。

Ca(mg/L)=13.95A665-6.88A649

(1)

Cb(mg/L)=24.96A649-7.32A665

(2)

Cc(mg/L)=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245

(3)

式中:Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度；Cc為類胡蘿卜素的總濃度；A665、A649和A470分別為葉綠體色素提取液在波長(zhǎng)665 nm、649 nm和470 nm下的吸光度。

1.3.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

利用葉綠素?zé)晒鈨x對(duì)葉綠素?zé)晒飧鱾€(gè)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定前，將1 cm樣品放置于比色皿中暗適應(yīng)15 min，啟動(dòng)葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定初始熒光產(chǎn)量(F0)，飽和脈沖后再測(cè)定小球藻的最大熒光產(chǎn)量(Fm)，以此計(jì)算出最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm，F(xiàn)v為可變熒光產(chǎn)量)。測(cè)定的葉綠素?zé)晒鈪?shù)有F0、Fm、F0'、Fm'、Fs等，并根據(jù)熒光儀所提供的公式，計(jì)算出最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)、實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(ΦPSⅡ)和量子效率(yield)的熒光參數(shù)。具體公式如下：

最大光能轉(zhuǎn)化效率Fv/Fm=( Fm-F0)/Fm

(4)

實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率ΦPSⅡ=( Fm'-Fs ) /Fm'

(5)

量子效率yield= Fv'/Fm'=( Fm'-F0' ) /Fm'

(6)

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有結(jié)果用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)”表示，使用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way test)、T檢驗(yàn)(T-test)和Duncan多重比較分析，并用Sigma Plot14.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化培養(yǎng)對(duì)小球藻細(xì)胞密度的影響

固定化培養(yǎng)對(duì)小球藻細(xì)胞密度的影響如圖1所示，試驗(yàn)期間，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種培養(yǎng)方式小球藻細(xì)胞密度均顯著升高(P<0.05)。試驗(yàn)初期(2—4 d)固定化培養(yǎng)小球藻細(xì)胞密度高于液體懸浮態(tài)小球藻，但二者之間差異不顯著(P>0.05)，試驗(yàn)中后期(6—10 d)，固定化培養(yǎng)小球藻細(xì)胞密度增長(zhǎng)明顯，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)其細(xì)胞密度達(dá)到2.641×106cells/mL，是懸浮態(tài)的1.27倍，顯著高于懸浮態(tài)小球藻細(xì)胞密度(P<0.05)。

圖1 固定化培養(yǎng)對(duì)小球藻藻細(xì)胞密度的影響

2.2 固定化培養(yǎng)對(duì)小球藻光合色素含量的影響

固定化培養(yǎng)對(duì)小球藻光合色素含量的影響如圖2所示，試驗(yàn)第2天，兩種培養(yǎng)方式小球藻之間的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均無顯著差異(P>0.05)，從第4天開始固定化培養(yǎng)小球藻三種光合色素含量均出現(xiàn)大幅度增長(zhǎng)，在試驗(yàn)的 4—10 d，固定化培養(yǎng)小球藻三種光合色素含量均顯著高于液體懸浮態(tài)小球藻(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，固定化培養(yǎng)小球藻葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量分別達(dá)到液體懸浮態(tài)小球藻的3.79倍3.54倍和3.01倍。在試驗(yàn)期間，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化培養(yǎng)小球藻三種色素含量始終處于上升趨勢(shì)，而液體懸浮態(tài)小球藻各色素含量均在第8天達(dá)到峰值，而在第10天開始出現(xiàn)下降。

圖2 固定化培養(yǎng)對(duì)小球藻光合色素含量的影響

2.3 固定化培養(yǎng)對(duì)小球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由圖3可見，試驗(yàn)開始后，固定化培養(yǎng)和懸浮態(tài)培養(yǎng)小球藻的Fv/Fm均顯著升高，在試驗(yàn)的2—10 d，懸浮態(tài)小球藻Fv/Fm基本穩(wěn)定，而固定化培養(yǎng)小球藻Fv/Fm在試驗(yàn)2 d后仍持續(xù)升高，在4—10 d保持穩(wěn)定。試驗(yàn)初期(第2天)，固定化小球藻的Fv/Fm顯著低于液體懸浮態(tài)小球藻，而在試驗(yàn)后的4—10 d，固定化小球藻的Fv/Fm則顯著高于懸浮態(tài)培養(yǎng)小球藻(P<0.05)。試驗(yàn)開始后，兩種培養(yǎng)方式小球藻ΦPSⅡ均呈上升趨勢(shì)，但是在2—8 d，液體懸浮態(tài)小球的ΦPSⅡ升高趨勢(shì)不顯著(P>0.05)，而固定化小球藻在試驗(yàn)的4—10 d顯著升高，呈顯著的上升趨勢(shì)(P<0.05)。試驗(yàn)的2—4 d兩種培養(yǎng)模式小球藻ΦPSⅡ 無顯著性差異(P>0.05)，從試驗(yàn)第6天起固定化培養(yǎng)小球藻實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率顯著始終高于懸浮態(tài)(P<0.05)。試驗(yàn)初期，固定化與液體懸浮態(tài)小球藻的量子效率在顯著升高，但固定化培養(yǎng)小球藻量子效率的升高幅度遠(yuǎn)大于液體懸浮態(tài)小球藻，試驗(yàn)4—10 d，固定化培養(yǎng)小球藻量子效率顯著高于液體懸浮態(tài)小球藻(P<0.05)。

圖3 固定化培養(yǎng)對(duì)小球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

3 討論

3.1 固定化培養(yǎng)對(duì)小球藻細(xì)胞密度的影響

細(xì)胞密度可以直觀地反映藻類的生長(zhǎng)情況，固定化培養(yǎng)使小球藻的生存環(huán)境和自身的適應(yīng)能力均發(fā)生了不同程度的改變[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，固定化細(xì)胞在培養(yǎng)前期生長(zhǎng)速率較慢，隨后開始迅速生長(zhǎng)，最終生物量顯著高于液體懸浮態(tài)，可見，固定化培養(yǎng)更有利于纖細(xì)裸藻的生長(zhǎng)，但固定化培養(yǎng)初期細(xì)胞生長(zhǎng)較為緩慢，主要是由于固定化膠球制作這一系列過程對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境有一定程度的改變，以及試驗(yàn)初期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和光線進(jìn)入膠珠受到一定水平的影響，因此妨礙其生長(zhǎng)的緣故[8]，可見，試驗(yàn)初期藻細(xì)胞需要一定時(shí)間來適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境的改變。試驗(yàn)后期，固定化培養(yǎng)表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)趨勢(shì)，說明固定化小球藻的生長(zhǎng)情況優(yōu)于液體懸浮態(tài)，已有研究證明，通過對(duì)藻的數(shù)量、形態(tài)以及對(duì)燃料降解能力比較的研究，經(jīng)優(yōu)化固定條件后培養(yǎng)的蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)以上指標(biāo)均優(yōu)于液體懸浮態(tài)，證明固定化后培養(yǎng)提高了藻的生長(zhǎng)狀態(tài)與合成代謝活性[21]。固定化小球藻的生長(zhǎng)性能有所提高，可能是固定化培養(yǎng)條件不僅提高了小球藻藻細(xì)胞的合成代謝，并且在一定程度上降低了藻細(xì)胞的分解代謝，能較長(zhǎng)時(shí)間的保持藻細(xì)胞的活性，延遲藻細(xì)胞的衰老[22]。

3.2 固定化培養(yǎng)對(duì)小球藻光合色素含量的影響

藻類進(jìn)行光合作用時(shí)是由色素蛋白復(fù)合體進(jìn)行光能捕獲完成的，藻體內(nèi)常見的色素可依據(jù)在光合作用過程中的作用分為捕光色素和光保護(hù)色素，其中以葉綠素a、葉綠素b為代表的捕光色素可將吸收的光能有效地傳遞到相關(guān)的反應(yīng)中心轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能，而類胡蘿卜素作為光保護(hù)色素將剩余能量吸收，避免膜體受傷，從而達(dá)到光保護(hù)作用[23]。藻體內(nèi)光合色素的含量和光合作用有密切的關(guān)系，因此，可通過光合色素含量的多少來判斷藻類的生理狀態(tài)[24]。

固定化培養(yǎng)對(duì)小球藻的葉綠素a、b、類胡蘿卜素含量都有一定程度上的增加，第4天起，固定化培養(yǎng)各色素含量均高于液體懸浮態(tài)培養(yǎng)。由此發(fā)現(xiàn)，固定化培養(yǎng)對(duì)小球藻的光合色素含量的增加具有促進(jìn)作用，且液體懸浮態(tài)第10天時(shí)各色素出現(xiàn)下降，分析原因可能是培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足以滿足藻細(xì)胞新陳代謝的需要，生長(zhǎng)緩慢，葉綠素的合成減少，含量出現(xiàn)下降[25]，而固定化培養(yǎng)延緩了小球藻色素含量下降的時(shí)間，因此，固定化培養(yǎng)的小球藻在色素含量以及色素增長(zhǎng)時(shí)間兩方面均要優(yōu)于液體懸浮態(tài)小球藻。Bailliez[26]等人也報(bào)道了固定化培養(yǎng)后的布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)葉綠素含量較高，推測(cè)是因固定化后藻細(xì)胞光合作用增強(qiáng)，且物質(zhì)能量消耗也有所降低所致，也就是固定化培養(yǎng)的小球藻能量的合成大于消耗，從而能量得以高效積累[27]。對(duì)于固定化培養(yǎng)后的銅綠微囊藻(Nannochloropsisoculata)也得出同樣的結(jié)論，固定化藻細(xì)胞的合成代謝能力得到了提高[28]，同時(shí)也說明了固定化藻類在色素積累方面確實(shí)要優(yōu)于液體懸浮態(tài)微藻；富烴葡萄藻(Botryococcusprotuberans)經(jīng)藻酸鹽包埋后，在穩(wěn)定期產(chǎn)生的葉綠素、類胡蘿卜素及其干質(zhì)量以及光合效率與游離細(xì)胞相比都有明顯增加[29]。以上與本試驗(yàn)固定化培養(yǎng)對(duì)小球藻生長(zhǎng)情況及色素含量具有優(yōu)勢(shì)影響相一致，固定化培養(yǎng)提高了小球藻的合成代謝，光合色素含量增加，且色素下降時(shí)間得到了延緩。

3.3 固定化培養(yǎng)對(duì)小球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

葉綠素?zé)晒庾鳛楣夂献饔玫挠行结?，能夠客觀地反映植物光合能力的強(qiáng)弱和光合器官PSⅡ活性[30]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，僅在培養(yǎng)的前2天，固定化小球藻的Fv/Fm低于液體懸浮態(tài)小球藻，而在培養(yǎng)的中后期，其結(jié)果與前期恰好相反，固定化小球藻的Fv/Fm值更高。Fv/Fm反映了光反應(yīng)中心PSⅡ的最大量子產(chǎn)量[31]，此值明顯變低說明植物正處于環(huán)境脅迫中[32]，說明試驗(yàn)初期固定化藻細(xì)胞處于環(huán)境脅迫中，光合活性受到抑制[33]，但在試驗(yàn)后期，固定化小球藻始終處于生長(zhǎng)階段，且通過Fv/Fm升高體現(xiàn)出固定化小球藻有較好的生長(zhǎng)狀態(tài)與光合活性。

本研究表明，固定化培養(yǎng)對(duì)小球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)有顯著影響。在固定化與液體懸浮態(tài)這兩種方式培養(yǎng)中，固定化培養(yǎng)的小球藻ΦPSⅡ、yield參數(shù)均有明顯上升趨勢(shì)。即固定化培養(yǎng)的光合特性和生長(zhǎng)情況均優(yōu)于液體懸浮態(tài)，更適宜小球藻生長(zhǎng)，提高其光合效率，這與對(duì)小球藻(ChlorellasorokinianaGXNN 01)固定化后，其生物量、生長(zhǎng)率和光合活性等方面都略優(yōu)游離態(tài)小球藻這一結(jié)果相似[34]，雖由于上述所提及到的小球藻因改變自身狀態(tài)會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢期，但從整體來看，固定化培養(yǎng)的小球藻生長(zhǎng)狀態(tài)、光合特性均優(yōu)于液態(tài)懸浮狀態(tài)的小球藻。這也說明固定化培養(yǎng)小球藻較比液體懸浮狀態(tài)小球藻有促進(jìn)其生長(zhǎng)的作用。

4 結(jié)論

綜上所述，固定化培養(yǎng)對(duì)小球藻生長(zhǎng)及生理特性產(chǎn)生了顯著的影響，小球藻固定化培養(yǎng)在細(xì)胞密度、光合色素含量及光合活性方面均優(yōu)于液體懸浮態(tài)培養(yǎng)。