何巧靈　劉德偉　何美男　張佳露　龍娟　鄒夢(mèng)晨

【摘要】 目的：分析miR-106a、miR-124表達(dá)水平與分化型甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展及遠(yuǎn)期生存率的關(guān)系。方法：選取2016年1-6月廣州市增城區(qū)中心醫(yī)院收治的62例分化型甲狀腺癌患者，行頸淋巴結(jié)穿刺和甲狀腺癌根治手術(shù)，檢測(cè)癌組織及癌旁組織的miR-106a、miR-124表達(dá)水平，分析miR-106a、miR-124表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性和臨床預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：癌組織中miR-106a表達(dá)量高于癌旁正常組織，miR-124表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織（P<0.05）;miR-106a在TNM分期Ⅲ期、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑>1 cm及被膜侵犯患者中呈較高表達(dá)，而miR-124在TNM分期Ⅲ期、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑>1 cm及被膜侵犯患者中呈較低表達(dá)（P<0.05）;miR-106a高表達(dá)患者5年生存率顯著低于低表達(dá)者，miR-124高表達(dá)患者5年生存率顯著高于高表達(dá)者（P<0.05）。結(jié)論：miR-106a、miR-124表達(dá)水平與分化型甲狀腺癌患者臨床分期和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，其水平表達(dá)與患者5年內(nèi)生存率密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 miR-106a miR-124 甲狀腺癌

The Relationship between the Expression Levels of miR-106a and miR-124 and the Development and Long-term Survival Rate of Differentiated Thyroid Cancer/HE Qiaoling， LIU Dewei， HE Meinan， ZHANG Jialu， LONG Juan， ZOU Mengchen. //Medical Innovation of China， 2022， 19（11）： -116

[Abstract] Objective： To analyze the relationship between the expression levels of miR-106a and miR-124 and the occurrence， development and long-term survival rate of differentiated thyroid cancer. Method： Selected 62 patients with differentiated thyroid cancer admitted to Central Hospital of Zengcheng District from January 2016 to June 2016， underwent cervical lymph node puncture and radical thyroid cancer surgery to detect the expression levels of miR-106a and miR-124 in cancerous tissues and adjacent tissues， the correlation between the expression levels of miR-106a and miR-124 and clinicopathological characteristics， and the relationship between their expression and clinical prognosis were analyzed. Result： The expression level of miR-106a in cancer tissues was higher than that in adjacent normal tissues， and the expression level of miR-124 was significantly lower than that in adjacent normal tissues （P<0.05）; miR-106a was highly expressed in patients with TNM stage Ⅲ， lymphatic metastasis， tumor diameter >1 cm and membranous invasion， while miR-124 was low expressed in patients with TNM stage Ⅲ， lymphatic metastasis， tumor diameter >1 cm and membranous invasion （P<0.05）. The 5-year survival rate of patients with high expression of miR-106a was significantly lower than that of patients with low expression of miR-124， and the 5-year survival rate of patients with high expression of miR-124 was significantly higher than that of patients with high expression of miR-124 （P<0.05）. Conclusion： The expression levels of miR-106a and miR-124 are related to clinical stage and lymphatic metastasis in patients with differentiated thyroid cancer， and the level of miR-106A and miR-124 is closely related to 5-year survival rate of patients.

[Key words] miR-106a miR-124 Thyroid cancer

First-author’s address： Central Hospital of Zengcheng District， Guangzhou City， Guangzhou 511300， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.11.028

分化型甲狀腺癌是主要的甲狀腺癌類類型，患者在確診時(shí)多伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，是影響患者術(shù)后復(fù)發(fā)和預(yù)后的重要原因，因此，了解分化型甲狀腺癌淋巴結(jié)組織病理特征，對(duì)于早期診斷具有重要意義[1-2]。以往研究表明，微RNA（micro RNA，miR）是一類小分子RNA，能夠調(diào)控腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起到原癌基因或抑癌基因的作用。微小RNA-106a（miR-106a）和微小RNA-124（miR-124）可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞促凋亡基因或凋亡抑制基因的活性，參與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)過程，在乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，但在分化型甲狀腺癌患者預(yù)后中的相關(guān)機(jī)制尚不清楚[3-4]?；诖耍敬窝芯客ㄟ^檢測(cè)miR-106a和miR-124表達(dá)與分化型甲狀腺癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、被膜浸潤等臨床病理特征，分析其在分化型甲狀腺癌發(fā)生與發(fā)展的作用，及預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床分化型甲狀腺癌早期診斷提供指導(dǎo)依據(jù)，以期改善患者預(yù)后?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取廣州市增城區(qū)中心醫(yī)院2016年1-6月收治62例分化型甲狀腺癌患者，其中乳頭狀甲狀腺癌35例、濾泡狀甲狀腺癌25例、乳頭狀甲狀腺癌合并濾泡狀癌2例，取患者癌組織標(biāo)本62份和癌旁組織標(biāo)本62份。其中男38例，女24例;年齡25～72歲，平均（39.47±5.26）歲。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合WHO甲狀腺腫瘤分類及診斷標(biāo)準(zhǔn)[5];②術(shù)前未進(jìn)行相關(guān)治療;③患者臨床資料完整。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并炎癥肝腎功能障礙者;②合并內(nèi)分泌系統(tǒng)、血液系統(tǒng)或代謝性相關(guān)疾病者;③合并其他惡性腫瘤者;④拒絕或不配合研究患者?；颊呋蚣覍僦榍液炇鹬橥鈺?。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 miR-106a檢測(cè) 取甲狀腺癌組織、癌旁組織常規(guī)切片組織15 μm兩張，置于離心管中，以二甲苯脫蠟、無水乙醇洗滌、干燥、蛋白酶K進(jìn)行消化，按照EASYspin1131試劑盒說明書進(jìn)行操作提取RNA。mircoRNA提取后使用50 μL DEPC水進(jìn)行稀釋，于-80 ℃凍存待用。以0.15 μL 100 mm dNTPs，1 μL LMultiscribeTM逆轉(zhuǎn)錄酶，1.5 μL×10逆轉(zhuǎn)錄Buffer，0.19 μL RNase抑制劑，3 μL反轉(zhuǎn)錄引物5 μL RNA模板，4.16 μL無RNA酶水逆轉(zhuǎn)錄體系將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件為16 ℃，30 min;42 ℃，30 min;85 ℃，5 min，反應(yīng)產(chǎn)物cDNA置于-20 ℃凍存待用。然后采用qRT-PCR檢測(cè)miR-106a，使用miR-106a的探針采用Taqman MicroRNA assays，檢測(cè)儀器為ABI實(shí)時(shí)定量PCR儀7500，以6B作為內(nèi)參。PCR條件為：50 ℃，2 min;95 ℃，10 min;95 ℃，15 min;60 ℃，1 min;35個(gè)循環(huán)。做3個(gè)復(fù)孔，取平均值作為Ct值。miR-106a的表達(dá)采用2-ΔΔCt表示，Ct=CtmiR-106a-CtU6B。

1.2.2 miR-124檢測(cè) 取甲狀腺癌組織、癌旁組織及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，按體積比1︰5加入RIPA裂解液，按照miRNA分離提取試劑盒所提供的步驟提取miRNA，測(cè)定所提取RNA的濃度及純度，使用PCR儀將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為：25 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，采用RT-qPCR檢測(cè)miR-124，根據(jù)Bi-Rad公司RT-qPCR試劑盒操作說明書加入相關(guān)試劑及引物，以U6為內(nèi)參，在ABI-7300實(shí)時(shí)熒光定量儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min，變性95 ℃ 12 s，退火62 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行表達(dá)量相對(duì)定量分析。

1.3 觀察指標(biāo) （1）檢測(cè)癌組織及癌旁組織中miR-106a、miR-124表達(dá)情況;（2）以癌組織中平均表達(dá)量為分界值，將miR-106a、miR-124分為高表達(dá)和低表達(dá)，比較不同病理分期和淋巴轉(zhuǎn)移患者miR-106a、miR-124表達(dá)分布情況，探究其表達(dá)水平與臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系;（3）隨訪5年內(nèi)分化型甲狀腺癌患者生存情況，比較不同miR-106a、miR-124表達(dá)患者生存率情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用字2檢驗(yàn)，以率（%）來表示;計(jì)量資料采取t檢驗(yàn)，以（x±s）表示;繪制Kaplan-Meier生存曲線評(píng)估預(yù)后。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同病理組織中miR-106a、miR-124表達(dá)水平比較 分化型甲狀腺癌組織中miR-106a表達(dá)量高于癌旁正常組織，miR-124表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 miR-106a、miR-124表達(dá)與臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 癌組織中miR-106a<0.73為正常表達(dá)，0.73～1.15為低表達(dá)，>1.15為高表達(dá);miR-124

>3.21為正常表達(dá)，1.95～3.21為高表達(dá)，<1.95為低表達(dá)。miR-106a在TNM分期Ⅲ期、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑>1 cm及被膜侵犯患者中呈較高表達(dá)，而miR-124在TNM分期Ⅲ期、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑>1 cm及被膜侵犯患者中呈較低表達(dá)（P<0.05），見表2。

2.3 miR-106a、miR-124高表達(dá)和低表達(dá)患者5年生存率的比較 miR-106a高表達(dá)患者5年生存率顯著低于低表達(dá)，miR-124高表達(dá)患者5年生存率顯著高于高表達(dá)（P<0.05），見表3。

3 討論

近年來，隨著基因檢測(cè)技術(shù)在各疾病領(lǐng)域應(yīng)用的發(fā)展，miRNAs在惡性腫瘤診斷中的價(jià)值被逐漸關(guān)注。mircoRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA，可通過與其目的mRNA結(jié)合，降解mRNA，還可抑制mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯，從而抑制靶基因的表達(dá)[6-7]。miRNAs與多種原癌基因的激活或抑癌基因的抑制有關(guān)，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生過程中起著重要的作用。另外，組織中miRNAs結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、易獲取，其作為惡性腫瘤潛在生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床診斷和治療的想法應(yīng)運(yùn)而生[8-9]。本次研究發(fā)現(xiàn)miR-106a和miR-124在分化型甲狀腺癌不同病理組織中呈差異性表達(dá)，且其水平表達(dá)與臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是影響預(yù)后生存的重要影響因素。

在甲狀腺癌相關(guān)機(jī)制研究中miRNA所發(fā)揮的作用的研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌的發(fā)生與多個(gè)基因的異常突變或重排有關(guān)，可通過激活不同的信號(hào)通路從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移[10-11]。miR-106a具有典型的原癌基因活性，可抑制很多下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等惡性生物學(xué)行為，可通過抑制轉(zhuǎn)換生長因子受β-1和抗轉(zhuǎn)移因子TGF-BR2的表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤，上調(diào)的miR-106a可促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖[12]。本研究結(jié)果顯示，miR-106a與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miR-106a的表達(dá)較高，其臨床分期越高，miR-106a的表達(dá)也越高，這提示miR-106a與分化型甲狀腺癌發(fā)病和轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此，認(rèn)為miR-106a可能影響腫瘤的預(yù)后[13-14]。因此，miR-106a水平表達(dá)與分化型甲狀腺癌患者發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。隨訪5年結(jié)果顯示，miR-106a高表達(dá)組患者5年生存率顯著低于低表達(dá)者，說明其水平表達(dá)對(duì)于分化型甲狀腺癌患者預(yù)后具有重要參考意義。

miR-124是最新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，其堿基序列具有重要的生物學(xué)功能。進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，其在多種腫瘤組織中（肝癌、乳腺癌、宮頸癌）存在不同程度的表達(dá)降低，但當(dāng)抑癌基因功能，可見miR-124作為一種腫瘤抑制性miRNA，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[15-16]。研究通過檢測(cè)miR-124在甲狀腺癌組織及癌旁組織的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌組織中miR-124表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，且隨著臨床分期、腫瘤直徑增加及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miR-124表達(dá)下調(diào)，miR-124在甲狀腺癌不同病理中呈差異性表達(dá)，且隨訪5年發(fā)現(xiàn)，miR-124高表達(dá)組患者5年生存率顯著高于低表達(dá)者，這提示下調(diào)的miR-124可能參與甲狀腺瘤變、侵襲轉(zhuǎn)移的過程，與分化型甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[17-18]。以往文獻(xiàn)[19-20]研究也證實(shí)，miR-124作為抑癌基因可參與抑制乳頭狀甲狀腺癌的惡性生物學(xué)活性，上調(diào)的miR-124可以抑制K1細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，并可通過與靶基因作用，抑制靶基因mRNA的翻譯表達(dá)，降低蛋白產(chǎn)物，參與惡性腫瘤病變過程。由此可知，miRNA基因改變導(dǎo)致MAPK、Wnt/J3.Catenin等信號(hào)通路被異常激活，從而導(dǎo)致抑癌基因的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而促腫瘤形成、侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。這與相關(guān)研究中分化型甲狀腺癌分化與Wnt/p-Catenin信號(hào)通路的激活有關(guān)的報(bào)道一致[21-22]。但由于本次研究樣本量較小，且僅統(tǒng)計(jì)了5年內(nèi)分化型甲狀腺癌患者生存情況，對(duì)于其遠(yuǎn)期生存的影響方面的作用存在一定缺陷，需擴(kuò)大樣本進(jìn)行更深入、更長遠(yuǎn)的研究，但miRNAs在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)方面具有巨大的潛力值得肯定。

綜上所述，組織中miR-106a、miR-124表達(dá)水平與分化型甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miR-106a、miR-124表達(dá)水平與患者5年內(nèi)生存率密切相關(guān)，可通過檢測(cè)其水平指導(dǎo)臨床治療，對(duì)臨床分化型甲狀腺癌患者預(yù)后改善具有重要意義。

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（收稿日期：2021-10-27） （本文編輯：張爽）