基于生物信息學(xué)篩選與宮頸癌免疫相關(guān)的分子標(biāo)志物

羅永金，胡曉霞，王 丹，劉 珍，張 侃，洪翠萍

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一[1]，根據(jù)2018年的全球數(shù)據(jù)，每年約有31.1萬患者死于宮頸癌[2-3]。高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要原因[4-6]。但除了HPV感染外，患者的遺傳免疫因素也起到了重要作用?；蚨鄳B(tài)性的異常和免疫功能失調(diào)等因素與持續(xù)的HPV感染在宮頸癌的發(fā)生過程中具有協(xié)同作用[7-8]。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是腫瘤細(xì)胞所處的細(xì)胞環(huán)境，它由免疫細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、炎性介質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)組成[9-10]。TME中的細(xì)胞和分子處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，反映了癌癥的進(jìn)化本質(zhì)，并共同促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸、生長和轉(zhuǎn)移[11-12]。免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞是兩種主要類型的非腫瘤成分，被認(rèn)為在腫瘤的診斷和預(yù)后中具有重要的價(jià)值[13]。隨著生物學(xué)大數(shù)據(jù)時(shí)代的發(fā)展，通過生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和信息技術(shù)的結(jié)合，對(duì)包含大量數(shù)據(jù)的生物信息進(jìn)行分析成為可能。2013年，Yoshihara等[14]設(shè)計(jì)了一種ESTIMATE算法,利用表達(dá)數(shù)據(jù)估算惡性腫瘤組織中的基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞。在此算法中，研究者通過計(jì)算免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中特異性分子生物標(biāo)志物的表達(dá)特征，通過免疫和基質(zhì)評(píng)分來預(yù)測TME。近年來，有報(bào)道將ESTIMATE算法應(yīng)用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[15]、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌[16]和結(jié)腸癌[17]研究，驗(yàn)證了此算法的有效性。然而，目前鮮有研究將ESTIMATE算法應(yīng)用于宮頸癌的免疫、基質(zhì)評(píng)分及預(yù)后分析。鑒此，本研究通過癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫獲得宮頸癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)，通過ESTIMATE算法分析免疫、基質(zhì)評(píng)分及其與宮頸癌患者生存預(yù)后的關(guān)系，并結(jié)合高通量基因表達(dá)匯編(Gene Expression Omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)集(GSE63514),通過差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)分析、功能富集和生存分析，篩選出關(guān)鍵基因，并探討關(guān)鍵基因在宮頸癌的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)性。從而為宮頸癌免疫相關(guān)的生物標(biāo)志物的研究以及宮頸癌免疫治療提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)獲取和預(yù)處理 以“cervical cancer”“transcriptome profiling”“Gene Expression Quantification”為檢索詞，在TCGA數(shù)據(jù)庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)下載信息數(shù)據(jù)集，包含306例宮頸癌組織和3例正常宮頸組織數(shù)據(jù),同時(shí)下載與之對(duì)應(yīng)的臨床信息。將生存狀態(tài)和生存時(shí)間缺失的患者信息刪除，對(duì)收集到的數(shù)據(jù)集通過R語言軟件“estimate”程序包(ESTIMATE算法，https://r-forge.r-project.org)進(jìn)行免疫、基質(zhì)評(píng)分，并應(yīng)用R語言軟件的“survival”程序包對(duì)免疫、基質(zhì)進(jìn)行生存分析。以“cervical cancer”作為關(guān)鍵詞在GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載基因芯片數(shù)據(jù)集GSE63514，平臺(tái)：Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，包含24例正常宮頸組織和28例宮頸癌組織數(shù)據(jù)信息。生存分析以基因表達(dá)水平的中位數(shù)作為界值分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.2DEGs分析 根據(jù)免疫、基質(zhì)評(píng)分中位數(shù)將病例數(shù)據(jù)分為高、低免疫評(píng)分組和高、低基質(zhì)評(píng)分組，應(yīng)用R語言“l(fā)imma”程序包對(duì)免疫和基質(zhì)評(píng)分相關(guān)的基因做DEGs分析，獲得上調(diào)及下調(diào)基因。通過R軟件分析GSE63514數(shù)據(jù)集的芯片信息，將宮頸癌組織和正常宮頸組織數(shù)據(jù)進(jìn)行比較以獲得DEGs，并應(yīng)用R軟件制作火山圖將其表示出來。通過韋恩圖獲取上調(diào)基因和下調(diào)基因的交集。DEGs的篩選條件：基因表達(dá)量變化倍數(shù)≥2,調(diào)整后P≤0.01。

1.3功能富集分析 應(yīng)用R軟件的“cluster profile”程序包對(duì)DEGs進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，之后再進(jìn)行基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)。

1.4蛋白質(zhì)互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)分析 通過在線數(shù)據(jù)庫STRING(http://string-db.org)對(duì)DEGs構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，將最低關(guān)聯(lián)度設(shè)置為0.850。通過R軟件對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化，最后選擇前13位節(jié)點(diǎn)的DEGs作為關(guān)鍵基因，通過“survival”程序包對(duì)其進(jìn)行生存分析。

1.5PPI網(wǎng)絡(luò)中基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析 通過網(wǎng)站(http://Timer.cistrome.org/)下載免疫細(xì)胞和基因矩陣LM22文件，基于免疫細(xì)胞基因矩陣和TCGA數(shù)據(jù)基因矩陣，通過R軟件運(yùn)行CIBESORT源代碼，獲得樣本免疫細(xì)胞矩陣，分析PPI網(wǎng)絡(luò)中基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性，通過R軟件程序包“ggplot2”繪制相關(guān)性熱圖。

1.6關(guān)鍵基因的表達(dá)情況及外部驗(yàn)證 通過UALCAN在線網(wǎng)站(http://ualcan.path.uab.edu/index)分析SELL、CXCL9基因在宮頸癌組織中的表達(dá)水平，并分析其與宮頸癌患者生存預(yù)后的關(guān)聯(lián)性。通過GEPIA2(http://gepia.cancer-pku.c)和UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index)在線工具對(duì)基因分子水平進(jìn)行差異表達(dá)分析。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫的基因矩陣，利用GSEA軟件進(jìn)行KEGG通路分析，篩選出CXCL9、SELL的富集信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1宮頸癌免疫和基質(zhì)評(píng)分與患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 基于TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析，高免疫評(píng)分組患者的生存情況優(yōu)于低免疫評(píng)分組(log-rank檢驗(yàn)：χ2=4.400，P=0.035，見圖1?)?；|(zhì)評(píng)分與患者的生存預(yù)后未顯示出顯著關(guān)聯(lián)(log-rank檢驗(yàn)：χ2=0.735，P=0.391，見圖1?)。

?免疫評(píng)分；?基質(zhì)評(píng)分

2.2DEGs分析結(jié)果 基于TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，根據(jù)免疫評(píng)分高低進(jìn)行篩選，共獲得了1 063個(gè)DEGs，其中包括640個(gè)上調(diào)基因和423個(gè)下調(diào)基因(見圖2?)?；贕EO數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進(jìn)行DEGs分析，共篩選出1 903個(gè)DEGs，包括了1 698個(gè)上調(diào)基因和205個(gè)下調(diào)基因(見圖2?)。將兩者上調(diào)、下調(diào)基因一起合并制作韋恩圖，最終得到7個(gè)下調(diào)基因和100個(gè)上調(diào)基因(見圖2??)。

2.3富集分析結(jié)果 對(duì)韋恩圖篩選出的107個(gè)DEGs進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示，DEGs在生物過程中參與免疫效應(yīng)T細(xì)胞活性調(diào)節(jié)過程；在細(xì)胞組成中參與了質(zhì)膜的外側(cè)面和顆粒膜分泌等組成；在分子功能中參與細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活動(dòng)和激活信號(hào)受體的活性等(見圖3?)。KEGG通路分析和GSEA結(jié)果均提示，DEGs主要富集于細(xì)胞因子受體的相互作用信號(hào)通路和細(xì)胞黏附分子通路(見圖3?)。

?GO分析結(jié)果圖；?KEGG富集分析結(jié)果圖

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)分析和生存分析結(jié)果 應(yīng)用STRING在線工具構(gòu)建了一個(gè)包括49個(gè)節(jié)點(diǎn)和134條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖4?)，并篩選出前30個(gè)關(guān)鍵基因(見圖4?)。對(duì)前13個(gè)基因(節(jié)點(diǎn)數(shù)≥8)進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示，只有SELL和CXCL9基因與宮頸癌患者的生存預(yù)后相關(guān)(log-rank檢驗(yàn)：χ2=10.460，P=0.001；χ2=5.664，P=0.017)。見圖4??。

?PPI網(wǎng)絡(luò)圖；?關(guān)聯(lián)度排前30個(gè)基因的柱狀圖；?基于TCGA數(shù)據(jù)的CXCL9高、低表達(dá)組生存分析結(jié)果圖；?基于TCGA數(shù)據(jù)的SELL高、低表達(dá)組生存分析結(jié)果圖

2.5關(guān)鍵基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析結(jié)果 對(duì)以上篩選出的13個(gè)基因進(jìn)行免疫細(xì)胞相關(guān)性分析，結(jié)果顯示其與B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK殺傷免疫細(xì)胞存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。見圖5。

圖5 關(guān)鍵基因與免疫細(xì)胞相關(guān)性分析結(jié)果圖

2.6CXCL9和SELL基因的表達(dá)情況及外部驗(yàn)證結(jié)果 通過GEPIA2和UALCAN在線網(wǎng)站對(duì)CXCL9和SELL基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，宮頸癌組織中CXCL9呈高表達(dá)(P<0.05)，但SELL表達(dá)水平與正常組織或癌旁組織比較差異不顯著(P>0.05)。見圖6?～?。根據(jù)GEPIA2和UALCAN在線工具分析結(jié)果均顯示SELL的表達(dá)情況與患者生存預(yù)后具有關(guān)聯(lián)性，高表達(dá)組的預(yù)后更優(yōu)(P<0.05)。但僅UALCAN的分析結(jié)果顯示，CXCL9高表達(dá)組的生存預(yù)后優(yōu)于低表達(dá)組(P<0.05)，GEPIA2未獲得有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果(P>0.05)。見6?～?。

??基于UALCAN在線網(wǎng)站分析CXCL9和SELL在宮頸癌組織中的表達(dá)水平；??基于GEPIA2在線網(wǎng)站分析CXCL9和SELL在宮頸癌組織中的表達(dá)水平；??基于UALCAN在線網(wǎng)站驗(yàn)證CXCL9、SELL表達(dá)水平與宮頸癌患者生存預(yù)后的關(guān)聯(lián)性；??基于GEPIA2在線網(wǎng)站驗(yàn)證CXCL9和SELL與宮頸癌患者生存預(yù)后的關(guān)聯(lián)性

2.7CXCL9和SELL的GSEA結(jié)果 GSEA結(jié)果顯示，CXCL9參與了免疫T細(xì)胞、免疫B細(xì)胞反應(yīng)、趨化因子調(diào)控和NK殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性信號(hào)通路；SELL參與了免疫T細(xì)胞、免疫B細(xì)胞反應(yīng)和趨化因子調(diào)控等信號(hào)通路。

3 討論

3.1本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫宮頸癌患者的基因表達(dá)譜和臨床信息，通過ESTIMATE算法獲得免疫、基質(zhì)評(píng)分，并分析了評(píng)分高低與宮頸癌患者的預(yù)后關(guān)系。根據(jù)免疫評(píng)分高低獲得DEGs，與GEO數(shù)據(jù)庫獲得的DEGs取交集后得到7個(gè)下調(diào)基因和100個(gè)上調(diào)基因。對(duì)這些基因進(jìn)行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)其富集在免疫效應(yīng)調(diào)節(jié)過程、T細(xì)胞活性、對(duì)病毒反應(yīng)、白細(xì)胞黏附及T細(xì)胞活性調(diào)節(jié)等，均為免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的生物過程。KEGG分析提示DEGs主要富集于細(xì)胞因子受體的相互作用信號(hào)通路和細(xì)胞黏附分子通路。本研究還應(yīng)用生物信息學(xué)工具CIBESORT[18]分析DEGs與免疫細(xì)胞的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)這些基因與B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK殺傷免疫細(xì)胞存在顯著相關(guān)性。以上生物信息學(xué)分析結(jié)果提示宮頸癌DEGs參與免疫調(diào)節(jié)過程并與免疫細(xì)胞有顯著相關(guān)性，免疫調(diào)節(jié)及免疫相關(guān)基因在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。

3.2本研究通過對(duì)這些DEGs進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出30個(gè)關(guān)鍵基因，并發(fā)現(xiàn)CXCL9和SELL表達(dá)與宮頸癌患者生存相關(guān)。外部驗(yàn)證結(jié)果也顯示，CXCL9基因在宮頸癌組織中高表達(dá)，且高表達(dá)者預(yù)后更優(yōu)。SELL在宮頸癌組織中的表達(dá)未見明顯升高，但高表達(dá)者具有較好的生存預(yù)后。GSEA結(jié)果顯示，CXCL9參與了免疫T細(xì)胞、免疫B細(xì)胞反應(yīng)、趨化因子調(diào)控和NK殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性信號(hào)通路；SELL參與了免疫T細(xì)胞、免疫B細(xì)胞反應(yīng)和趨化因子調(diào)控等信號(hào)通路。

3.3趨化因子是一種可溶性蛋白質(zhì)，可分為4種亞型：CXC、CC、CX3C和C[19]，通過調(diào)節(jié)濃度梯度協(xié)調(diào)細(xì)胞遷移。在腫瘤發(fā)展的早期階段，趨化因子塑造了TME的免疫景觀，在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。有研究顯示，CXCL3在宮頸癌中高表達(dá)，同時(shí)其可促進(jìn)宮頸癌的惡性表型[20]。徐蕾蕾等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，CXCL13高表達(dá)可以導(dǎo)致宮頸癌患者產(chǎn)生不良預(yù)后。CXCL12可以降低宮頸癌細(xì)胞對(duì)放射線反應(yīng)敏感度，有望成為新的放射治療靶點(diǎn)[22]。CXCL9是趨化因子CXC亞族的一員，也被稱為γ-干擾素誘導(dǎo)的單因子，可由TME中的髓系細(xì)胞在炎癥條件下產(chǎn)生，它吸引表達(dá)CXCR3受體的細(xì)胞，包括活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞，并已被證明在免疫檢查點(diǎn)治療的反應(yīng)中發(fā)揮作用[23]。CXCL9表達(dá)可能與腫瘤組織中募集淋巴細(xì)胞至TME發(fā)揮抗腫瘤免疫應(yīng)答功能密切相關(guān)[24]。CXCL9具有抗血管生成的作用，其可通過與內(nèi)皮細(xì)胞作用，招募T細(xì)胞、NK細(xì)胞共同破壞腫瘤血管的形成[25]。有研究顯示，CXCL9高表達(dá)于結(jié)直腸癌組織，且與臨床病理相關(guān)，而CXCL9高表達(dá)者的5年無瘤生存期及總生存期明顯長于低表達(dá)組[26]。高表達(dá)的CXCL9還與腎癌、胰腺導(dǎo)管腺癌等許多惡性腫瘤的總體生存期延長相關(guān)[27-28]。也有研究者通過對(duì)卵巢癌生物信息挖掘發(fā)現(xiàn)CXCL9 mRNA在卵巢癌組織中高表達(dá)，與卵巢癌患者較好的預(yù)后顯著相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中，CXCL9過表達(dá)可以降低腫瘤血管的形成進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和生長[29]。CXCL9可以招募淋巴細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤免疫應(yīng)答作用，亦可以抵抗血管形成，進(jìn)而抑制腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和生長[24]。然而，截至目前，筆者在其他趨化因子與腫瘤的關(guān)系中尚未發(fā)現(xiàn)以上抗腫瘤作用，可能與我們尚未能對(duì)數(shù)據(jù)完全挖掘有關(guān)。

綜上所述，本研究基于ESTIMATE算法，應(yīng)用宮頸癌表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物學(xué)信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)免疫相關(guān)基因在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，并篩選出與預(yù)后相關(guān)的免疫基因趨化因子CXCL9，為進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)，為宮頸癌的免疫治療提供了潛在靶點(diǎn)。