GC-O結合OAV鑒定隴南初榨橄欖油關鍵香氣成分

趙 玉，張玉環(huán)，李建科*，張 芬*

（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710000）

油橄欖（Olea europaeaL.），作為世界四大木本油料作物之一，其栽培歷史悠久。目前，該作物在我國的白龍江低山河谷區(qū)、金沙江干熱河谷區(qū)和長江三峽低山河谷區(qū)廣泛種植[1]。據統(tǒng)計，甘肅隴南油橄欖種植面積可達60萬 畝，是全國最大種植基地[2]。油橄欖鮮果通過物理壓榨制取的橄欖油素有“液體黃金”之稱，因其富含多酚、維生素及不飽和脂肪酸等生物活性成分而備受消費者喜愛[3]。根據GB 23347ü2009《橄欖油、油橄欖果渣油》可將橄欖油分為初榨橄欖油、精煉橄欖油、混合橄欖油3 大類。其中初榨橄欖油的風味及營養(yǎng)組成與鮮果相似，是一種高檔且重要的植物油。香氣是產品品質的重要評價指標，明晰初榨橄欖油的呈香組成能夠據此指導產業(yè)化加工技術改進。

目前橄欖油中已發(fā)現(xiàn)180多種揮發(fā)性物質，大致包括醛類、醇類及酯類等[4]。有研究發(fā)現(xiàn)橄欖油中富含C6醛和C6醇，這些物質對橄欖油中水果香和青草香兩類優(yōu)良呈香屬性具有正向作用，是橄欖油風味形成的重要化合物[5]。它們廣泛存在于多種橄欖油中，如Kesen等[6]在土耳其3種橄欖油中鑒定出己醛、(E)-2-己烯醛、3-己烯醛和己醇等8種C6醛和C6醇類物質；雷春妮等[7]利用熱脫附-氣相色譜-質譜聯(lián)用技術解析10種初榨橄欖油的揮發(fā)性成分并發(fā)現(xiàn)己醇、己醛、(E)-2-己烯醛等是其主要呈香物質；此外，劉少敏等[8]采用氣相色譜-嗅聞-質譜（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-OMS）并結合電子鼻在6種橄欖油中共鑒定出65種揮發(fā)性成分，同時發(fā)現(xiàn)小分子化合物是橄欖油中重要呈香物質。綜上分析發(fā)現(xiàn)多數研究依靠物質含量多少判定橄欖油中重要香氣物質，有利于初步了解其呈香物質組成規(guī)律，但橄欖油整體風味屬性的呈現(xiàn)往往與某些物質緊密相關，這些物質稱為關鍵香氣成分。不同單體物質風味閾值具有差異性，因此單純依靠物質含量判定橄欖油中關鍵香氣成分具有局限性和不確定性，進而還需借助相關方法深入揭示橄欖油中的關鍵香氣成分。

氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技術是以人的嗅覺作為檢測器篩選香氣活性物質的有效方法[9]，同時結合各組分貢獻程度評價的關鍵指標香氣活性值（odor activity value，OAV）可實現(xiàn)體系中關鍵香氣成分的科學篩選。如Wang Yuanhui等[10]采用GC-O和OAV成功鑒定出中國傳統(tǒng)餃子中關鍵香氣成分；Liu Jie等[11]采用相同方法分析了一種市場接受度良好紅糖的主要香氣物質；柴瑞雪等[12]亦采用此方法科學篩選出干紅葡萄酒的關鍵香氣物質；由此可見，此方法可用于樣品中關鍵香氣物質的篩選。本研究采用GC-O并結合OAV篩選隴南3種具有代表性初榨橄欖油的關鍵香氣成分。研究結果預期可為橄欖油風味品質改善及產業(yè)化技術改進提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用油橄欖均于2020年9月采自甘肅隴南市武都區(qū)祥宇油橄欖種植園（104.92°E，33.39°N）。選取該地經典的萊星和鄂植8號為研究對象，各采摘50 kg，鮮果經物理冷榨制備而成初榨橄欖油。此外，選取一種當地廣受歡迎的市售特級混合初榨橄欖油（物理冷榨，田園品味牌，隴南田園油橄欖科技開發(fā)有限公司）進行對比分析。所有樣品于4 ℃冷藏保存，且需在24 h內完成后續(xù)分析。

正構烷烴（C7～C40）、1,2-二氯苯、(Z)-2-戊烯-1-醇（≥96%）、1-辛烯-3-醇（≥98%）、己醇（≥99.9%）、3-己烯-1-醇（≥96.0%）、(E)-2-己烯-1-醇（96%）、芳樟醇（≥99.0%）、1-辛醇（≥99.7%）、庚醛（≥97.0%）、(E)-2-己烯醛（≥97.0%）、辛醛（≥98.0%）、壬醛（≥99.5%）、(E,E)-2,4-己二烯醛（≥95.0%）、(E)-2-辛烯醛（≥97.0%）、苯甲醛（≥99.5%）、(E)-2-癸烯醛（≥95.0%）、乙酸己酯（≥99.7%）、苯甲酸甲酯（≥99.5%）、2-辛酮（≥99.5%）、甲基庚烯酮（≥97.0%）、乙酸（≥99.8%） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

DF-101S恒溫磁力攪拌器 河南予華儀器有限公司；7890B-5977B GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；ME104E電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；9100嗅聞儀 瑞士Brechbuhler公司。

1.3 方法

1.3.1 固相微萃取處理

采用預先優(yōu)化的固相微萃取條件進行樣品前處理，準確稱量5.00 g樣品和1 μL 1,2-二氯苯（溶于甲醇的內標物，1.306 μg/μL）于20 mL頂空瓶中且用聚四氟乙烯/硅橡膠隔墊密封，在40 ℃平衡20 min，順次將DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）的萃取纖維頭置于距離樣品上表面1 cm處吸附30 min后，立即于GC進樣口中在250 ℃熱解吸5 min。

1.3.2 GC-MS條件

GC條件：采用前期預實驗選擇的DB-WAX柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm）；分離鑒定初榨橄欖油的揮發(fā)性成分，以1.5 mL/min流速的高純氦氣（＞99.999%）為載氣，采用不分流進樣模式，升溫程序：40 ℃起始柱溫保持1 min；以5 ℃/min升至75 ℃，保持5 min；然后柱溫以3 ℃/min升至95 ℃，保持5 min；最后以10 ℃/min分別升至120、140 ℃及220 ℃并各保持5 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；全掃描模式；質量掃描范圍m/z35～350。

1.3.3 定性及定量

定性方式：為了確保研究結果的準確性，采用3種方式對所測物質進行定性分析。首先，利用NIST14庫進行初步定性（匹配度需大于80）；然后根據相同程序下正構烷烴的出峰時間計算各物質的Kováts保留指數（Kováts index，KI），按式（1）計算，將文獻中的KI值與計算所得KI值進行比對定性；最后在相同程序下分離各物質的香氣標準品，通過比對各物質與其相應標準品的出峰時間以實現(xiàn)準確定性。

式中：tx、tn及t（n+1）分別為物質x、碳原子數為n及碳原子數為n+1正構烷烴的保留時間/min。

定量分析：采用內標法進行定量，按式（2）計算：

式中：Cx為物質x的含量/（μg/kg）；Ax和As分別為物質x與內標物的峰面積；mx與ms分別為用于萃取的樣品質量/kg與內標物質量/μg。

1.3.4 GC-O分析

通過嗅聞儀結合操作簡單且應用廣泛的頻率檢測法進行嗅聞分析，GC條件同GC-MS色譜條件。當組分在DB-WAX色譜柱上分離后，以1∶1模式分別進入質譜檢測器和嗅聞儀。挑選具有豐富感官經驗且經嚴格感官程序培訓的8 位人員（4 男4 女，平均年齡25 歲）進行嗅聞分析。為了防止鼻腔黏膜受損，嗅聞口同時通入40 mL/min濕空氣，要求所有人員在嗅聞過程中準確記錄每個流出物開始和結束的感知時間及香氣描述。最終以流出物被嗅聞到的總次數即檢測頻率（detection frequency，DF）作為量化指標，8 位評價人員中有4 位及以上人員感知到的香氣物質視為香氣活性物質。

1.3.5 OAV分析

OAV為香氣物質質量濃度與風味閾值的比值，可用于評價香氣物質對樣品風味呈現(xiàn)的貢獻程度[13]。通常OAV不小于1的香氣物質具有不可忽視的貢獻，OAV越大表明其貢獻作用越大。

1.4 數據處理

以上所有實驗皆作3次平行，以其平均值為最終結果。采用SPSS 23進行方差分析，Graphpad prism 8繪制物質含量堆積圖。

2 結果與分析

2.1 初榨橄欖油GC-MS分析結果

采用GC-MS對比分析3種初榨橄欖油的揮發(fā)性組成，共鑒定出47種揮發(fā)性成分，包括19種醇、12種醛、6種酯、4種萜烯及6種其他類物質（表1）。其中，萊星、特級混合及鄂植8號初榨橄欖油各檢測到35、30種及25種揮發(fā)性成分。對每類物質的總含量匯總分析發(fā)現(xiàn)（圖1）3種初榨橄欖油皆富含醇類和醛類物質。從含量上看，己醇、3-己烯-1-醇、(E)-2-己烯-1-醇和(E)-2-己烯醛為主導，這與劉少敏[14]研究結果一致。有研究表明亞油酸和亞麻酸在脂肪氧合酶和氫過氧化物裂解酶的作用下裂解形成C6醛（(E)-2-己烯醛），然后這些醛類物質經乙醇脫氫酶作用轉化形成醇類物質（己醇、3-己烯-1-醇）[15]。萊星初榨橄欖油中檢測到較高含量的2-癸烯-1-醇（54.66 μg/10 g）、3-己烯醛（13.49 μg/10 g）和苯甲醛（1.80 μg/10 g）；庚醛、(E)-2-辛烯醛和羅勒烯等僅在特級混合初榨橄欖油中有檢出；環(huán)戊醇、庚醇和(Z)-2-辛烯-1-醇等在鄂植8號初榨橄欖油中有檢出。綜上分析，3種橄欖油的揮發(fā)性成分的種類及物質含量具有明顯區(qū)別。

圖1 不同樣本中各類物質總含量分析Fig.1 Total contents of different classes of volatile compounds in different virgin olive oil samples

表1 不同初榨橄欖油GC-MS結果分析Table 1 GC-MS analysis of volatile components of different virgin olive oil samples

續(xù)表1

2.2 初榨橄欖油的GC-O分析

由GC-O從3種初榨橄欖油中各篩選出13、15種和12種DF不小于4（檢測總人數為8）的揮發(fā)性成分，這些物質稱為香氣活性化合物[16]，它們包括5種醇、6種醛、2種酯及3種其他物質（表2）。

表2 不同橄欖油GC-O篩選的香氣活性化合物（DF≥4）Table 2 Aroma compounds identified by GC-O in different olive oil samples (DF ≥ 4)

經GC-O檢測，共篩選出5種醇類物質，評價人員在所有樣本中皆可以感知到這些物質。其中，己醇、3-己烯-1-醇及(E)-2-己烯-1-醇皆具有青草味，與本研究結果一致，這些物質皆是常見的具有青草特征的C6化合物，已多次在城固32號、皮瓜爾和佛奧[17-19]等橄欖油中檢測到，對橄欖油風味輪廓呈現(xiàn)具有重要作用。1-辛烯-3-醇是具有典型蘑菇味的呈香物質，是山胡椒油、蔥香油及大豆油[20-22]中重要風味化合物，本研究亦發(fā)現(xiàn)此物質是橄欖油中的香氣活性化合物，尤其在鄂植8號橄欖油中，它的DF值達到最高（DF=8）。此外，具有橘子和檸檬味的芳樟醇在所有樣品中皆具有高DF值，對橄欖油風味輪廓的形成具有不可忽視的作用。

醛類物質普遍具有強烈的氣味特征，本研究通過GC-O共感知到6種醛類物質，分別為庚醛、3-己烯醛、(E)-2-己烯醛、辛醛、(E)-2-辛烯醛及(E,E)-2,4-癸二烯醛。其中，3-己烯醛和(E)-2-己烯醛具有青草氣息，但3-己烯醛只在萊星橄欖油中有檢出，(E)-2-己烯醛對橄欖油青草呈香屬性的形成至關重要[23]，本研究亦發(fā)現(xiàn)此物質皆在所有橄欖油中有檢出且具有較高的DF值。庚醛、(E)-2-辛烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛具有油脂的氣味特征。通過GC-O篩選的2種酯類物質（乙酸己酯和苯甲酸甲酯）、1種萜烯類物質（α-蒎烯）、2-辛酮和乙酸為3種初榨橄欖油的重要香氣物質。其中酯類物質主要具有果香特性。有研究表明萜烯類物質為植物的次生代謝產物，對特級初榨橄欖油風味識別至關重要，α-蒎烯作為一種萜烯類物質，對橄欖油風味品質具有較大貢獻[14,24]，本研究發(fā)現(xiàn)具有松樹氣味特征的此物質在鄂植8號橄欖油中DF值為8，是重要的呈香物質。有研究報道乙酸對橄欖油整體風味具有負面影響[25]，乙酸具有酸味特征，它在所用樣品中的DF值皆較?。―F≤5）。

2.3 香氣活性化合物的OAV分析結果

香氣閾值是呈香物質的一個重要特性，不同物質的香氣閾值千差萬別，即使相同物質在不同基質中其香氣閾值也有所差異[26]，單純依靠物質含量評測香氣成分對樣品呈香品質貢獻具有局限性。因此，本研究在采用GC-O篩選出橄欖油香氣活性物質的基礎上，順次結合可表征香氣物質對呈香輪廓形成貢獻性的物理量（OAV）深入揭示橄欖油的關鍵香氣物質。一般，OAV不小于1的物質視作對樣品香氣品質具有貢獻作用，其值越大表明貢獻性越大[27]。由表3可知，萊星、特級混合初榨及鄂植8號橄欖油中分別有12、13種及11種OAV不小于1的香氣成分，這些物質稱為關鍵香氣成分。其中，3種橄欖油中含有10種共有關鍵組分，包括醇類4種、醛類3種、酯類1種、α-蒎烯及乙酸。

表3 香氣活性化合物的OAV分析Table 3 OAVs of aroma compounds

辛烯-3-醇、芳樟醇、(E)-2-己烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛在所有樣品中皆具有較高的OAV。其中，芳樟醇及(E,E)-2,4-癸二烯醛具有極低的香氣閾值使其具有較高的OAV。相比之下，(E)-2-己烯醛的香氣閾值較高，甚至達到320 μg/kg，但由于其含量較高，同樣此物質對橄欖油呈香品質具有重要作用；Amanpour等[28]亦發(fā)現(xiàn)(E)-2-己烯醛不僅在Nizip Yaglik橄欖油中含量豐富，而且也是其關鍵香氣物質之一。除以上物質外，所有橄欖油中OAV大于1的物質還有己醇、3-己烯-1-醇、辛醛、乙酸己酯、α-蒎烯及乙酸，它們對橄欖油呈香輪廓的形成也不可忽略。3-己烯醛只在萊星橄欖油中有檢出，它的OAV達到793.52，是此樣品中一種重要的香氣物質。庚醛、反式-2-辛烯醛及2-辛酮只是特級混合初榨橄欖油中的關鍵香氣成分（OAV≥1）。苯甲酸甲酯具有較高的閾值，因此對橄欖油香氣品質貢獻性較小。整個嗅聞過程中以空氣為基質，通過評價人員實施感官嗅聞，可能具有些許人為誤差；OAV分析絕大多數以載體油脂為基質測定的香氣閾值，這種不同評測基質會引起兩種方式鑒定結果出現(xiàn)不一致的情況[29]。但從整體上看，GC-O篩選結果與OAV分析結果大體一致，即通過GC-O篩選出的香氣活性物質絕大多數為關鍵香氣成分。因此，通過GC-O并結合OAV法最終科學篩選出不同橄欖油中關鍵香氣成分。由圖2A可以直觀看出，萊星、特級及鄂植8號橄欖油各篩選出12、13種及11種關鍵香氣成分，其中10種共有組分結構式見圖2B，這些物質大多數為直鏈型，且多數含有C＝C及C＝O雙鍵，這2種雙鍵可能對橄欖油呈香品質具有重要作用。

圖2 3種橄欖油關鍵香氣成分的Venn圖（A）及共有關鍵組分結構式圖（B）Fig.2 Venn diagram (A) and structural formulae of key aroma compounds common to three olive oil samples (B)

3 結 論

通過對萊星、特級混合及鄂植8號3種初榨橄欖油進行GC-MS分析，共檢測出47種揮發(fā)性成分，各自包括35、30種及25種物質。通過GC-O在3種橄欖油中各篩選出13、15種和12種香氣活性成分，這些成分具有不同的呈香屬性，其中C6醇和C6醛具有青草氣息。順次對香氣活性物質進行OAV分析，3種橄欖油最終各篩選出12、13種及11種關鍵香氣成分（OAV≥1），包含10種共有關鍵組分，1-辛烯-3-醇、芳樟醇、(E)-2-己烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛的OAV較高，對3種橄欖油呈香品質發(fā)揮重要作用。本研究采用GC-O并結合OAV分析科學篩選出隴南3種橄欖油的關鍵香氣成分，結果可為橄欖油品質改善及產業(yè)化技術改進提供科學依據。