羅 倩，魯 迨，黃晨濤，石星波*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品安全微納生物傳感技術(shù)課題組，湖南 長沙 410128）

組胺是一種生物胺，在人體的各種生理和病理過程中作為重要的生物源性介質(zhì)，一定濃度的組胺對于人體維持正常生理活動(dòng)，如血管擴(kuò)張、血壓下降、局部免疫反應(yīng)等，必不可少[1-4]。但是，人體中組胺濃度一旦過高，將會(huì)與G蛋白偶聯(lián)的組胺受體結(jié)合，引發(fā)一系列過敏性炎癥反應(yīng)疾病[5]。魚的肌肉組織中通常含有大量的游離組氨酸。在一定條件下，游離的組氨酸會(huì)被某些細(xì)菌脫羧而產(chǎn)生大量的組胺，食用含有大量組胺魚會(huì)導(dǎo)致組胺中毒和臨床疾病[6]。在食品生產(chǎn)、貯藏和運(yùn)輸過程中，組胺作為食品質(zhì)量中的生物標(biāo)志物之一倍受關(guān)注，對組胺進(jìn)行準(zhǔn)確而高靈敏的檢測至關(guān)重要。目前不同國家根據(jù)不同食品的特性給出組胺的限量標(biāo)準(zhǔn)，美國食品及藥物管理局規(guī)定魚類組胺含量不能超過50 mg/kg[7]，歐洲食品安全局規(guī)定新鮮魚類產(chǎn)品組胺含量為100～200 mg/kg[8]。我國規(guī)定鮐魚、鲹魚、竹莢魚、鯖魚、鰹魚、金槍魚等青皮紅肉海水魚組胺含量不得超過40 mg/100 g，其他海水魚不得超過20 mg/100 g[9]。

食品中組胺的常見檢測方法有色譜檢測技術(shù)[10-12]、毛細(xì)管電泳技術(shù)[13]、電化學(xué)傳感技術(shù)[14]和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)等[15]。但是這些方法目前都存在檢測成本高，儀器尺寸大而難以運(yùn)輸，需要耗時(shí)的程序、昂貴的設(shè)備和熟練的操作人員等缺點(diǎn)。例如，當(dāng)使用色譜和毛細(xì)管電泳技術(shù)時(shí)，需要長時(shí)間的樣品制備，如組胺衍生物的制備[16]。因此，研究建立一種準(zhǔn)確、簡單、高效、快速的針對魚肉樣品中組胺的檢測方法變得非常必要。核酸適配體是一種通過體外進(jìn)化過程，從隨機(jī)序列核酸文庫中人工選出的功能性DNA/RNA寡核苷酸序列，能特異性結(jié)合目標(biāo)物[17]，是一類很有潛力的抗體替代品。由于其價(jià)格便宜，容易合成，不易失活的特性，目前開發(fā)基于核酸適配體針對小分子的檢測方法也越來越多[18-21]。近年來，適配體逐漸被應(yīng)用到食品安全檢測領(lǐng)域[22-23]，而金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）因其表面等離子體效應(yīng)能快速響應(yīng)并介導(dǎo)比色信號(hào)，在化學(xué)和生物傳感領(lǐng)域也受到廣泛關(guān)注[24-26]。與此同時(shí)，利用智能手機(jī)記錄并分析顏色信息，使得各種基于比色信號(hào)的生物傳感策略變得更為便攜與實(shí)用[27-28]。受以上工作的啟發(fā)，Lerga等[29]將成功篩選的組胺適配體與AuNPs材料結(jié)合，以加鹽使AuNPs聚集的方式實(shí)現(xiàn)顏色的變化，構(gòu)建了一種目視比色檢測組胺的傳感方法。Huang Conghui等[30]發(fā)現(xiàn)咪唑環(huán)及脂肪族氨基有協(xié)同誘導(dǎo)未修飾AuNPs聚集的性質(zhì)，建立了一種未修飾的AuNPs比色檢測組胺的方法。鮮見報(bào)道既利用組胺誘導(dǎo)AuNPs聚集的特點(diǎn)，又結(jié)合適配體特異性識(shí)別組胺的檢測方法。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)建立一種快速、便攜的組胺檢測方法。該方法是由AuNPs、組胺適配體組成的檢測體系。在此體系中，有組胺存在時(shí)，組胺與適配體結(jié)合，誘導(dǎo)AuNPs聚集呈現(xiàn)顏色的變化達(dá)到快速檢測組胺的目的。同時(shí)，顏色信息被智能手機(jī)成像識(shí)別，并通過RGB分析進(jìn)行數(shù)字化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)便攜式檢測組胺，旨在為復(fù)雜基質(zhì)的樣品中檢測組胺提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HAuCl4g3H2O（純度≥99.9%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；檸檬酸三鈉（Na3Cit）、硼氫化鈉（NaBH4） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；組胺、二甲胺、三甲胺、β-苯乙胺、乙二胺、亞精胺、色胺上海麥克林生化科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（18.2 MΩgcm）。

組胺適配體序列[29]（5′-AGC TCC AGA AGA TAA ATT ACA GGG AAC GTG TTG GTT GCG GTT CTT CCG ATC TGC TGT GTT CTC TAT CTG TGC CAT GCA ACT AGG ATA CTA TGA CCC CGG-3′）經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司合成和高效液相色譜純化。

1.2 儀器與設(shè)備

Spark酶標(biāo)儀 瑞士帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；Zetasizer Nano-ZS納米粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；BX 51立式熒光顯微鏡（配備UPLSAPO Olympus 100 倍油浸物鏡） 日本奧林巴斯公司；CMOS Michrome 20顯微鏡相機(jī) 上海微圖儀器科技發(fā)展有限公司；榮耀手機(jī)20 華為技術(shù)有限公司；BSA124S電子天平賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司；Heraeus Pico 17離心機(jī)賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Mingche No CP2ALLRESCN超純水系統(tǒng) 密理博中國有限公司；Image J軟件由National Institutes of Health開發(fā)。

1.3 方法

1.3.1 AuNPs的制備

參照J(rèn)ana等[31]的方法，將1 mL HAuCl4g3H2O（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%）與99 mL超純水在磁力攪拌下混合15 min，然后在室溫條件下加入1 mL Na3Cit（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%）。最后，取1 mL NaBH4（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.075%）和1 mL Na3Cit（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%）的混合物滴入溶液中，攪拌30 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 組胺測定方法的建立

將合成的AuNPs（200 μL）與組胺適配體（1 μL、10 μmol/L）在室溫（25 ℃）孵育10 min。隨后，20 mmol/L組胺以不同的體積被添加到該體系中，取200 μL反應(yīng)體系溶液加入至96 微孔聚苯乙烯板并放入酶標(biāo)儀中進(jìn)行紫外-可見光譜掃描。以610 nm與520 nm波長處吸光度之比評價(jià)各參數(shù)的影響及定量組胺。同時(shí)，通過智能手機(jī)記錄AuNPs的顏色變化，利用Image J軟件分析拍攝彩色照片的藍(lán)（B）、綠（G）、紅（R）3個(gè)通道的值，以G/R灰度值定量分析組胺。

1.3.3 組胺測定方法的特異性評價(jià)

選擇6種常見的生物胺類物質(zhì)（二甲胺、三甲胺、β-苯乙胺、乙二胺、亞精胺、色胺）作為干擾物質(zhì)，濃度為1 μmol/L，采用1.3.2節(jié)檢測方法進(jìn)行特異性檢測。

1.3.4 水樣及鳙魚樣加標(biāo)回收率與檢測應(yīng)用

參照Lerga等[29]的方法，將鳙魚去除魚鱗、魚腸和魚頭，魚肉剁碎用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，稱取0.5 g魚肉肉糜，加入25 mL超純水，旋渦振蕩1～2 min，再以10 000 r/min離心5 min后，收集提取上清液。

將不同濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到1.3.2節(jié)中的體系溶液和鳙魚提取上清液中。對每個(gè)溶液進(jìn)行3次標(biāo)準(zhǔn)添加和回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

使用智能手機(jī)對反應(yīng)前后的溶液拍照獲取圖像，利用Image J軟件采集圖像的RGB值，步驟如下：1）選擇并點(diǎn)擊Image-Color-Split channels，將圖像拆分為藍(lán)（B）、綠（G）、紅（R）3個(gè)顏色通道；2）通過一個(gè)固定的矩形區(qū)域（約1 000 像素）對不同通道圖像提取平均灰度值，點(diǎn)擊Analyze-Measure得到結(jié)果；3）最后計(jì)算G/R通道的比值實(shí)現(xiàn)可視化定量組胺。

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均使用Origin2016統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行線性擬合并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于核酸適配體吸附AuNPs比色傳感器測定組胺策略的設(shè)計(jì)原理

如圖1所示，適配體的堿基與AuNPs之間存在范德華引力，使適配體吸附在AuNPs表面上，且堿基上的磷酸基團(tuán)帶有負(fù)電荷，使AuNPs能夠相互排斥而穩(wěn)定分散在溶液中[32-33]。在適配體/AuNP溶液體系中，當(dāng)存在適當(dāng)濃度組胺目標(biāo)物時(shí)，一部分組胺與被吸附在AuNPs表面上的適配體鏈特異性結(jié)合，使帶有殘存AuNPs檸檬酸根離子暴露于溶液中。另一部分存在的組胺，則通過其咪唑環(huán)取代合成AuNPs表面的檸檬酸根離子，帶正電的組胺與帶負(fù)電的檸檬酸離子的結(jié)合降低了AuNPs的凈表面電荷，從而破壞AuNPs的穩(wěn)定性并引發(fā)聚集[30,34]。通過分析AuNPs聚集發(fā)生的顏色改變，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)組胺的定量分析。

圖1 基于核酸適配體吸附AuNPs的組胺傳感策略圖Fig.1 Schematic diagram of sensor strategy for histamine detection based on aptamer-absorbed AuNPs

2.2 基于核酸適配體吸附AuNPs比色傳感器測定組胺策略的可行性驗(yàn)證

如圖2所示，在光譜圖中約520 nm波長處可以觀察到純AuNPs溶液的特征表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）峰帶（圖2a）。吸附有適配體的AuNPs溶液與純AuNPs溶液相比，其SPR峰帶位置及吸光度和顏色變化基本無變化（圖2c）。加入組胺后，AuNPs溶液顏色由紅色變?yōu)榛疑⑶以?10 nm處出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)吸收峰，表明AuNPs聚集嚴(yán)重（圖2b）；而吸附有適配體的AuNPs溶液在520 nm處的SPR峰帶發(fā)生紅移，且610 nm處吸收峰值少許增高，證實(shí)了適配體具有保護(hù)AuNPs不被聚集的效應(yīng)，但同時(shí)由于剩余部分組胺能通過咪唑環(huán)取代AuNPs表面的檸檬酸根離子導(dǎo)致部分聚集（圖2d），由此，證明了該策略的可行性。

圖2 檢測原理可行性紫外-可見吸收光譜圖Fig.2 UV-visible absorption spectra showing the feasibility of the sensor for histamine detection based on aptamer-absorbed AuNPs

AuNPs的聚集可以通過暗場顯微成像下顆粒散射光的顏色變化得到證實(shí)，研究表明，單分散與團(tuán)聚的AuNPs的散射光顏色分別為綠色與紅色[35]。由圖3可知，純AuNPs與吸附有適配體的AuNPs在暗場顯微鏡視野中分布良好，散射光顏色為綠色（圖3a和圖3b）。有組胺存在時(shí)，AuNPs聚集顯著，散射光顏色為紅色（圖3d）。吸附有適配體的AuNPs在加入組胺后，暗場圖像中出現(xiàn)紅色和綠色兩種顏色的點(diǎn)（圖3c）。如圖4所示，經(jīng)組胺反應(yīng)并吸附有適配體的AuNPs溶液比單純吸附有適配體AuNPs溶液的Zeta電位高，表明一部分組胺中和了純AuNPs溶液的電荷。這兩種效應(yīng)都充分表明基于AuNPs核酸適配體傳感方法測定組胺策略的可行性。

圖3 利用暗場顯微成像考察傳感策略的可行性Fig.3 Dark-field scattering images showing the feasibility of the sensor for histamine detection based on aptamer-absorbed AuNPs

圖4 各種傳感溶液的Zeta電位圖Fig.4 Zeta-potential of various solutions

2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化

2.3.1 適配體濃度

組胺的適配體能夠特異性識(shí)別組胺，其濃度對比色傳感體系有直接影響。實(shí)驗(yàn)中將不同濃度的適配體加入到200 μL AuNPs中，并25 ℃孵育10 min，然后加入1.6 μmol/L組胺以考察比色信號(hào)。從圖5可以看出，隨著適配體濃度的增大，AuNPs溶液的吸光度與相應(yīng)的溶液顏色變化越不明顯，表明組胺對AuNPs的聚集效果越弱。當(dāng)加入適配體濃度大于40 nmol/L時(shí)，組胺對AuNPs不再具有聚集效果，顏色不再變灰。一方面為了保證適配體對AuNPs的保護(hù)作用，另一方面需要部分組胺誘導(dǎo)AuNPs聚集實(shí)現(xiàn)比色檢測。因此，40 nmol/L適配體濃度被選為最佳用量。

圖5 適配體濃度對比色傳感體系的影響Fig.5 Effect o aptamer concentration on the colorimetric sensor system

2.3.2 反應(yīng)時(shí)間

如圖6所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，基于AuNPs核酸適配體傳感方法測定組胺的反應(yīng)體系吸光度信號(hào)穩(wěn)定，說明加入組胺后，該傳感體系的比色信號(hào)不隨反應(yīng)時(shí)間的變化而變化，可以達(dá)到即時(shí)檢測的目的，縮短檢測時(shí)間。因此，在該比色傳感體系中不需要孵育即可實(shí)現(xiàn)紫外-可見吸光度的快速檢測。

圖6 反應(yīng)體系時(shí)間對比色反應(yīng)體系的影響Fig.6 Effect of reaction time on the colorimetric detection system

2.4 策略的靈敏度考察

如圖7a可知，隨著組胺濃度的增加，AuNPs檢測體系A(chǔ)610nm增大，而A520nm有少許波動(dòng)，但是AuNPs體測體系的顏色逐漸加深。為了避免檢測體系中AuNPs等底物濃度的輕微變化引起檢測信號(hào)的不準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)選用A610nm/A520nm作為信號(hào)變化的衡量標(biāo)準(zhǔn)。圖7b顯示，組胺在50 nmol/L～1.2 μmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)為R2=0.999，線性回歸方程為Y=0.293X+0.303 36。線性范圍（定量范圍）是指定量測定的最低濃度到遵循線性響應(yīng)關(guān)系的最高濃度間的范圍[36]。故本實(shí)驗(yàn)中比色法的定量范圍為50 nmol/L～1.2 μmol/L。檢測限根據(jù)3σ/K（其中σ為空白的標(biāo)準(zhǔn)差，K為校準(zhǔn)曲線的斜率）計(jì)算，為8.89 nmol/L。采用RGB法進(jìn)行顏色分析，如圖7c所示，紅色通道與綠色通道的比值（G/R）隨著組胺濃度的增加而增大，其中在150 nmol/L～1.0 μmol/L之間存在良好線性關(guān)系，即定量范圍。線性回歸方程為Y=0.067 98X+0.816 34，檢測限為24.91 nmol/L（圖7d）。這兩種方法都可用于組胺的定量檢測，其中RGB法能夠適用于組胺的便攜式檢測。如表1所示，與其他快速檢測方法相比，本方法具有良好的線性范圍與較好的靈敏度。

圖7 不同組胺濃度存在下檢測體系的靈敏度Fig.7 Sensitivity of the detection system in the presence of different histamine concentrations

表1 各檢測組胺方法的對比Table 1 Comparison of histamine detection methods

2.5 方法特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的特異性和選擇性，選擇組胺的類似物，如二甲胺、三甲胺、β-苯乙胺、乙二胺、亞精胺和色胺，作為對照樣，進(jìn)行信號(hào)考察。如圖8a所示，只有組胺存在時(shí)，紫外吸收信號(hào)響應(yīng)及顏色才與空白對照有明顯的變化，而二甲胺、三甲胺、β-苯乙胺、乙二胺、亞精胺和色胺沒有表現(xiàn)出較空白對照更為明顯的信號(hào)響應(yīng)。由圖8b和圖8c可知，比色法與RGB分析都表明組胺信號(hào)值比空白和其他胺信號(hào)值高，這一結(jié)果表明該方法特異性強(qiáng)，可用于組胺的特異性檢測。

圖8 檢測體系的特異性評價(jià)Fig.8 Evaluation of the specificity of the detection system

2.6 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

水樣及魚肉樣品加標(biāo)回收率考察該方法的準(zhǔn)確性與重復(fù)性。通過向水樣或者鳙魚樣品中添加組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其最終加標(biāo)濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L，采用本實(shí)驗(yàn)所建立的方法進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)。從表2可以看出，用比色法測得加標(biāo)回收率為91.82%～102.27%，RGB法的加標(biāo)回收率為98.96%～102.89%。由表3可知，比色法測得鳙魚樣品中加標(biāo)回收率為89.77%～108.92%，RGB法中鳙魚樣品的加標(biāo)回收率為88.96%～109.82%。兩種信號(hào)方式皆表明該比色策略具有較好的準(zhǔn)確性，可以用于組胺的檢測。

表2 水樣加標(biāo)回收率（n=3）Table 2 Recoveries of histamine in spiked water samples (n = 3)

表3 鳙魚樣品加標(biāo)回收率（n=3）Table 3 Recoveries of histamine in spiked bighead carp meat samples (n = 3)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)成功開發(fā)了一種基于核酸適配體吸附AuNPs的比色傳感檢測組胺的方法，其靈敏度高，基于紫外-可見吸收光譜測得的檢測限為8.89 nmol/L，而基于RGB方法的檢測限為24.91 nmol/L。本方法利用適配體的高親和力、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定特性以及AuNPs優(yōu)異的光學(xué)特性，使組胺本身帶有的咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)引起AuNPs的聚集，較好彌補(bǔ)了一般方法中加入鹽引起的AuNPs聚集現(xiàn)象，同時(shí)適配體的加入使本檢測方法更具特異性。最后根據(jù)顏色的變化定量組胺，引入智能手機(jī)可便攜式分析組胺，避免了傳統(tǒng)比色方法需要大型儀器的缺點(diǎn)。因此，該方法能滿足快速、現(xiàn)場即時(shí)檢測組胺的需求。