童春梅， 易文瑾， 馬 瓊， 鄧惠敏， 朱子丹

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/華南師范大學(xué)昆蟲科學(xué)與技術(shù)研究所/廣東省昆蟲發(fā)育調(diào)控與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510631)

昆蟲的變態(tài)發(fā)育主要由保幼激素(Juvenile Hormone,JH)和蛻皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)共同調(diào)控。JH幾乎存在于所有昆蟲的幼蟲期,在變態(tài)前維持個(gè)體生長發(fā)育水平,阻止幼蟲提前成熟變態(tài)[1-2]，而JH在幼蟲末齡期的下降則使20E可誘導(dǎo)蛻皮變態(tài)[3]。JH在昆蟲的發(fā)育過程中具有重要作用,然而JH信號通路的分子作用機(jī)制研究經(jīng)歷了漫長的時(shí)間,主要原因?yàn)槠銳H受體難以確定[4]。

經(jīng)過多年的研究,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了2個(gè)JH可能的受體：Met(Methoprene-tolerant)[4-7]和gce(germ-cell express)[8-9]。Met是一個(gè)能編碼bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域從而結(jié)合DNA的轉(zhuǎn)錄因子，最早是在果蠅(Drosophilamelanogaster)中發(fā)現(xiàn)并克隆的[5]。隨后，在尖音庫蚊(Culexpipiens)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)、岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)和赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)等昆蟲中也克隆到了DmMet相應(yīng)的同源體，這些同源基因所編碼的蛋白都含有典型的bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域，暗示Met在不同昆蟲中的功能可能比較保守[6-7]。 后期研究發(fā)現(xiàn)：果蠅中還存在另一個(gè)JH可能的受體gce，其基因序列與Met具有高度同源性，且同樣編碼一個(gè)含有bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，可以與DmMet形成同源或異源二聚體[8-9]；在果蠅中，gce能夠在體內(nèi)發(fā)揮Met的作用[10],且只有在Met和gce同時(shí)突變時(shí)果蠅才致死，二者都具有在幼蟲蛻皮時(shí)通過誘導(dǎo)Kr-h1的表達(dá)來阻止20E誘導(dǎo)的組織細(xì)胞凋亡的功能[11]。在赤擬谷盜中，利用RNAi技術(shù)對TcMet進(jìn)行干擾，結(jié)果使得赤擬谷盜幼蟲產(chǎn)生了對JH的抗性，并引起了幼蟲的早熟變態(tài)[7,12]。這一結(jié)果表明：TcMet在赤擬谷盜JH通路中起著重要的信號傳導(dǎo)作用。通過比對家蠶基因組數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，在家蠶中有2個(gè)果蠅Met同源基因，分別為BmMet1和BmMet2[13]。本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)對BmMet1進(jìn)行了克隆和表達(dá)定位分析，結(jié)果顯示：BmMet1基因mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)均在家蠶5齡中后期和吐絲期的翅原基組織中呈現(xiàn)較高水平，而在蛹期呈現(xiàn)較低水平，且受到JH類似物Methoprene的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[14]，所以本文主要以BmMet2為研究對象。

家蠶翅原基在5齡之前生長緩慢，在5齡中期迅速發(fā)育，其5齡后期時(shí)的大小形態(tài)已基本接近蛹期[15]，表明5齡時(shí)期的翅原基發(fā)育主要受JH的調(diào)控。然而，被認(rèn)為是JH受體的Met2是否參與翅原基的發(fā)育過程仍不清晰，本研究通過比對家蠶基因組數(shù)據(jù)庫，找到了果蠅Met和gce的同源基因BmMet2[13]，克隆表達(dá)了BmMet2中能與DNA結(jié)合的蛋白區(qū)域BmMet2DBD，并制備了可特異性識別BmMet2的抗體，利用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測了BmMet2在翅原基各時(shí)期的表達(dá)，免疫組化檢測了BmMet2在各組織中的定位表達(dá)情況，以期為研究BmMet2作為JH的受體是否參與調(diào)控家蠶的生長發(fā)育(尤其是翅原基發(fā)育)提供基礎(chǔ)，以及為闡明昆蟲變態(tài)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制、促進(jìn)蠶絲產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和為鱗翅目害蟲防治等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的家蠶品種為大造，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供。在溫度26±1 ℃、相對濕度為65%～75%、光周期為12 h∶12 h (光∶暗)的培養(yǎng)箱中，用新鮮采摘的桑葉飼養(yǎng)幼蟲。

1.2 方法

1.2.1 激素處理與基因表達(dá)量檢測 選取5齡第3天的家蠶，在其第2、3胸節(jié)處分別注射2 μg的JH類似物Methoprene或20E，另外注射相同體積的w=0.1%的DMSO 作為對照組。在1、2、4、8、16、32 h后分離翅原基。按Trizol Isolate抽提試劑盒的說明提取家蠶組織RNA，然后按照TAKARA公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，制備家蠶各發(fā)育時(shí)期(5齡第3天至蛹期第3天)翅的cDNA和激素處理后翅的cDNA。根據(jù)序列設(shè)計(jì)PCR引物(表1)，參照熒光定量PCR試劑盒的方法，進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測BmMet2的表達(dá)。

表1 本研究所使用到的引物Table1 The primers used in this study

1.2.2 基因克隆與表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)序列設(shè)計(jì)PCR引物(表1)，以家蠶cDNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α菌體中，篩選陽性克隆進(jìn)行測序確認(rèn)。用EcoRⅠ和XhoⅠ對BmMet2DBD片段和pProEx-HTa進(jìn)行雙酶切，膠回收后將回收片段進(jìn)行連接，構(gòu)建BmMet2DBD-pProEx-HTa表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化至DH5α中。將過夜培養(yǎng)后的細(xì)菌按1∶100的體積比加入LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、220 r/min；當(dāng)菌液的OD值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。實(shí)驗(yàn)對照為相同培養(yǎng)條件下的不含目的基因的空載。4 ℃、12 000 r/min離心1 min收集菌體，超聲波進(jìn)行破碎，離心后分別收集上清液和沉淀。最后進(jìn)行w=10%的SDS-PAGE凝膠電泳后考馬斯亮藍(lán)R250染色分析。

1.2.3 抗體制備及檢測 將500 μg 溶于PBS的BmMet2DBD重組蛋白與等量的弗氏完全佐劑充分混合。用注射器抽取乳化液，皮下注射新西蘭大白兔；每隔一個(gè)星期，用300 μg蛋白與弗氏不完全佐劑的混合液對兔子進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫。在第3次加強(qiáng)免疫7天后，在兔子耳朵靜脈近末端抽取血液。采集的血液在37 ℃培養(yǎng)箱中放置1 h，然后在4 ℃條件下放置過夜；第2天，10 000 r/min離心10 min，收集上清液，分裝放在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫肳estern blotting檢測抗體效價(jià)。

1.2.4 Western blotting實(shí)驗(yàn) 使用w=10%的SDS-PAGE電泳分離蛋白，每一個(gè)泳道蛋白上樣量為15 μg。使用電轉(zhuǎn)系統(tǒng)將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，隨后將膜放入w=3%的BSA中4 ℃封閉過夜，按1∶1 000的比例加入BmMet2抗體，37 ℃孵育1 h。用洗脫液洗膜3次去除未結(jié)合的抗體。以1∶10 000稀釋比例加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG酶標(biāo)抗體，于37 ℃孵育1 h。洗脫液洗膜4次后用四唑硝基藍(lán)(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(BCIP)混合進(jìn)行顯色。

1.2.5 BmMet2在家蠶組織中表達(dá)的免疫組化分析 將5齡第6天、吐絲期及預(yù)蛹期的家蠶置于冰上，等其凍至休克后從頭部注入φ=4%的多聚甲醛，隨后分別取其第2、3胸節(jié)放入φ=4%的多聚甲醇固定過夜。將固定好的樣品分別用φ=50%，70%，85%，95%，100%的乙醇梯度脫水，每次1 h，最后用φ=100%的二甲苯透明。將上述處理好的樣品在60 ℃的石蠟中滲蠟2 h，將熔化好的石蠟與組織放進(jìn)包埋架中調(diào)整好位置，等石蠟?zāi)蹋? ℃冷卻后即可取出蠟塊進(jìn)行切片。

將切片于二甲苯和乙醇梯度體積分?jǐn)?shù)下脫蠟，使用φ=3%的H2O2室溫下孵育5 min，20 mg/mL蛋白酶K反應(yīng)15 min；用預(yù)冷的0.2 mol/L甘氨酸溶液孵育2 min；孵育后用PBS緩沖液洗5 min，共洗3次；用w=5%的BSA的封閉液37 ℃下孵育過夜；用PBS 洗滌3次；按1∶200的比例加入一抗(可特導(dǎo)性識別BmMet2的抗體)，在37 ℃中孵育1 h；用PBS 洗5 min，共洗3次；每一塊載玻片上加入40～50 μL 異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔的二抗和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)的混合液，避光孵育30 min；PBS洗滌5 min，共洗3次；最后，在倒置熒光顯微鏡下觀察。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 家蠶 BmMet2蛋白的序列分析

從NCBI上獲得BmMet2蛋白序列(Accession number:NP_001108457.1)，用SMART軟件(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)對家蠶BmMet2的蛋白序列進(jìn)行分析預(yù)測。結(jié)果(圖1)顯示：BmMet2編碼1個(gè)bHLH-PAS型轉(zhuǎn)錄因子和1個(gè)PAC基序。bHLH是能與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，而PAS結(jié)構(gòu)域能與其他bHLH-PAS超家族成員發(fā)生蛋白-蛋白相互作用。這暗示了BmMet2能與DNA結(jié)合并與其他轉(zhuǎn)錄因子互作，共同調(diào)控下游基因的表達(dá)。

圖1 BmMet2蛋白的序列分析

2.2 BmMet2時(shí)期表達(dá)譜及激素誘導(dǎo)表達(dá)分析

qRT-PCR結(jié)果(圖2A)表明：在翅原基中，BmMet2在 5齡第3天和5齡第6天有較高水平的表達(dá)；到游走期，其表達(dá)水平有些下降；化蛹后，其表達(dá)水平持續(xù)下降，至蛹期第3天時(shí)已下降到較低水平。這一表達(dá)變化趨勢與保幼激素JH在家蠶體內(nèi)的滴度變化趨勢[16]相一致，表明BmMet2可能參與JH對翅原基發(fā)育的調(diào)控。激素處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2B)顯示BmMet2均受到JH和20E的誘導(dǎo)表達(dá)且JH類似物Methoprene的誘導(dǎo)作用更明顯：(1)在JH注射后1～2 h,BmMet2表達(dá)上調(diào);處理2 h后，激素誘導(dǎo)效應(yīng)不再明顯。(2)注射20E 1 h后亦可誘導(dǎo)BmMet2表達(dá)，至2 h時(shí)則顯著抑制表達(dá)。這些結(jié)果表明，BmMet2可能作為JH的響應(yīng)因子，參與了JH對翅原基發(fā)育的調(diào)控，且也能受20E的誘導(dǎo)表達(dá)，在復(fù)雜的JH和20E互作網(wǎng)絡(luò)中也可能發(fā)揮重要的作用。

圖2 BmMet2在翅原基中的時(shí)期表達(dá)譜及激素誘導(dǎo)表達(dá)分析

2.3 重組蛋白BmMet2DBD的原核表達(dá)及多克隆抗體的特異性

根據(jù)NCBI上BmMet2(Accession number:NM_001114985.1)的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增BmMet2中能與DNA結(jié)合的序列(BmMet2DBD)(圖3A)，經(jīng)過w=1%的凝膠電泳分離后，在1 000 bp附近顯示出一條特異性條帶，與預(yù)測條帶長度1 062 bp相符，經(jīng)序列測定證明克隆的序列正確(圖3B)。對BmMet2DBD進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，BmMet2DBD具有1個(gè)HLH結(jié)構(gòu)域、1個(gè)PAS結(jié)構(gòu)域和1個(gè)PAC基序。

圖3 BmMet2DBD的cDNA序列和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

將重組質(zhì)粒BmMet2DBD-pProEx-HTa轉(zhuǎn)化入DH5α，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h后，收集細(xì)菌進(jìn)行超聲波破碎離心，分離上清液和沉淀用于SDS-PAGE檢測。pProEx-Hta含有1個(gè)His標(biāo)簽，其相對分子質(zhì)量為3 000，而BmMet2DBD重組蛋白的相對分子質(zhì)量約為38 400，所以預(yù)測重組表達(dá)蛋白的相對分子質(zhì)量約為41 400。結(jié)果(圖4A)顯示：重組質(zhì)粒表達(dá)出重組蛋白，其相對分子質(zhì)量與預(yù)測相對分子質(zhì)量(41 400)非常相近，這表明BmMet2DBD重組蛋白在原核系統(tǒng)中成功表達(dá)，且主要以包涵體的形式存在于沉淀中。

用BmMet2DBD重組蛋白免疫新西蘭大白兔后，獲得相應(yīng)的BmMet2DBD多克隆抗體，并用BmMet2DBD-pPROEX-HTa轉(zhuǎn)化的細(xì)菌總蛋白進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)，對抗體進(jìn)行專一性分析。結(jié)果(圖4B)表明所制備的抗體能很好地識別抗原蛋白：制備的抗體能檢測到BmMet2DBD-pPROEX-HTa轉(zhuǎn)化的細(xì)菌總蛋白中的特異性蛋白條帶，而在pPROEX-HTa菌體總蛋白中沒有檢測到蛋白條帶。

圖4 重組蛋白 BmMet2DBD的表達(dá)及BmMet2DBD抗體的專一性分析

2.4 BmMet2蛋白在家蠶各發(fā)育時(shí)期翅原基中的表達(dá)

為探究BmMet2的功能，用Western blotting檢測了BmMet2在家蠶不同發(fā)育時(shí)期翅原基組織中的表達(dá)，每一個(gè)泳道蛋白上樣量均為15 μg。結(jié)果(圖5)顯示：從家蠶5齡第3天到熟齡期，BmMet2的表達(dá)量逐漸升高；在游走期第1天和預(yù)蛹期，其表達(dá)量達(dá)到峰值；預(yù)蛹期后，其表達(dá)量逐漸降低。游走期和預(yù)蛹期是家蠶變態(tài)發(fā)育的重要時(shí)期，BmMet2在這2個(gè)時(shí)期的高表達(dá)說明其很可能是參與調(diào)控家蠶變態(tài)發(fā)育的重要的轉(zhuǎn)錄因子。

圖5 BmMet2蛋白在家蠶翅原基中各個(gè)時(shí)期表達(dá)的分析

2.5 BmMet2蛋白的組織定位

為了確定BmMet2蛋白在家蠶組織中的定位，選取5齡第6天、吐絲期和預(yù)蛹期的家蠶制備石蠟切片，用熒光免疫組織化學(xué)的方法檢測BmMet2蛋白在蠶體主要部位的表達(dá)。結(jié)果表明：BmMet2蛋白在幼蟲5齡第6天和吐絲期的家蠶胸節(jié)表皮、脂肪體及翅原基的翅囊和翅芽等組織中都有表達(dá)，其中在胸節(jié)表皮、脂肪體和翅原基的翅囊等組織部位的表達(dá)量較高，在翅原基的翅芽部位的表達(dá)量較低(圖6A、B)；BmMet2蛋白在預(yù)蛹期的家蠶胸節(jié)表皮、脂肪體及翅原基的翅芽等組織中也有表達(dá)，但在翅芽部位的表達(dá)量高于幼蟲5齡第6天和吐絲期的(圖6C)?？傮w來看，BmMet2蛋白在這3個(gè)時(shí)期都有較高的表達(dá)水平，且表達(dá)趨勢與Western blotting檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)趨勢基本吻合。

圖6 BmMet2蛋白在不同發(fā)育時(shí)期和組織中的免疫組織化學(xué)定位分析

3 討論與結(jié)論

昆蟲的變態(tài)發(fā)育主要由20E和JH通路協(xié)同調(diào)控的。目前，關(guān)于20E是如何調(diào)控昆蟲蛻皮、變態(tài)的分子機(jī)制已比較清楚[16]，而JH調(diào)控昆蟲生長發(fā)育的分子機(jī)制還不是很明確，尤其是其受體和下游調(diào)控基因的鑒定較少。Met基因具有典型的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，果蠅DmMet可以與JH主要種類(JHIII)特異性結(jié)合，并具有很高的親和力。在赤擬谷盜中，RNAi干擾TcMet的表達(dá)，使得赤擬谷盜幼蟲無法響應(yīng)JH的調(diào)控，并導(dǎo)致了幼蟲的早熟變態(tài)[7,12]，在家蠶中亦有研究表明JH通過與Met和SRC形成復(fù)合體，調(diào)控JH初級應(yīng)答因子Kr-h1的轉(zhuǎn)錄[9]。表明Met可能是JH的受體，并在JH通路中起重要的調(diào)控作用。

為了進(jìn)一步研究BmMet在家蠶生長發(fā)育過程中的作用，本文對BmMet2蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，用qRT-PCR檢測了BmMet2在家蠶翅原基組織中的表達(dá)情況及其對昆蟲激素的響應(yīng)情況；克隆表達(dá)了BmMet2中能與DNA結(jié)合的蛋白區(qū)域BmMet2DBD；制備了可特異性識別BmMet2的抗體，利用該抗體進(jìn)行Western blotting和免疫組化實(shí)驗(yàn)，檢測了BmMet2在家蠶各個(gè)組織各個(gè)時(shí)期中的定位表達(dá)情況。主要結(jié)論如下：

(1)蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示：BmMet2屬于bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子，含有可與DNA結(jié)合的bHLH、可與蛋白互作的PAS及PAC結(jié)構(gòu)域。此結(jié)果與黑腹果蠅的Dmgce與DmMet都含有bHLH和PAS結(jié)構(gòu)域的結(jié)論[6,17]一致。在埃及伊蚊和赤擬谷盜等昆蟲基因組中也鑒定出Met相應(yīng)的同源基因，發(fā)現(xiàn)這些基因都含有典型的bHLH-PAS結(jié)構(gòu)[7]，說明Met在不同昆蟲中的功能可能是比較一致的。果蠅Met和gce可以相互結(jié)合形成Met-Met和Met-gce同源或異源二聚體[8]，這些結(jié)果暗示BmMet2可能以同源或異源二聚體的形式參與調(diào)控靶基因的表達(dá)。

(2)在翅原基中，BmMet2在5齡第3天和5齡第6天有較高水平的表達(dá)，隨后表達(dá)量降低，其表達(dá)模式與家蠶5齡幼蟲發(fā)育過程中JH的滴度相吻合[18]，且家蠶5齡時(shí)期翅原基的發(fā)育主要受JH的調(diào)控[15]，暗示BmMet2參與了5齡幼蟲的發(fā)育過程，并對翅原基的發(fā)育有重要的作用。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)BmMet2蛋白在5齡第6天、吐絲期和預(yù)蛹期的家蠶胸節(jié)表皮、脂肪體及翅原基的翅囊和翅芽等組織中都有較高表達(dá)。游走期和預(yù)蛹期是家蠶變態(tài)發(fā)育的重要時(shí)期，BmMet2在這2個(gè)時(shí)期的高表達(dá)說明其很可能是參與調(diào)控家蠶變態(tài)發(fā)育的重要的轉(zhuǎn)錄因子。

(3)進(jìn)一步激素處理結(jié)果表明BmMet2可能參與了JH對翅發(fā)育的調(diào)控，在20E和JH的信號通路過程中發(fā)揮作用：BmMet2的表達(dá)受到昆蟲激素Methoprene和20E的誘導(dǎo)，Methoprene的誘導(dǎo)作用比20E的作用更為明顯；2種激素均在注射2 h內(nèi)誘導(dǎo)基因表達(dá)的上調(diào)。RIDDIFORD[19]的研究表明Met與FKBP39、Chd64相互作用,并結(jié)合于JH應(yīng)答元件(JHRE)上，從而誘導(dǎo)JH應(yīng)答基因的大量表達(dá)，并與20E誘導(dǎo)的基因一起調(diào)控昆蟲的幼蟲蛻皮。LI等[20]在研究果蠅時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)僅存在20E時(shí)，Met可與EcR-USP受體二聚體相互作用形成復(fù)合物，然后結(jié)合于20E的反應(yīng)元件上，調(diào)控20E所誘導(dǎo)的靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這些前期研究結(jié)果與本文得到的2種激素均能誘導(dǎo)BmMet2表達(dá)的結(jié)果相一致，表明20E受體二聚體EcR-USP和JH受體Met在20E和JH的協(xié)同作用中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用。Met通過JH和20E信號通路調(diào)控著昆蟲的生長發(fā)育，但其具體的分子作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本文對轉(zhuǎn)錄因子BmMet2的研究有助于闡述昆蟲變態(tài)發(fā)育的過程，也有助于完善昆蟲激素對翅原基發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制。