胡啟豪, 劉學術, 馬 瓊, 馮啟理, 鄧惠敏

(華南師范大學生命科學學院，廣州市昆蟲發(fā)育調控與應用重點實驗室， 廣州 510631)

保幼激素和蛻皮激素對家蠶翅原基生長分化的影響

胡啟豪, 劉學術, 馬 瓊, 馮啟理, 鄧惠敏*

(華南師范大學生命科學學院，廣州市昆蟲發(fā)育調控與應用重點實驗室， 廣州 510631)

文中以家蠶翅原基為材料，通過制做離體石蠟切片的方法觀察了翅原基從五齡幼蟲第3天至蛹期0天的形態(tài)變化，并通過注射外源蛻皮激素活性物質20E和保幼激素類似物Methoprene探究了昆蟲激素對家蠶翅原基生長分化的影響. 結果顯示，翅原基在幼蟲階段發(fā)育緩慢，從五齡幼蟲第6天起生長分化逐漸加快，且翅原基的形態(tài)發(fā)生了顯著變化，原本附著于翅原基腔口處且呈團狀的造血器官逐漸分散至消失，而由氣管組成的翅脈逐漸形成. 外源激素處理結果顯示，2 μg的20E可促進翅原基的生長分化，而2 μg 的Methoprene抑制了翅原基的生長分化. 上述結果說明蛻皮激素和保幼激素共同調控了翅原基的生長分化，并最終實現了翅原基的變態(tài)發(fā)育.

家蠶； 翅原基； 生長分化； 蛻皮激素； 保幼激素

完全變態(tài)昆蟲一生經歷了卵、幼蟲、蛹及成蟲的過程. 其中，昆蟲的蛻皮和變態(tài)的過程由體內保幼激素(Juvenile Hormone, JH)和蛻皮激素(Ecdysteroids, Ecd) 共同調控，目前已發(fā)現至少存在7種天然的JH，其中JHⅢ是所有昆蟲中都存在的JH類型，此外，也發(fā)現蛻皮激素的活性成分為20-羥基蛻皮酮(20-Hydroxyecdysone，20E). 昆蟲變態(tài)發(fā)育的機制是當今的研究熱點. 家蠶(B.mori)為鱗翅目模式昆蟲，且蠶絲用于絲綢生產，因此研究家蠶變態(tài)發(fā)育的機理有著重要的經濟價值和理論意義.

翅原基是完全變態(tài)昆蟲的成蟲盤之一，位于家蠶的第2和第3胸節(jié)的左右兩側，前一對翅原基較大，呈三角形，后一對翅原基較小，呈圓形，分別發(fā)育成成蟲的前后翅[1]. 在翅原基生長分化過程中，一系列基因的時空特異性表達起著關鍵性作用[2]. 研究顯示，家蠶翅原基在四齡幼蟲末期和五齡幼蟲初期對保幼激素的敏感性降低，且隨著JH的減少，20E起主要作用，翅原基逐漸向成蟲翅發(fā)育分化[3-4]. 在煙草天蛾中，當JH存在時，翅原基的生長分化會被暫時抑制[5]，而在化蛹階段，由于JH濃度的下降，翅原基可以繼續(xù)生長分化[6]. 此外，FRISTROM等[7]發(fā)現在體外培養(yǎng)的條件下，20E能夠誘導成蟲盤的分化. 因此，翅原基的發(fā)育可能受到JH和20E的共同調控.

為了進一步探究家蠶翅原基在發(fā)育過程中的形態(tài)變化及激素對其的調控，我們通過分離翅原基并制作石蠟切片，對五齡幼蟲第3天至蛹期0天家蠶翅原基的生長分化進行觀察，利用HPLC測定不同發(fā)育時期內源激素的變化情況，并通過注射外源激素，進一步分析激素對家蠶翅原基發(fā)育的影響. 該研究可為進一步探究昆蟲翅發(fā)育的分子機理提供理論依據和思路.

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

所用的家蠶(B.mori)品種為大造，蠶卵由廣東省蠶業(yè)研究所提供. 幼蟲在溫度(26±1) ℃，相對濕度65%～75%，光周期12 h∶12 h (光∶暗)的培養(yǎng)箱中用新鮮采摘的桑葉(采摘自華南農業(yè)大學蠶學桑園實習基地)飼養(yǎng).

蛻皮激素活性物質(20-Hydroxyecdysone，20E)和JH類似物(正法呢烯酸甲酯,Methoprene)均購自Sigma 公司. 磷酸緩沖液(Phosphate Buffer Saline,PBS).

1.2 家蠶翅原基的分離及觀察

分別將五齡幼蟲第3天至蛹期0天的家蠶置于冰上冷凍休克，然后在裝有PBS的蠟盤里解剖. 從第2和第3胸節(jié)處分離出翅原基. 于解剖鏡下觀察其形態(tài)結構.

1.3 離體家蠶翅原基石蠟切片制作

五齡幼蟲第3天至第6天的家蠶按上述方法分離翅原基并放入4%多聚甲醛固定. 將上簇1天至蛹期0天的家蠶置于冰上凍至休克，于頭部注射4%多聚甲醛固定液，放入4%多聚甲醛固定1 h后截取第2和3胸節(jié)，再放進4%多聚甲醇固定過夜. 將上述樣品用PBS洗3次，每次5 min. 然后分別用50%、70%、85%、95%及100%的乙醇脫水，每次1 h，再用100%二甲苯透明. 將上述處理的翅原基組織觀察樣本于60 ℃ 石蠟中滲蠟2 h. 將熔化的石蠟與組織放進包埋架，調整好位置，待石蠟凝固后放進4 ℃冷卻. 取出蠟塊于切片機切片.

1.4 石蠟切片蘇木精-伊紅(H.E)染色

將上述切片于二甲苯中脫蠟2次，每次5 min. 再移入二甲苯和純酒精(1∶1)混合液中洗滌5 min. 將樣品分別置于100%、95%、90%、80%、70%及50%酒精中復水5 min. 蘇木精染液染色15 min. 1%鹽酸酒精分色. 將分色后樣品置于1%氨水中藍化，使細胞核呈藍色. 蒸餾水短洗，0.5%伊紅染液染色1 min. 依次經70%、80%、90%、95%及100%酒精脫水5 min. 將樣品置于二甲苯和純酒精體積比為1∶1的混合液中洗滌5 min. 再于二甲苯透明2次，每次5 min. 去除多余的二甲苯，滴加適量中性樹膠，再加蓋玻片封固. 于倒置顯微鏡下觀察.

1.5 HPLC測定血淋巴中的20E和JHⅢ濃度

選取不同發(fā)育時期的家蠶，用解剖剪剪開蟲體的末端腹足，讓血淋巴液滲出，用離心管收集，12 000 r/min離心5 min，去除細胞碎片和其他雜質，所有操作均在冰上進行. 每個時期取材3份，參考錢明惠等方法[8]提取20E和JHⅢ由于JHⅢ在所有昆蟲中都普遍存在，因此，本研究主要測定JHⅢ的含量，并利用反相HPLC方法測定其濃度. 實驗重復3次.

1.6 昆蟲激素對翅原基生長分化的影響

選取五齡幼蟲第4天，生長狀況基本一致的家蠶幼蟲，在其第2與第3胸節(jié)處分別注射4 μL不同質量濃度的JH類似物Methoprene和蛻皮激素活性物質20E(質量濃度分別為0.5 μg/μL和1.0 μg/μL)，以注射等量0.1%DMSO 作為空白對照組. 于注射后48 h和96 h后取出翅原基，觀察翅原基形態(tài)和大小變化，計算和統(tǒng)計翅原基面積. 每條蠶都有2對翅原基，為減少計算誤差，在分離翅原基時，均取前一對翅原基. 每個時間點和濃度6個重復，實驗重復3次. 應用Graphpad Prism 5統(tǒng)計分析軟件，采用ANOVA(多個處理間的兩兩比較)或t檢測(兩個樣品間比較)進行差異性分析.

2 結果與分析

2.1 家蠶五齡幼蟲翅原基和蛹期翅芽形態(tài)的變化

為觀察家蠶翅原基在發(fā)育過程中的形態(tài)變化，首先對不同發(fā)育時期的翅原基進行觀察. 結果顯示五齡幼蟲第3天(L5D3，圖1A)、五齡幼蟲第4天(L5D4，圖1B)、五齡幼蟲第5天(L5D5，圖1C)、五齡幼蟲第6天(L5D6，圖1D)、游走期第1天(WD1，圖1E)及游走期第2天(WD2，圖1F)翅原基的形態(tài)和面積變化不大，生長相對緩慢；預蛹期(PP，圖1G)和蛹期第0天(PD0，圖1H)的翅原基面積明顯增大，生長相對較快. 此外，從五齡幼蟲第6天(L5D6，圖1D)開始，翅原基的形態(tài)發(fā)生了顯著的變化. 原本附著于翅原基腔口處，呈團狀的造血器官逐漸分散至消失，氣管組成的翅脈開始逐漸形成(圖1D～G). 預蛹期的翅牙被保護在表皮下面，翅脈已經硬化，出現了鱗毛和花紋(圖1H). 翅原基在幼蟲期的大小和形態(tài)都未發(fā)生明顯的變化，但在預蛹期，其大小和形態(tài)都發(fā)生了顯著的改變. 而昆蟲的變態(tài)發(fā)育主要受到體內JH和20E的協同調控，因此昆蟲激素可能參與了翅原基的生長分化.

A：L5D3；B：L5D4；C：L5D5；D：L5D6；E：WD1；F：WD2；G：PP ； H：P0;L：幼蟲齡期；D：天；W：游走期； PP ：預蛹期；P：蛹期

2.2 翅原基發(fā)育過程的切片觀察

為進一步研究家蠶翅原基的發(fā)育過程，將五齡幼蟲第3天(L5D3，圖2A)、五齡幼蟲第4天(L5D4，圖2B)、五齡幼蟲第5天(L5D5，圖2C)和五齡幼蟲第6天(L5D6，圖2D)的翅原基制作成石蠟切片進行觀察. 由于家蠶進入游走期后，翅原基組織會發(fā)生外翻等事件，為了不破壞翅原基各組織部位的相對位置變化并使正在消失的翅囊能夠顯示出來，對游走期及之后的時期采用整蟲切片法觀察翅原基組織結構(圖2E～H). 結果顯示，五齡幼蟲第3天至第6天翅原基的翅囊包裹在翅芽外周，翅芽是該時期翅原基的主要部分. 翅芽中的空隙稱作翅腔，氣管位于翅腔中. 這段時期內翅原基處除體積稍有變大外，其形態(tài)結構和各組織相對位置沒有較大的變化. 到了游走期第0天(WD0,圖2E)、游走期第1天(WD1，圖2F)、游走期第2天(WD2，圖2G)和蛹期0天(PD0，圖2H)，除了面積顯著增大外，翅原基細胞團逐漸展開，形成成型的蛹翅. 這時候包被翅芽的翅囊逐漸消失，其中的造血器官也逐漸消失. 這表示在進入游走期后，尤其是在游走期第1天(WD1，圖2F)和游走期第2天(WD2，圖2G)，翅囊和造血器官等部位很可能發(fā)生細胞死亡事件，導致翅原基該部分結構退化. 翅原基在這段時期發(fā)生顯著變化，進一步說明其發(fā)育可能受昆蟲激素的調控.

2.3 家蠶不同發(fā)育時期血淋巴中20E和JHⅢ的含量

通過觀察翅原基在不同時期的生長狀況，發(fā)現家蠶翅原基的生長分化可能受到JH和20E的調控. 結果顯示，20E含量在五齡幼蟲期較低，在游走期(W期)至吐絲期(S期)第2天(S36H)含量升高. 其中，20E含量進入游走期(W0H)出現小峰，該峰的作用可能為啟動化蛹[9]；在吐絲36 h(S36H)左右20E含量達到高峰，該峰的作用可能引起蛻皮化蛹；在蛹期第2天(PD2)又出現一個高峰，該峰可能啟動蛹期向成蟲的轉變. 20E含量的變化趨勢與翅原基生長分化趨勢是相近. JHⅢ在五齡第1天(L5D5)的含量較高，從五齡幼蟲第2天(L5D2)至第6天(L5D6)之間JHⅢ含量逐步降低，進入游走期(W期)后JHⅢ開始稍微上升，到吐絲第2天(S48H)JHⅢ水平達到最高，隨后降低(圖3). 由此，我們推測，在五齡幼蟲初期高含量的JHⅢ 抑制翅原基發(fā)育，使翅原基維持幼蟲狀態(tài)；在五齡幼蟲末期，JHⅢ 含量降低，同時20E含量升高，翅原基迅速進行生長分化.

A：L5D3；B：L5D4；C：L5D5；D：L5D6；E：WD0；F：WD1；G：WD2；H：PD0;L：幼蟲齡期；D：天；W：游走期；P：蛹期

L：幼蟲齡期；D：天；W：游走期；S ：吐絲期；P：蛹期

2.4 蛻皮和保幼激素對翅原基生長分化的影響

為進一步探究激素是否調控翅原基的生長分化，對五齡幼蟲第4天的家蠶分別注射2 μg和4 μg JH類似物Methoprene與20E，并以等量的0.1%DMSO為對照，于注射后48 h和96 h分離翅原基，觀察翅原基的形態(tài)和面積變化，并對翅面積進行統(tǒng)計分析，結果顯示，與對照(圖4A,F和圖5A)相比，2 μg 的JH類似物Methoprene處理48 h和96 h后的翅原基面積顯著變小(圖4B,J和圖5A)，而2 μg的20E處理后的翅原基面積顯著增大，且翅脈分化顯著(圖4D,I和圖5A)，這表示JH可抑制翅原基的生長分化，而20E則對翅原基的生長分化起促進作用. 但4 μg的Methoprene或20E處理對翅原基形態(tài)和面積的影響沒有2 μg處理的效果明顯(圖4和圖5B)，這表示了JH和20E可調控翅原基的生長分化，但具有最佳使用劑量.

3 討論

翅原基是昆蟲體內成蟲原基的一種，經生長發(fā)育后最終形成成蟲的翅. 翅原基發(fā)育分化與昆蟲個體生長發(fā)育緊密聯系，研究翅原基的發(fā)育有助闡述昆蟲的個體發(fā)育過程.

本文通過觀察翅原基在不同時期的形態(tài)發(fā)現，家蠶翅原基在五齡幼蟲初期生長緩慢，在五齡末期開始迅速生長. 此外，從五齡幼蟲第6天開始，翅原基造血器官逐漸消失并開始形成翅脈. 家蠶造血器官在蠶體的保衛(wèi)作用和損傷修復中起關鍵作用，且在變態(tài)過程中可分解不需要的組織和器官[10]. 張健等[11]發(fā)現，翅原基造血細胞在五齡初期有大量增加，其作用可能是消除不需要的幼蟲組織細胞. 因此作者推測，在變態(tài)發(fā)育階段，造血器官完成自身功能后，開始退化，為形成翅脈等成蟲所需的組織做準備.

激素處理家蠶實驗發(fā)現，JH可抑制翅原基的生長分化，而20E可促進翅原基的生長分化. 有研究顯示，在家蠶幼蟲期用JH或JH類似物Methoprene處理，可引起幼蟲額外蛻皮而產生超齡幼蟲[12]，在赤擬谷盜中也有相似的情況[13]. 因此，作者推測在幼蟲中，高質量濃度的JH抑制了翅原基的生長分化，使其維持幼蟲狀態(tài)，到了幼蟲末期，JH質量濃度下降，高質量濃度的20E促進翅原基發(fā)育，有助于變態(tài)過程的完成.

JH和20E對翅原基發(fā)育的調控通過一個復雜而系統(tǒng)的調控網絡進行的. DENG等[14-15]發(fā)現，翅原基表皮蛋白基因BmWCP4主要在預蛹和蛹中期的表皮中表達，是翅原基生長分化的關鍵因子，20E通過誘導轉錄因子BmPOUM2與BmFTZ-F1的表達進而激活了BmWCP4的表達，而JH則可抑制該過程的發(fā)生. 但是，JH和20E對翅原基發(fā)育的精細調控，仍需進一步的研究.

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【中文責編：成文 編輯助理：冷佳奕 英文審校：李海航】

Effects of Javenile Hormone and Ecdystuoids on the Development of Wing Disc in Silkworm,Bombyxmori

HU Qihao， LIU Xueshu, MA Qiong， FENG Qili， DENG Huimin*

(Guangzhou Key Laboratory of Development Regulation and Application Research of Insects, School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

The morphology of wing discs from day 3 of 5thlarval instar to day 0 of pupa was observed by separated wing disc and the paraffin sections. To determine whether the growth and differentiation of wing discs were regulated by insect hormone,ecdysone 20E and juvenile hormone analogue Methoprene were injected into the silkworm at day 3 of 5thlarval instar separately. The results showed that the wing discs grew slowly at larval stage but grew quickly from day 6 of 5thlarval instar. What’s more, the morphology and structure of wing discs changed significantly. The hematopoietic organ degraded gradually and the veins formed finally. The development and differentiation of the wing discs were positively regulated by the certain dose of 20E and negatively regulated by Methoprene. The above results indicated that ecdysone and juvenile hormone regulated the growth and differentiation of wing discs, resulted in the metamorphosis of wing discs.

Bombyxmori; wing disc; growth and differentiation; ecdysone; juvenile hormone

2016-05-12 《華南師范大學學報(自然科學版)》網址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國家自然科學基金項目(31330071，31301918)

K826.15

A

1000-5463(2017)04-0062-06

*通訊作者:鄧惠敏，副教授，Email：denghuiminmin@163.com.