PCR儀溫度過沖特性有限元仿真研究

張 辰， 孫繼賢， 梁曉會(huì)， 魏名山， 田 冉，江 斌， 李 征， 范志永

(1. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院科研保障中心，北京 100850; 2. 北京理工大學(xué)機(jī)械與車輛學(xué)院，北京 100081;3. 北京林電偉業(yè)電子技術(shù)有限公司，北京 100097; 4. 公安部第一研究所，北京 102200)

0 引 言

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)[1-2]。PCR的基本步驟分為3步：變性（95 ℃）、退火（55 ℃）和延伸（72 ℃）[3]。經(jīng)過3個(gè)步驟的不斷循環(huán)，PCR技術(shù)可以將微量的DNA片段擴(kuò)增至初始的數(shù)百萬(wàn)倍。因具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快速、純度要求低等特點(diǎn)，PCR技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[4-5]。

PCR儀是實(shí)施PCR技術(shù)的設(shè)備載體[6]。它通過控制半導(dǎo)體制冷片（thermal electric cooler，TEC）的輸入電流，實(shí)現(xiàn)TEC周期性吸熱與放熱，令反應(yīng)樣品溫度達(dá)到PCR步驟所需溫度并保持一段時(shí)間，從而保證3個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)步驟的循環(huán)[7]。在實(shí)際過程中，針對(duì)TEC的控制大多基于PID調(diào)節(jié)，故在升/降溫的終止時(shí)刻，常常出現(xiàn)溫度控制超調(diào)現(xiàn)象，亦稱為溫度過沖現(xiàn)象[8]。有限的溫度過沖有利于試液的快速變溫，而過量的溫度過沖會(huì)導(dǎo)致試液中聚合酶失活等嚴(yán)重后果[9]。由此可見，PCR儀的溫度過沖特性對(duì)DNA片段擴(kuò)增效果有重要影響。

目前針對(duì)PCR儀的研究大多集中在溫度控制算法方面，有關(guān)其傳熱特性僅有少數(shù)學(xué)者開展過研究。黃靖等[10-11]運(yùn)用ABAQUS有限元軟件仿真研究了TEC匹配差異、導(dǎo)熱膠厚度不均和四周空氣對(duì)流散熱3種因素對(duì)96孔PCR儀溫度均勻性的影響。其結(jié)論表明，通過匹配TEC、采取隔熱或熱補(bǔ)償?shù)拇胧?，可以有效改善PCR儀96孔基座的溫度均勻性。毛賀[12]運(yùn)用數(shù)學(xué)插值方法對(duì)基座孔和試液的溫度時(shí)變曲線進(jìn)行六次多項(xiàng)式擬合，對(duì)試液溫度延遲現(xiàn)象進(jìn)行了數(shù)學(xué)描述，以預(yù)估某PCR儀反映試液的升/降溫情況。然而，對(duì)PCR儀溫度過沖現(xiàn)象的研究卻鮮有報(bào)道。

本文針對(duì)PCR儀反應(yīng)試液溫度難以估計(jì)的問題，分析了某型號(hào)PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及傳熱機(jī)理，構(gòu)建了PCR儀單孔仿真模型，探究了在50 μL試液量下溫度過沖特性對(duì)試液溫度的影響規(guī)律。在此基礎(chǔ)上，分析了在不同試液量下（10，20，25，50，100 μL）PCR反應(yīng)試液溫度的差異性，為PCR儀的設(shè)計(jì)及優(yōu)化提供研究基礎(chǔ)。

1 PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

典型的PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)如圖1所示。系統(tǒng)由6片基于帕爾貼效應(yīng)的TEC串聯(lián)連接，實(shí)現(xiàn)溫度升降[13]。系統(tǒng)的溫控對(duì)象為TEC上方的96（8×12）孔紫銅基座以及反應(yīng)試液?；系染嗖加兄睆綖?.5 mm的深孔，以供裝有反應(yīng)試液的試管嵌入其中。孔間挖有一定深度的凹槽單元，以減小基座的熱容，提高溫變響應(yīng)速率。試管上端與恒溫105 ℃的熱蓋相接觸，避免了高溫蒸發(fā)后的試液冷凝于試管頂部。TEC下端為散熱器，上下兩端接觸面均涂有0.05 mm厚的導(dǎo)熱硅脂。散熱器下方安裝有冷卻風(fēng)扇，以對(duì)散熱器進(jìn)行強(qiáng)制對(duì)流換熱。

圖1 PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖

2 PCR儀傳熱機(jī)理及數(shù)學(xué)模型

PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)主要依靠熱傳導(dǎo)實(shí)現(xiàn)其功用。TEC上表面吸收或釋放熱量給導(dǎo)熱硅脂薄層，之后熱量傳至金屬基座，基座再將熱量傳遞至試管，進(jìn)而傳遞至反應(yīng)試液。試管頂部的熱蓋在PCR反應(yīng)過程中一直維持較高溫度，但因試管導(dǎo)熱系數(shù)很小，其對(duì)試液溫度的影響可以忽略。此外，試管與基座之間存在狹小空氣間隙，會(huì)對(duì)熱傳遞起到阻礙作用，將其等效為接觸熱阻[14]。這些熱傳導(dǎo)過程均可用無(wú)內(nèi)熱源的非穩(wěn)態(tài)導(dǎo)熱微分方程進(jìn)行描述[15]：

式中：λ——微元體導(dǎo)熱系數(shù)，W/(m·K)；

ρ——微元體密度，kg/m3；

c——微元體比熱容，J/(kg·K)。

TEC在升/降溫時(shí)釋放/吸收的熱量值可分別用下式描述[16]：

式中：Qh/Qc——升/降溫時(shí)TEC釋放/吸收的熱量值，J；

th/tc? 升/降溫時(shí)TEC與基座接觸面的溫度值，K；

αn/αp——TEC中N、P型半導(dǎo)體的塞貝克系數(shù)；

I——工作時(shí)通過TEC的電流值，A；

λ——TEC 導(dǎo)熱系數(shù)，W/(m·K)；

Δt——冷熱面溫差，K。

基座四周以及各試管間均存在較大的空氣間隙，從而受到空氣自然對(duì)流換熱的影響。這一影響因素屬于加載第三類邊界條件的非穩(wěn)態(tài)導(dǎo)熱，可用下式進(jìn)行描述：

式中：h ——流體的對(duì)流換熱系數(shù)，W/(m2·K)；

tw——壁面溫度，K；

tf——流體溫度，K。

3 PCR儀仿真方法及試驗(yàn)驗(yàn)證

3.1 仿真模型的建立

PCR儀熱循環(huán)模塊幾何模型復(fù)雜，適合采用有限元數(shù)值方法進(jìn)行研究。雖然PCR儀基座各孔存在一定的溫差，但由于其溫差較小，各孔之間的熱傳導(dǎo)可以忽略。所以，為簡(jiǎn)化仿真難度并集中研究溫度過沖特性的影響，本文假設(shè)基座各孔溫度均勻，僅針對(duì)單孔的反應(yīng)模型進(jìn)行研究，如圖2所示。其中，試管內(nèi)反應(yīng)試液為50 μL，其余幾何結(jié)構(gòu)與整體熱循環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)保持一致。采用ANSYS-Meshing對(duì)幾何模型和反應(yīng)試液進(jìn)行網(wǎng)格劃分，全局網(wǎng)格尺寸設(shè)置為0.4 mm，空氣及試液區(qū)域網(wǎng)格設(shè)置為0.8 mm，以減小總體網(wǎng)格數(shù)量。網(wǎng)格類型均為四面體網(wǎng)格。劃分網(wǎng)格之后的節(jié)點(diǎn)數(shù)為33385，網(wǎng)格數(shù)為115642，反映網(wǎng)格質(zhì)量的skewness值最大為0.709，平均為0.241，網(wǎng)格質(zhì)量良好。網(wǎng)格劃分結(jié)果如圖3所示。

圖2 PCR儀單孔三維模型及結(jié)構(gòu)示意圖

圖3 單孔模型網(wǎng)格劃分

本文采用Fluent軟件完成相關(guān)數(shù)值計(jì)算。針對(duì)PCR儀瞬態(tài)傳熱問題，采用瞬態(tài)求解器，并激活能量方程。各區(qū)域材料對(duì)應(yīng)的熱物性參數(shù)如表1所示。單孔模型忽略了不同孔之間的溫差以及基座四周空氣對(duì)流換熱對(duì)模型的影響，進(jìn)而可以只考慮下邊界TEC和上邊界熱蓋，將其他邊界設(shè)置為絕熱壁面。 PCR單孔模型的上下表面分別與熱蓋、TEC直接接觸。根據(jù)儀器特性，上表面溫度邊界設(shè)為105 ℃，并保持恒定，同時(shí)依照規(guī)范 JJF 1527—2015中PCR儀溫度控制程序標(biāo)準(zhǔn)程序表的前3個(gè)步驟（表2）設(shè)計(jì)具有不同溫度過沖量的溫度控制曲線作為下表面的溫度邊界條件。此外，在基座與試管之間設(shè)置厚度為0.5 mm的空氣層，模擬微小氣隙。因反應(yīng)試液的量少且受熱較均勻，監(jiān)測(cè)試液的平均溫度作為試液的參考溫度。設(shè)置模型初始溫度為30 ℃，求解時(shí)間步長(zhǎng)為 0.1 s，最大迭代步為 40。

表1 單孔模型各區(qū)域的熱物性參數(shù)

表2 PCR儀溫控程序標(biāo)準(zhǔn)程序表（部分）

3.2 數(shù)值方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證PCR儀單孔三維仿真數(shù)值方法的準(zhǔn)確性，進(jìn)行PCR儀試液?jiǎn)慰诇y(cè)溫實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，構(gòu)建PCR儀單孔傳熱一維模型，與三維仿真結(jié)果進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證。

對(duì)于測(cè)溫實(shí)驗(yàn)（圖4），選擇經(jīng)校準(zhǔn)后的日本S3熱敏電阻作為測(cè)溫傳感器置于試管內(nèi)，該傳感器直徑為 1.3 mm，測(cè)溫范圍為–30～150 ℃，測(cè)量精度為0.01 ℃，動(dòng)態(tài)響應(yīng)時(shí)間為321 ms。將熱敏電阻連接溫度記錄器，并進(jìn)行多點(diǎn)修正，經(jīng)校準(zhǔn)后試驗(yàn)裝置最大誤差為0.03 ℃，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖4 PCR儀試液測(cè)溫實(shí)驗(yàn)裝置

采用AMESim軟件構(gòu)建PCR儀單孔傳熱一維仿真模型，如圖5所示。一維模型對(duì)各部分物體的幾何特征進(jìn)行了簡(jiǎn)化。除此之外，包括熱物性在內(nèi)的其他參數(shù)設(shè)置和三維模型保持一致。

圖5 PCR儀單孔傳熱一維模型

所測(cè)PCR儀設(shè)備的平均升溫速率為2.22 ℃/s，平均降溫速率為1.18 ℃/s，曲線的升/降溫梯度程序?yàn)?30 ℃—95 ℃—30 ℃，升溫平臺(tái)期維持 180 s，與表 2保持一致。通過測(cè)溫傳感器測(cè)得試液溫度的變化規(guī)律。同時(shí)，將設(shè)備的實(shí)際溫控曲線作為溫度邊界條件加載至三維模型下表面與一維模型熱源處，仿真求解獲得試液溫度。圖6為實(shí)驗(yàn)與仿真得到的試液溫度變化對(duì)比結(jié)果。

圖6 試液溫度變化對(duì)比曲線

由圖可知，仿真的溫度監(jiān)測(cè)點(diǎn)位置與實(shí)驗(yàn)溫度傳感器放置位置保持相同的情況下，加載同一溫控曲線時(shí)，三維仿真得到的試液溫度較一維仿真更貼合于實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一維仿真不能表征復(fù)雜的三維幾何結(jié)構(gòu)，是導(dǎo)致仿真誤差增大的主要原因。由此證明三維仿真方法更可靠，且可以基于此三維模型進(jìn)行溫度過沖的進(jìn)一步研究。

4 溫度過沖量對(duì)試液溫度影響分析

依據(jù)表2的程序以及設(shè)備的平均升/降溫速率，設(shè)計(jì)不同升/降溫過沖量的TEC溫度控制曲線（圖7）。其中，曲線T0至T5表示溫度過沖量的范圍從0 ℃依次增加到5 ℃，溫度間隔為1 ℃。

圖7 不同溫度過沖量的溫度控制曲線

圖8為T0～T5六種溫度輸入下試液平均溫度經(jīng)升/降溫后首次到達(dá)平臺(tái)期溫度±0.5 ℃時(shí)所需時(shí)間趨勢(shì)線。其中縱坐標(biāo)時(shí)間從開始升溫與降溫時(shí)刻算起。由圖可知，隨著溫度過沖量由0 ℃增加至5 ℃，試液的升/降溫所需時(shí)間分別縮短了13.7 s與10.7 s。此外，在試液從沒有過沖調(diào)整至過沖1 ℃時(shí)，試液升溫時(shí)間縮短了 4.3 s，降溫時(shí)間縮短了 4.6 s；若將過沖4 ℃調(diào)整至過沖5 ℃，試液升溫時(shí)間縮短了1.4 s，降溫時(shí)間則只縮短了0.5 s。由此說(shuō)明增加溫度過沖量與縮短試液升/降溫時(shí)間之間的關(guān)系并不是線性的，試液升/降溫時(shí)間的改善效果會(huì)隨著溫度過沖量的增大而不斷減小。

圖8 試液升/降溫所需時(shí)間曲線

圖9反映了試液升/降溫過沖量隨T0～T5六種溫度輸入的變化規(guī)律，其中縱坐標(biāo)代表不同的溫度過沖量。由圖可知，對(duì)于50 μL 試液量，溫控曲線升溫過沖不大于3 ℃，降溫過沖不大于1 ℃時(shí)，試液不會(huì)出現(xiàn)溫度過沖現(xiàn)象。此時(shí)對(duì)試液來(lái)說(shuō)只是增加了升/降溫速率，是較為理想的情況。當(dāng)溫控曲線過沖量大于3 ℃時(shí)，試液升溫與降溫均會(huì)出現(xiàn)較小的溫度過沖，這可能導(dǎo)致試液中聚合酶高溫失活，嚴(yán)重影響基因擴(kuò)增循環(huán)，是需要避免的。此外，試液降溫時(shí)的溫度過沖現(xiàn)象比升溫時(shí)更顯著，原因是TEC的制冷速率慢于制熱速率。這會(huì)導(dǎo)致試液降溫所需時(shí)間變長(zhǎng)，從而受冷更充分，易產(chǎn)生溫度過沖。

圖9 不同溫度輸入對(duì)試液溫度過沖量的影響

5 不同試液量的溫度差異性分析

為了探究PCR試管內(nèi)反應(yīng)試液量對(duì)試液平均溫度變化的影響，選取 10，20，25，50，100 μL 5種不同試液量，對(duì)仿真模型下表面分別加載圖7中的T0溫控曲線（無(wú)過沖）和T3溫控曲線（最大過沖量為3 ℃），觀察試液溫度的變化情況。

圖10為不同試液量下的試液升/降溫時(shí)間曲線。由圖可知，對(duì)于各試液量而言，溫度過沖均會(huì)縮短其升/降溫所需時(shí)間，進(jìn)而延長(zhǎng)試液的實(shí)際平臺(tái)期，有利于擴(kuò)增反應(yīng)的充分進(jìn)行。無(wú)論儀器是否存在溫度過沖的情況，隨著試液量的不斷增加，試液升/降溫所需時(shí)間均會(huì)不斷增加。以無(wú)溫度過沖情況為例，在10 μL 試液量下，試液升/降溫分別需要 45 s和 68 s，而在 100 μL 下則分別需要 63.6 s和 84.5 s，與前者相差18.6 s和16.5 s。這說(shuō)明在同一溫控曲線下，試液量越多，試液實(shí)際平臺(tái)期的持續(xù)時(shí)間就會(huì)越短，這可能會(huì)導(dǎo)致試液進(jìn)行反應(yīng)的實(shí)際時(shí)間不足。

圖10 不同試液量的試液升/降溫時(shí)間曲線

圖11為不同試液量的試液升/降溫過沖量趨勢(shì)線。由圖可知，在加載相同溫度過沖量的溫控曲線時(shí)，不同試液量的試液會(huì)產(chǎn)生不同程度的溫度過沖。以溫度過沖量為 3 ℃ 的 T3曲線為例，10 μL 試液量在這一曲線下產(chǎn)生了1.09 ℃的升溫過沖量和1.67 ℃的降溫過沖量，而相同條件下100 μL 試液量的升溫與降溫均沒有出現(xiàn)溫度過沖現(xiàn)象。從實(shí)際應(yīng)用角度出發(fā)，針對(duì)PCR儀一般具有的block溫控（無(wú)溫度過沖）和tube溫控（存在溫度過沖）兩種溫控模式，建議儀器在反應(yīng)試液量低于50 μL時(shí)采用block溫控模式，50 μL及以上時(shí)采用tube溫控模式，且tube溫控模式下的最大溫度過沖量不應(yīng)超過3 ℃。

圖11 不同試液量的試液溫度過沖量曲線

6 結(jié)束語(yǔ)

本文分析了典型PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及傳熱原理，構(gòu)建了某型號(hào)PCR儀單孔三維傳熱模型，并通過試液測(cè)溫實(shí)驗(yàn)與一維仿真對(duì)比驗(yàn)證了數(shù)值方法的準(zhǔn)確性。對(duì)單孔模型的傳熱特性進(jìn)行了仿真分析，研究了溫度過沖現(xiàn)象對(duì)PCR反應(yīng)試液溫度的影響。在此基礎(chǔ)上，討論了在不同試液量下試液溫度的差異性。相關(guān)結(jié)論如下：

1）增大PCR儀溫控曲線的溫度過沖量會(huì)縮短試液的升/降溫時(shí)間，延長(zhǎng)試液實(shí)際平臺(tái)期，有利于反應(yīng)的充分進(jìn)行。

2）試液的溫度過沖量存在上限（在50 μL試液量下為3 ℃），若高于上限將可能導(dǎo)致試液實(shí)際溫度不理想，造成聚合酶失活等嚴(yán)重后果。

3）在同一溫控曲線下，試液量越多，試液實(shí)際平臺(tái)期的持續(xù)時(shí)間就會(huì)越短，且越不容易出現(xiàn)溫度過沖現(xiàn)象。

4）PCR反應(yīng)試液量低于50 μL時(shí)采用無(wú)過沖溫控模式，50 μL及以上時(shí)采用過沖溫控模式，將會(huì)取得更好的基因擴(kuò)增效果，且過沖溫控模式下的最大溫度過沖量不應(yīng)超過3 ℃。