楊益善 孫平勇 余木蘭

（1. 湖南雜交水稻研究中心，長(zhǎng)沙 410125；2. 三亞市國(guó)家耐鹽堿水稻技術(shù)創(chuàng)新中心，三亞 572024）

稻粒黑粉病是由Tilletia horrida引起的一種普遍發(fā)生的真菌性病害，也是一種重要的檢疫性病害。稻粒黑粉病主要發(fā)生于不育系，是雜交水稻繁殖、制種生產(chǎn)中的主要病害之一。我國(guó)雜交水稻繁殖、制種一般因稻粒黑粉病減產(chǎn)20%左右，重者可達(dá)50%以上，每年因該病導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失10-12億元［1］。為了提高雜交水稻的制繁種產(chǎn)量，育成的不育系柱頭外露率越來(lái)越高，稻粒黑粉病發(fā)生也呈加重趨勢(shì)?，F(xiàn)在生產(chǎn)上應(yīng)用的不育系絕大多數(shù)不抗稻粒黑粉?。?-3］，主要采用化學(xué)藥劑防治，不但增加制種成本，而且污染生態(tài)環(huán)境。發(fā)掘抗病基因、選育抗病不育系是防治稻粒黑粉病的綠色環(huán)保和高效的方法，對(duì)雜交水稻種子生產(chǎn)和種業(yè)發(fā)展具有重要意義。

稻粒黑粉病于1896年在日本首先發(fā)現(xiàn)［4］，其后國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼對(duì)其發(fā)病癥狀、病原菌生物學(xué)特性［5-6］、侵染機(jī)制［7-8］、影響發(fā)病的因素［9-11］以及防治方法［12-16］等開展了研究。稻粒黑粉病由菌絲在水稻開花時(shí)從柱頭侵染進(jìn)入子房而發(fā)病，病菌在無(wú)授粉的條件下就能侵入，但只在胚乳能正常發(fā)育的水稻子房中形成冬孢子而表現(xiàn)出黑粉癥狀［8］。稻粒黑粉病的發(fā)病程度存在品種間差異［2-3］，主要取決于水稻開花習(xí)性，穎花張開的時(shí)間越長(zhǎng)、張穎角度越大、柱頭外露率越高，越易感染病菌，與柱頭外露率、開穎時(shí)間呈極顯著正相關(guān)［17］。另外，適溫（28-30℃）高濕環(huán)境有利于病菌的繁殖和侵染［18］。

關(guān)于水稻對(duì)稻粒黑粉病抗性的遺傳和基因定位的報(bào)道很少。筆者在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)水稻光溫敏核不育系W9593S稻粒黑粉病發(fā)生較輕，而培矮64S稻粒黑粉病發(fā)生嚴(yán)重，且二者不育基因均來(lái)自農(nóng)墾58S。于是將二者雜交，構(gòu)建了重組自交系（RIL）遺傳群體，擬探討水稻對(duì)稻粒黑粉病抗性的遺傳規(guī)律，并定位稻粒黑粉病抗性基因，為基因克隆及建立水稻抗稻粒黑粉病分子育種技術(shù)體系打好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為光溫敏核不育系W9593S（對(duì)稻粒黑粉病抗性較強(qiáng)）、光溫敏不育系培矮64S（易感稻粒黑粉病、與W9593S不育基因等位）、培矮64S/W9593S高世代RIL群體183個(gè)株系。

1.2 方法

1.2.1 定位群體構(gòu)建 2006年冬以W9593S為父本與培矮64S雜交；2007年夏在長(zhǎng)沙種植F1，群體不育，割蔸再生收種；2008年夏在長(zhǎng)沙種植F2，群體表現(xiàn)不育，抽穗后割蔸再生，隨機(jī)取400株收取再生種子或帶不育禾蔸至海南繁種。以后每代每個(gè)株系隨機(jī)收取一個(gè)不育單株（種子或禾蔸），海南繁種時(shí)隨機(jī)取1株套袋自交，避免串粉混雜，期間注意剔除混雜株系。經(jīng)多年自交，最后構(gòu)建了由183個(gè)高世代穩(wěn)定光溫敏核不育系組成的RIL遺傳群體。

1.2.2 稻粒黑粉病抗性表型鑒定 RIL群體及其親本的稻粒黑粉病抗性表型鑒定分別于2015年夏在湖南雜交水稻研究中心長(zhǎng)沙本部試驗(yàn)基地和2020年夏在湖南雜交水稻研究中心長(zhǎng)沙春華試驗(yàn)基地進(jìn)行。2015年試驗(yàn)田為連續(xù)多年的雜交水稻制種田，常年稻粒黑粉病發(fā)生較重，田間菌源充足。2020年試驗(yàn)田處于新搬遷試驗(yàn)基地，已開展1年雜交水稻制種，稻粒黑粉病發(fā)生較輕。

由于RIL群體均為光溫敏核不育系，在育性敏感期高溫條件下自交不結(jié)實(shí)，不利于稻粒黑粉病發(fā)病，故表型鑒定田間試驗(yàn)參照雜交水稻制種田間布局模式，在RIL不育系兩邊栽插恢復(fù)系，結(jié)合人工趕粉，使RIL不育系能夠接受外源花粉而受精結(jié)實(shí)，為稻粒黑粉病發(fā)病提供有利條件。以雜交水稻恢復(fù)系R901為父本（提供花粉），RIL不育系及其2個(gè)親本為母本（接受花粉）。父本分3期分別于5月17日、5月24日、6月5日播種，預(yù)計(jì)始穗期分別為8月12日、8月18日和8月26日，確?？奢^長(zhǎng)時(shí)間不間斷提供花粉。RIL不育系根據(jù)播始?xì)v期長(zhǎng)短分批播種，將抽穗期安排在8月15-24日，處于父本花期中間。父母本移栽行比3∶8，每期父本插1行，母本每小區(qū)插40株（5行×8株），父母本株行距均為20 cm×20 cm。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。中高肥力管理，防蟲不防病，全生育期水層覆蓋，確保抽穗揚(yáng)花期田間處于高濕環(huán)境，抽穗揚(yáng)花期每天人工趕粉2-3次。母本種子成熟后，每小區(qū)去除與父本相鄰的邊行后，在中間取株葉形態(tài)一致、有代表性的5株，裝袋、掛牌，室內(nèi)風(fēng)干考種?？疾槊恐晁霐?shù)、每穗實(shí)粒數(shù)（受精粒數(shù)）、每穗黑粉病粒數(shù)，計(jì)算黑粉病粒率（病粒數(shù)/實(shí)粒數(shù)×100%）。將黑粉病粒率作為評(píng)價(jià)稻粒黑粉病抗性的主要指標(biāo)，黑粉病粒率越高，對(duì)稻粒黑粉病的抗性越弱。由于2020年試驗(yàn)在新基地進(jìn)行，父母本花期差異較大，加上抽穗揚(yáng)花期高溫干旱，較多不育系結(jié)實(shí)率很低，嚴(yán)重影響了病粒率結(jié)果的準(zhǔn)確性，故最終表型數(shù)據(jù)以2015年結(jié)果為準(zhǔn)。

1.2.3 分子標(biāo)記檢測(cè) 在種子成熟期取樣考種的同時(shí)，每個(gè)不育系在取樣的5個(gè)單株中選取1個(gè)代表性單株，摘取綠葉組織用于提取DNA。分子標(biāo)記檢測(cè)委托華智水稻生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。利用華智水稻生物技術(shù)有限公司與中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院聯(lián)合設(shè)計(jì)的56K水稻SNP基因芯片對(duì)親本培矮64S和W9593S進(jìn)行全基因組SNP掃描，篩選差異SNP位點(diǎn)，再?gòu)牟町愇稽c(diǎn)中選取親本間多態(tài)性明顯、均勻分布于水稻12條染色體上的200個(gè)SNP標(biāo)記，對(duì)RIL群體進(jìn)行基因型檢測(cè)。

1.2.4 QTL定位 結(jié)合RIL基因型和表型檢測(cè)結(jié)果，采用MAPMAKER 3.0作圖軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖；采用Windows QTL Cartographer 2.5軟件進(jìn)行復(fù)合區(qū)間作圖分析，確定QTL的位置及其對(duì)表型的貢獻(xiàn)率和加性效應(yīng)。將LOD值設(shè)置為2.5，檢測(cè)可能存在的QTL，遵循Mc等［19］提出的原則命名QTL。QTL定位實(shí)行分批檢測(cè)、逐步進(jìn)行，首批先用160個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)RIL群體進(jìn)行基因型分型和初步作圖分析，然后根據(jù)初步定位結(jié)果，在定位的QTL附近逐步加密分子標(biāo)記，縮小遺傳距離，提高定位的精確性。

2 結(jié)果

2.1 親本和RIL群體的稻粒黑粉病抗性

試驗(yàn)田整體發(fā)病良好，親本W(wǎng)9593S的稻粒黑粉病粒率為43.79%，顯著低于培矮64S（76.16%）。RIL群體的稻粒黑粉病粒率呈連續(xù)分布（圖1），變幅為1.74%-99.72%，呈雙向超親分離，平均值為52.97%，略偏于低值親本，峰度（-0.83）和偏度（0.1）均小于1，說(shuō)明稻粒黑粉病粒率表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳，符合QTL定位的要求。

圖1 RIL群體的稻粒黑粉病粒率頻次分布Fig.1 Frequency distribution of rice kernel smut rate in RIL population

2.2 親本間遺傳多態(tài)性

采用CTAB方法分別提取親本W(wǎng)9593S和培矮64S的DNA，經(jīng)嚴(yán)格質(zhì)檢，DNA質(zhì)量符合芯片檢測(cè)要求。利用水稻56K全基因組SNP芯片對(duì)2個(gè)親本進(jìn)行全基因組SNP掃描，結(jié)果顯示，芯片掃描共獲得34 930個(gè)有效SNP位點(diǎn)數(shù)據(jù)，親本間差異位點(diǎn)數(shù)為13 690個(gè)，其中757個(gè)差異位點(diǎn)已被華智水稻生物技術(shù)有限公司開發(fā)成SNP標(biāo)記，這些標(biāo)記較為均勻地分布于水稻12條染色體上，第1和第4染色體上的標(biāo)記數(shù)較多，分別為81和80個(gè)，第10染色體上的標(biāo)記數(shù)最少，只有47個(gè)（圖2）。

圖2 親本W(wǎng)9593S、培矮64S間差異SNP標(biāo)記染色體分布Fig. 2 Chromosome distribution of differential SNP marker between parents W9593S and Pei′ai 64 S

2.3 稻粒黑粉病抗性QTL定位

首先從757個(gè)多態(tài)性SNP標(biāo)記中選取均勻分布于水稻12條染色體上的160個(gè)標(biāo)記（每條染色體12-13個(gè)），對(duì)RIL群體進(jìn)行初步檢測(cè)和基因型分型。結(jié)果顯示，145個(gè)標(biāo)記對(duì)RIL群體基因型分型結(jié)果良好，9個(gè)標(biāo)記群體多態(tài)性差，對(duì)基因定位結(jié)果無(wú)參考價(jià)值，6個(gè)標(biāo)記在親本間無(wú)多態(tài)性，推測(cè)是芯片數(shù)據(jù)的假陽(yáng)性位點(diǎn)。

根據(jù)145個(gè)標(biāo)記對(duì)RIL群體的基因型分型結(jié)果，采用MAPMAKER 3.0作圖軟件構(gòu)建了遺傳連鎖圖。結(jié)合RIL基因型和表型檢測(cè)結(jié)果，采用Windows QTL Cartographer 2.5軟件進(jìn)行復(fù)合區(qū)間作圖分析，初步定位到6個(gè)QTL，分布于第1、4、8、10、11、12等6條染色體上，其中第1、8、11染色體上的QTL貢獻(xiàn)率較大。于是在第1、8、11染色體上定位的QTL連鎖標(biāo)記兩端增加10個(gè)標(biāo)記，進(jìn)一步進(jìn)行QTL定位。如此經(jīng)過(guò)連續(xù)3次加密分子標(biāo)記和作圖分析，最終定位到5個(gè)稻粒黑粉病抗性QTL，分布在第1、4、8、11等4條染色體上，其中在第1染色體上的相近位置定位到2個(gè)QTL（圖3）。由表1可見，除第11染色體上的qRRKS-11的抗病等位基因來(lái)自親本培矮64S外，其余4個(gè)QTL的抗病等位基因均來(lái)自親本W(wǎng)9593S；QTL qRRKS-11和qRRKS-8的表型貢獻(xiàn)率較大，分別為13.64%和12.07%。qRRKS-11位于SNP標(biāo)記K_110403與K_110016之間，2個(gè)標(biāo)記之間的遺傳距離為0.9 cM；qRRKS-8位于SNP標(biāo)記K_080131與K_080138之間，2個(gè)標(biāo)記之間的遺傳距離為1.4 cM。利用第1批145個(gè)標(biāo)記在第10、12染色體上定位到的2個(gè)QTL由于貢獻(xiàn)率較小，在多次加密分子標(biāo)記后，其效應(yīng)不再顯著，最終沒(méi)有被檢測(cè)到。

表1 稻粒黑粉病抗性QTL的定位結(jié)果Table 1 Mapping results of QTL for resistance to rice kernel smut

圖3 稻粒黑粉病抗性QTL在染色體上的分布Fig. 3 Chromosome distribution of QTL for resistance to rice kernel smut

3 討論

雖然稻粒黑粉病是雜交水稻繁殖、制種生產(chǎn)中的主要病害之一，但卻少見有關(guān)水稻對(duì)稻粒黑粉病抗性遺傳和基因定位的報(bào)道，難以構(gòu)建遺傳群體可能是其主要原因。稻粒黑粉病主要發(fā)生于不育系，三系不育系不能自交結(jié)實(shí)，無(wú)法構(gòu)建穩(wěn)定的遺傳群體；只有不育基因等位的光溫敏不育系雜交，才能構(gòu)建穩(wěn)定的不育系遺傳群體。本研究供試親本W(wǎng)9593S對(duì)稻粒黑粉病抗性較強(qiáng)，培矮64S易感稻粒黑粉病［2］，且與W9593S不育基因等位，雜交F1、F2分離群體及后續(xù)世代均為光溫敏不育株，每個(gè)世代可隨機(jī)收取不育單株（長(zhǎng)沙割蔸再生收種或帶禾蔸去海南繁殖收種），從而構(gòu)建穩(wěn)定的重組自交系遺傳群體。由于光溫敏不育系自交結(jié)實(shí)率受育性敏感期氣溫影響而不穩(wěn)定，當(dāng)自交結(jié)實(shí)率低時(shí)容易串粉混雜，雖然F2收獲400個(gè)單株，但在逐年淘汰混雜株系后，最終構(gòu)建的定位群體只保留了183個(gè)株系。

前人對(duì)稻粒黑粉病的表型鑒定大多是在田間自然條件下鑒定［2，17］，也有極少數(shù)研究進(jìn)行田間注射接種鑒定［3］，前者工作量較小，但發(fā)病程度易受環(huán)境影響，后者鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確，但接種工作量大。稻粒黑粉病的發(fā)病程度受品種特性和環(huán)境條件的雙重影響，適溫（28-30℃）高濕環(huán)境有利于病菌的繁殖和侵染［18］。本研究采用的表型鑒定方法是田間自然條件下鑒定。2015年表型鑒定試驗(yàn)田間溫濕度適宜，父母本群體花期相遇良好，外源花粉量較充足，促進(jìn)了RIL群體稻粒黑粉病的充分發(fā)病，親本W(wǎng)9593S和培矮64S的稻粒黑粉病粒率分別為43.79%和76.16%，遠(yuǎn)高于宗壽余等［2］的調(diào)查結(jié)果（1.98%和12.53%），說(shuō)明2015年試驗(yàn)的表型調(diào)查結(jié)果能較準(zhǔn)確地反映RIL群體的基因型差異。

為了提高雜交水稻的制繁種產(chǎn)量，生產(chǎn)上應(yīng)用的不育系柱頭外露率越來(lái)越高，稻粒黑粉病發(fā)生也呈加重趨勢(shì)。雖然育種家們致力于抗病不育系的選育，但至今未取得突破性的進(jìn)展，稻粒黑粉病抗性育種任重而道遠(yuǎn)。本研究定位了5個(gè)稻粒黑粉病抗性QTL，其中 qRRKS-11和qRRKS-8對(duì)提高稻粒黑粉病抗性的貢獻(xiàn)率較大（分別為13.64%和12.07%），定位區(qū)間?。ㄟz傳距離分別為0.9和1.4 cM），為進(jìn)一步開展基因精細(xì)定位和克隆以及分子標(biāo)記輔助育種打下了基礎(chǔ)。此外，供試RIL中，有7個(gè)不育系的病粒率低于20%，均極顯著低于抗病親本W(wǎng)9593S，其中，不育系S065病粒率僅為1.74%，該不育系同時(shí)攜帶qRRKS-1.2、qRRKS-4、qRRKS-8、qRRKS-11等4個(gè)抗稻粒黑粉病QTL，可直接用于選配雜交水稻新組合，也能作為抗源在稻粒黑粉病抗性育種中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

水稻對(duì)稻粒黑粉病的抗性表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳。利用培矮64S/W9593S的重組自交系遺傳群體，通過(guò)復(fù)合區(qū)間作圖定位了5個(gè)稻粒黑粉病抗性QTL，這5個(gè)QTL分布在4條染色體上，表型貢獻(xiàn)率為7.26%-13.64%，其中qRRKS-11和qRRKS-8的表型貢獻(xiàn)率較大，分別為13.64%和12.07%，定位區(qū)間的遺傳距離分別為0.9和1.4 cM。qRRKS-11和qRRKS-8效應(yīng)較大，通過(guò)進(jìn)一步精細(xì)定位和克隆，可以用于抗稻粒黑粉病不育系的分子標(biāo)記輔助育種。

致謝：

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)張桂蓮教授、廖斌和蔡志歡先生參與了部分研究工作，特此致謝。