蔣鈺琪 舒新月 鄭愛萍 王愛軍

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

水稻不育系在高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雜交稻選育中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是水稻高產(chǎn)的關(guān)鍵種質(zhì)資源［1-2］。稻粒黑粉病由擔(dān)子菌門真菌Tilletia horrida侵染引起，主要危害水稻不育系花器官［3-4］，在世界雜交稻制種田中廣泛分布。該菌厚垣孢子抗逆性強(qiáng)，在土壤和寄主種子中可長(zhǎng)時(shí)間存活［5］。當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)，厚垣孢子萌發(fā)產(chǎn)生彈射能力較強(qiáng)的針狀或香蕉狀次生擔(dān)孢子侵染寄主［6］，隨后在穎殼內(nèi)產(chǎn)生大量的黑色粉狀冬孢子影響水稻產(chǎn)量與質(zhì)量［7-8］。以往認(rèn)為該病發(fā)病率較低，對(duì)水稻生產(chǎn)影響有限，并未引起足夠的重視［9-11］。目前，為了提高雜交稻制種產(chǎn)量，新選育的不育系柱頭外露率增加，為稻粒黑粉病菌侵染提供了有利的宿主條件，導(dǎo)致該病害發(fā)生率逐年加重，已演變?yōu)橥{雜交稻高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的主要病害之一［12-13］。因此，研究稻粒黑粉病菌與寄主互作機(jī)制，進(jìn)一步防控該病害的發(fā)生，對(duì)保障糧食安全生產(chǎn)具有重要的意義。

自Takahashi［14］于1896年報(bào)導(dǎo)稻粒黑粉病以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后就其侵染細(xì)胞學(xué)開展了一系列研究［15-17］，然而稻粒黑粉病菌與水稻互作機(jī)制研究較少，尤其是稻粒黑粉病抗性基因尚未見報(bào)道。本文綜述了近年來(lái)稻粒黑粉病菌侵染過(guò)程、基因組學(xué)以及與水稻分子互作的最新進(jìn)展，并提出了下一步研究的重點(diǎn)方向。以期為解析稻粒黑粉病菌致病機(jī)制、挖掘潛在的抗性基因；進(jìn)一步通過(guò)分子育種手段培育抗病水稻不育系新材料奠定一定的理論基礎(chǔ)，保障水稻產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 稻粒黑粉病菌侵染過(guò)程

稻粒黑粉病菌主要侵染水稻不育系的柱頭、雄蕊、漿片和雌蕊等花器官［3-4］。在開閉穎后，則主要侵染柱頭的外露部分。當(dāng)不育系受精后，才能形成具有黑色粉狀物的病粒（圖1）［9］。水稻開花初期發(fā)生侵染，盛期受害最重?；ㄆ诜稚?、張穎角度大、柱頭外露率高的不育系較容易發(fā)生侵染，且柱頭活力強(qiáng)弱與病原菌侵染顯著相關(guān)［18-20］。此外，高溫多雨天氣、過(guò)多施用氮肥、趕花粉、使用生長(zhǎng)激素也利于病原菌侵染寄主［21］。病原菌形態(tài)特征方面，王愛軍等［6］對(duì)稻粒黑粉病菌菌落、冬孢子及次生小孢子形態(tài)進(jìn)行了觀察，人工培養(yǎng)基上初期呈酵母狀的白色菌落（圖2-A），后菌落面積增大，中間隆起，顏色由乳白色變?yōu)橹虚g顏色較深的奶酪色，表面產(chǎn)生輻射狀褶皺（圖2-B）。其冬孢子呈球形或橢圓形（圖2-C），次生小孢子形態(tài)為線狀和彎曲狀（圖2-D），單細(xì)胞核（圖2-E）。

圖1 水稻稻粒黑粉病癥狀Fig.1 Symptom of rice kernel smut

圖2 水稻稻粒黑粉病菌形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of rice T. horrida

有關(guān)稻粒黑粉病菌侵染過(guò)程，國(guó)內(nèi)學(xué)者做了些細(xì)胞學(xué)觀察［15-17］。王中康等［22］對(duì)接種稻粒黑粉病菌組織切片進(jìn)行了觀察，結(jié)果表明病原菌擔(dān)孢子從花柱進(jìn)入子房，進(jìn)而擴(kuò)展到珠心組織，后在糊粉層細(xì)胞或細(xì)胞間形成近圓形的冬孢子。陶家鳳等［16］分別對(duì)4個(gè)不育系珍汕97A、D90A、G46A和K17A接種稻粒黑粉病菌，觀察到病菌菌絲直接侵染柱頭，后擴(kuò)展到子房的珠心組織，于接種8 h后在子房中發(fā)現(xiàn)了病原菌菌絲，第7天在種皮和糊粉層間形成了初生冬孢子，第9天冬孢子成熟，病菌在4個(gè)不育系材料中的浸染過(guò)程相似，且無(wú)需授粉就可以浸染，但只在胚乳能正常發(fā)育的子房中形成冬孢子［15］。此外，相關(guān)研究表明稻粒黑粉病菌侵染水稻花器官初期并不會(huì)破壞組織細(xì)胞，沒有明顯癥狀；近黃熟期才能出現(xiàn)明顯的黑色粉狀物。這為進(jìn)行病害早期監(jiān)控，及時(shí)提出防控措施帶來(lái)了一定的困難。在后續(xù)的研究工作中，可進(jìn)一步對(duì)優(yōu)化稻粒黑粉病早期檢測(cè)手段進(jìn)行研究。

2 稻粒黑粉病菌的致病分子機(jī)制

作為活體營(yíng)養(yǎng)型真菌，稻粒黑粉病菌在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，平均生長(zhǎng)速率為0.13 cm/d；且田間接種較為困難，在一定程度上阻礙了其致病機(jī)理的研究。稻粒黑粉病菌強(qiáng)毒力菌株JY-521的全基因組測(cè)序組裝完成［23］，為研究其效應(yīng)蛋白提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，并為通過(guò)病原菌效應(yīng)蛋白挖掘寄主抗性蛋白奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

2.1 稻粒黑粉病菌全基因組測(cè)序完成

全基因組測(cè)序組裝是從分子水平上闡明病原菌致病機(jī)制的前提。Wang等［24］使用第二代基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)稻粒黑粉病菌菌株QB-1進(jìn)了基因組測(cè)序組裝，獲得約20 Mb的基因組草圖，預(yù)測(cè)獲得9 038個(gè)基因，其中4 650個(gè)基因用NR庫(kù)進(jìn)行了注釋。Wang等［23］進(jìn)一步結(jié)合第二代和第三代基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)稻粒黑粉病菌強(qiáng)毒力菌株JY-521進(jìn)行了精細(xì)測(cè)序，組裝出全長(zhǎng)為23.2 Mb的基因組框架圖，預(yù)測(cè)獲得7 729個(gè)基因。此外，還對(duì)另外6個(gè)不同地理來(lái)源的稻粒黑粉病菌菌株進(jìn)行了基因組重測(cè)序，并檢測(cè)到了豐富的遺傳變異。

進(jìn)化分析表明，稻粒黑粉病菌與大麥堅(jiān)黑粉菌（Ustilago hordei）具有較近的親緣關(guān)系，但兩者之間不存在明顯的共線性。對(duì)碳水化合物酶、次生代謝產(chǎn)物及分泌蛋白編碼基因進(jìn)行了注釋，結(jié)果表明稻粒黑粉病菌基因組中編碼碳水化合物酶及次生代謝產(chǎn)物相關(guān)基因較少，可能反應(yīng)了其獨(dú)特的活體營(yíng)養(yǎng)型寄生方式，這一結(jié)果與活體營(yíng)養(yǎng)型真菌稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）基因組注釋結(jié)果相似［25］。在預(yù)測(cè)的597個(gè)分泌蛋白編碼基因中發(fā)現(xiàn)，366個(gè)編碼小片段分泌蛋白（＜400氨基酸）的基因。此外，植物-病原互作蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析表明1 697個(gè)蛋白編碼基因與病原菌致病性相關(guān)?；诒容^和功能基因組學(xué)分析，稻粒黑粉病菌全基因組測(cè)序的完成為揭示其進(jìn)化、致病分子機(jī)制研究及進(jìn)一步有效防控該病害提供了重要信息。

2.2 稻粒黑粉病菌致病機(jī)制研究

與稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）和白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae）等水稻病原菌相比，稻粒黑粉病菌田間接種及遺傳轉(zhuǎn)化較為困難，其致病機(jī)制研究進(jìn)展緩慢。病原菌在侵染寄主早期，往往誘導(dǎo)其致病基因的上調(diào)表達(dá)。舒新月等［26］對(duì)稻粒黑粉病菌侵染感病水稻不育系材料9311A的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)（8、12、24、48和72 h）轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)有500個(gè)基因在不同的侵染時(shí)間點(diǎn)被誘導(dǎo)差異表達(dá)，且在侵染8 h差異表達(dá)基因數(shù)最多。其中，有131 個(gè)編碼小分泌蛋白基因在侵染8 h被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，這些基因預(yù)測(cè)為候選效應(yīng)蛋白。差異基因GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析表明，脂類降解（lipid degradation）和自噬過(guò)程（autophagy processes）是稻粒黑粉病菌成功侵染寄主的關(guān)鍵生物學(xué)途徑。為稻粒黑粉病菌致病機(jī)制研究提供了參考。

植物病原真菌分泌的效應(yīng)蛋白在植物與病原菌互作過(guò)程中發(fā)揮重要的作用［27］。多數(shù)編碼小分子分泌蛋白，通過(guò)誘導(dǎo)改變寄主細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能，干擾寄主免疫，從而促進(jìn)病原菌侵染［28-29］。Wang等［30］從預(yù)測(cè)的131個(gè)稻粒黑粉病菌效應(yīng)蛋白中選擇36個(gè)在煙草表皮細(xì)胞中進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn) smut_2965和smut_5844可誘導(dǎo)煙草表皮細(xì)胞死亡，并激活煙草免疫反應(yīng)。預(yù)測(cè)的信號(hào)肽是smut_5844引起煙草表皮細(xì)胞壞死反應(yīng)能力是必須的，而預(yù)測(cè)的核糖核酸酶活性位點(diǎn)是smut_2965所必須的。這為稻粒黑粉病菌致病機(jī)制研究提供了新的視角。為進(jìn)一步明確smut_2965和smut_5844在稻粒黑粉病菌致病過(guò)程中的作用，還需結(jié)合基因編輯技術(shù)敲除稻粒黑粉病菌目的基因，并驗(yàn)證其對(duì)病原菌毒力的影響。

上述研究為稻粒黑粉病菌致病機(jī)制的解析奠定了重要的基礎(chǔ)。但是，由于稻粒黑粉病菌生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，研究其功能基因難度較大；稻粒黑粉病菌侵染初期不顯癥，季節(jié)、氣候等因素對(duì)病原菌侵染影響較大，給田間菌株致病性檢測(cè)帶來(lái)了一定的困難；此外，稻粒黑粉病菌基因編輯體系尚不完善。這些原因?qū)е铝说玖：诜鄄【虏C(jī)制研究進(jìn)展緩慢。盤林秀等［31］對(duì)稻粒黑粉病菌不同菌株、不同生活史階段和不同濃度 Basta 處理下的最佳內(nèi)參基因進(jìn)行了篩選鑒定，發(fā)現(xiàn)UBQ、GAPDH 和 EF1α為不同條件下的最穩(wěn)定內(nèi)參基因，為稻粒黑粉病菌致病基因在侵染時(shí)的表達(dá)模式研究奠定了重要基礎(chǔ)。今后研究中，進(jìn)一步完善稻粒黑粉病菌的接種方法和功能基因編輯體系至關(guān)重要，可為闡明稻粒黑粉病菌致病機(jī)理、制訂有效的防控策略提供新的思路。

3 水稻抗稻粒黑粉病研究

應(yīng)用和選育抗病水稻不育系是防控稻粒黑粉病最為經(jīng)濟(jì)、有效的手段，而關(guān)于稻粒黑粉病抗性水稻不育系資源及抗病基因報(bào)道較少。在稻粒黑粉病防控方面，Chen等［32］通過(guò)設(shè)計(jì)特異性ITS引物，可在病原菌侵染早期檢測(cè)到稻谷中的黑粉病菌，便于及時(shí)做出相應(yīng)的防控措施，克服了稻粒黑粉病菌侵染早期不顯癥的問(wèn)題。邵見陽(yáng)等［17］用4個(gè)稻粒黑粉病菌菌株分別接種了2個(gè)水稻不育系材料，發(fā)病結(jié)果表明4個(gè)菌株沒有對(duì)某一個(gè)不育系表現(xiàn)親和或不親和性。該結(jié)果說(shuō)明稻粒黑粉病菌沒有明顯的生理小種分化，為抗病水稻不育系田間接種鑒定奠定了重要的基礎(chǔ)。王愛軍等［33］對(duì)來(lái)源于我國(guó)福建、四川和湖北3省的78個(gè)水稻不育系材料進(jìn)行了抗稻粒黑粉病評(píng)價(jià)，獲得了4個(gè)表現(xiàn)中抗水平以上的水稻不育系材料4766A、江城3A、巨豐2A和天豐A，為稻粒黑粉病抗性研究提供了重要的抗源材料。

寄主植物與病原菌互作過(guò)程中，病原菌通過(guò)侵入、增殖和移動(dòng)擴(kuò)散完成對(duì)寄主的侵染；植物感知病原菌進(jìn)而激活一系列的防御反應(yīng)，減緩病原菌的侵染［34］。稻粒黑粉病菌強(qiáng)毒力菌株JY-521分別侵染抗病不育系江城3A和感病不育系9311A，在侵染8、12、24、48和72 h取樣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗病水稻不育系中有更多的基因被稻粒黑粉病菌侵染誘導(dǎo)差異表達(dá)，表明稻粒黑粉病菌的侵染激活了抗病不育系的多個(gè)生物學(xué)途徑［24，35］。在侵染早期（8 h），抗病不育系中類鈣調(diào)蛋白（calmodulinlike proteins）編碼基因OsCML7和OsCML14；參與活性氧（reactive oxygen species，ROS）爆發(fā)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase）編碼基因Os09g0467200、Os01g0369700和Os01g0949800；NADPH 氧化酶基因Osrboh9以及水楊酸（salicylic acid，SA）信號(hào)途徑相關(guān)基因OsNPR1等多個(gè)基因被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。此外，病程相關(guān)蛋白（pathogenesisrelated proteins，PR）是植物受病原菌侵染誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類蛋白，參與植物的誘導(dǎo)抗病性。轉(zhuǎn)錄組和熒光定量PCR分析表明，PR1a 和PR10b 也在稻粒黑粉病菌侵染抗病不育系早期被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果表明稻粒黑粉病菌侵染水稻初期就激活了水稻的基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)［35］。

稻粒黑粉病菌主要侵染水稻不育系的花器官?？垢胁挥当容^轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，抗病不育系中水稻穎花開花調(diào)節(jié)基因OsCTR2、OsABF1和OsRR1被稻粒黑粉病菌侵染誘導(dǎo)差異表達(dá)，而在感病不育系中這3個(gè)基因不呈差異表達(dá)。先前研究表明OsRR1和OsCTR2 的過(guò)量表達(dá)株系表現(xiàn)晚花表型［36-37］。在侵染12 h時(shí)，抗病不育系中這兩個(gè)基因被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。OsABF1是1個(gè)開花期的負(fù)調(diào)控因子，干涉表達(dá)株系表現(xiàn)延遲開花表型，與此對(duì)應(yīng)抗病不育系中該基因被稻粒黑粉病侵染誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果表明誘導(dǎo)晚花可能是稻粒黑粉病抗性的潛在機(jī)制［38］。為稻粒黑粉病抗性機(jī)制解析提供了理論基礎(chǔ)。

此外，抗感水稻不育系轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，有4 425個(gè)基因在抗病不育系中被稻粒黑粉病侵染誘導(dǎo)差異表達(dá)，而在感病不育系中不呈差異表達(dá)［35］。這些基因可能是參與稻粒黑粉病抗性調(diào)控的關(guān)鍵基因。在以后的稻粒黑粉病抗性基因克隆工作中，可將重點(diǎn)集中于這類基因。該結(jié)果為稻粒黑粉病抗性育種研究提供了潛在的基因資源。

4 總結(jié)與展望

植物病原菌致病包括從識(shí)別、侵染到產(chǎn)孢等多個(gè)階段，每個(gè)階段寄主與病原菌之間的互作涉及多個(gè)生物學(xué)途徑及基因調(diào)控，是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。明確病原菌致病機(jī)理對(duì)防控植物病害具有重要意義。水稻稻粒黑粉病菌和稻曲病菌均為活體營(yíng)養(yǎng)型真菌，且均侵染水稻花器官［6，39］?；ńz被稻曲病菌侵染后伸長(zhǎng)受到抑制，不能形成成熟的花粉，受精過(guò)程遇阻，淀粉不能完成積累［40］。因此，稻曲病菌在侵染水稻過(guò)程中可能通過(guò)模擬水稻胚珠受精過(guò)程，誘導(dǎo)灌漿相關(guān)基因（OsRISBZ1）、種子儲(chǔ)藏蛋白基因（OsGlutln1、OsPromln2、Os03g58480）和淀粉代謝基因（OsSSIIIa、OsAGPS2b、Os02g32660）的表達(dá)，進(jìn)而激活水稻灌漿信號(hào)途徑，為病原菌生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［41-43］。相關(guān)研究也表明，完成受精的子房可以阻礙稻曲病菌菌絲形成稻曲球［40-41］。而與之相反，稻粒黑粉病菌只有在受精完成的不育系中才能形成黑色粉狀的冬孢子［23］，我們推測(cè)稻粒黑粉病菌致病機(jī)制與稻曲病菌模擬水稻胚珠受精過(guò)程不同，應(yīng)該存在其獨(dú)有的寄主-病原菌互作生物學(xué)過(guò)程。

致病功能基因研究可為稻粒黑粉病防治提供新的靶標(biāo)，對(duì)促進(jìn)該病的防控，提高雜交稻制種產(chǎn)量具有重大意義。隨著稻粒黑粉病菌基因組測(cè)序組裝的完成及侵染轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的解析，為深入闡明其致病機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)?；诒容^基因組學(xué)分析，挖掘與其它病原真菌致病相關(guān)基因同源性基因，是研究稻粒黑粉病菌致病基因的有效方法。MAPK（mitogen-activated protein kinases）信號(hào)途徑在植物病原真菌致病過(guò)程中具有重要的作用［44］。玉米黑粉病菌基因Ubc3是MAPK信號(hào)途徑的1個(gè)關(guān)鍵基因，與病原菌菌絲的生長(zhǎng)相關(guān)，還可通過(guò)調(diào)節(jié)致病性發(fā)育基因 Prf1影響病原菌致病性［45］。稻粒黑粉病菌smut_0057基因是Ubc3的同源基因［23］，可能在稻粒黑粉病菌致病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。HOG1信號(hào)途徑是植物病原真菌中較為保守的MAPK 途徑之一，其中的Hog1同源基因在真菌中具有較高的保守性，在維持病原菌細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡，氧化脅迫應(yīng)答、致病過(guò)程中起重要作用［46］。Hog1的同源基因Smut_0038可能是稻粒黑粉病菌致病關(guān)鍵基因［23］。進(jìn)一步的工作可通過(guò)構(gòu)建稻粒黑粉病菌突變株系闡明這些基因在水稻-稻粒黑粉病菌互作過(guò)程中的作用。

此外，基于基因組功能基因注釋預(yù)測(cè)到的1 697個(gè)病原-寄主互作基因（pathogen-host interaction gene，PHI）中，部分基因是稻粒黑粉病菌特有的。這些基因可能參與了稻粒黑粉病菌的致病過(guò)程。進(jìn)一步結(jié)合侵染轉(zhuǎn)錄組分析，預(yù)測(cè)了稻粒黑粉病菌潛在的效應(yīng)蛋白，也為研究稻粒黑粉病菌新的致病功能基因提供了重要的依據(jù)。利用病原菌的致病基因挖掘寄主潛在的抗病基因是目前植物病理學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。未來(lái)工作一方面可進(jìn)一步完善稻粒黑粉病菌基因編輯體系，應(yīng)用基因編輯技術(shù)驗(yàn)證病原菌關(guān)鍵致病因子。另一方面，可充分利用已報(bào)道的致病相關(guān)基因，如smut_2965和smut_5844，挖掘寄主中與其相互識(shí)別的抗性靶基因。

盡管抗稻粒黑粉病水稻不育系資源的田間篩選方面有了一些進(jìn)展，但其抗病相關(guān)位點(diǎn)及基因尚未見報(bào)道。生產(chǎn)上，應(yīng)用抗病基因選育抗病品種是防控水稻病害最為有效的措施，然而抗稻粒黑粉病的遺傳機(jī)制尚不清楚，阻礙了其抗性品種的選育。在進(jìn)一步的工作中，可利用現(xiàn)有抗病材料構(gòu)建遺傳分離群體，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)手段定位稻粒黑粉病抗病位點(diǎn)，進(jìn)而克隆抗病基因。抗病基因研究最終意義是培育抗病品種。雖然基因組技術(shù)的不斷發(fā)展為抗病基因的挖掘提供了技術(shù)支撐，但如何將抗病基因應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中才是科研工作最為關(guān)鍵的。制種產(chǎn)量較高的水稻不育系通常具有高異交性，柱頭外露率較大，大大提高了稻粒黑粉病的感病性［7，12］。結(jié)合分子生物學(xué)手段和常規(guī)雜交育種技術(shù)，已報(bào)道的稻粒黑粉病抗性水稻不育系4766A、江城3A和巨豐2A培育高異交抗病不育系［32］，進(jìn)一步提高雜交稻制種產(chǎn)量是我們未來(lái)工作的核心目標(biāo)。