趙艷麗 劉錦濤 李 愿 郭曉宇 閆素梅 郭詠梅 鄭亞光

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，呼和浩特 010018)

乳腺是乳合成的重要場所，乳腺的健康直接影響產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)。乳脂是牛奶的重要組成成分，也是衡量乳品質(zhì)的重要指標。近年來，隨著科學技術(shù)的快速發(fā)展與應(yīng)用，奶牛的產(chǎn)奶性能逐步提高，隨之而引起的乳腺組織氧化損傷和抗氧化機能的平衡失調(diào)現(xiàn)象日趨嚴重，嚴重影響了牛奶的品質(zhì)和乳品加工質(zhì)量，造成奶牛養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟損失。維生素A是維持動物機體正常生理代謝的必需營養(yǎng)素之一，能通過調(diào)控多種基因的表達影響動物機體的生長發(fā)育、免疫及抗氧化能力。因此，深入探討維生素A緩解奶牛乳腺上皮細胞(BMECs)氧化損傷機理，進而調(diào)控乳脂合成，對緩解BMECs氧化應(yīng)激，提高產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)有重要意義。Shi等[1]研究發(fā)現(xiàn)，維生素A對脂多糖誘導的BMECs氧化損傷有保護作用，對谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性及其基因表達有正向影響。冬季在奶牛飼糧中添加維生素A可以顯著提高產(chǎn)奶量和奶中非脂乳固體含量以及GPx活性，奶和血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性也顯著提高[2]，可見維生素A的添加提高了GPx與SOD等抗氧化酶的活性，提高了產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)。然而，前人研究多偏重于研究維生素A對BMECs氧化損傷的緩解作用機理以及維生素A對奶牛產(chǎn)奶量及乳品質(zhì)的影響，有關(guān)維生素A對氧化損傷的BMECs內(nèi)乳脂合成的影響及其調(diào)控機理的研究較少。鑒于此，本研究以二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(DETA/NO)誘導損傷的BMECs為模型，從基因水平探討維生素A緩解DETA/NO誘導損傷的BMECs內(nèi)乳脂合成下降的調(diào)控機理，并從中選出適宜的維生素A添加量，為深入研究維生素A對乳脂合成的調(diào)控機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑配制

將100 mg視黃酸(維生素A的主要活性代謝物質(zhì)，純度98%，Sigma)溶于4.9 mL二甲基亞砜(DMSO)溶液，配制成20.00 mg/mL的維生素A原液，0.22 μm濾器過濾，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細胞培養(yǎng)與試驗設(shè)計

采用膠原酶消化法培養(yǎng)BMECs，具體步驟參照Sheng等[3]的方法進行。試驗采用單因素完全隨機試驗設(shè)計，將第3代BMECs隨機分為9組，對照組(CON組)不添加DETA/NO和維生素A培養(yǎng)30 h；試驗1組為DETA/NO損傷組(記為NO組)，不添加維生素A培養(yǎng)24 h后添加1 000 μmol/L的DETA/NO繼續(xù)培養(yǎng)6 h；試驗2～8組為維生素A預(yù)保護+損傷組，維生素A添加量分別為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00和4.00 μg/mL，分別記為NOA0.05、NOA0.1、NOA0.2、NOA0.5、NOA1、NOA2和NOA4組，添加相應(yīng)量維生素A培養(yǎng)24 h后添加1 000 μmol/L的DETA/NO繼續(xù)培養(yǎng)6 h。每組6個重復(fù)。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 BMECs活力的測定

BMECs活力采用CCK-8法測定，使用細胞相對增殖率(RGR)表示。將傳至第3代的細胞懸液接種到96孔細胞板內(nèi)，按試驗設(shè)計培養(yǎng)結(jié)束后加入20 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，使用全自動酶標儀(Synergy H4，Bio-Tek，美國)于450 nm波長下測定吸光度(OD450)值。試劑盒購于北京碧云天公司。

RGR(%)=(試驗組OD450/對照組OD450)×100。

1.3.2 BMECs內(nèi)甘油三酯(TG)含量的測定

BMECs以5×104個/mL的密度接種于24孔板中，按試驗設(shè)計培養(yǎng)30 h后，棄培養(yǎng)基，利用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)消化細胞，用試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)測定BMECs內(nèi)TG含量。

1.3.3 BMECs培養(yǎng)液中誘導型一氧化氮合酶(iNOS)活性、一氧化氮(NO)含量及抗氧化指標的測定

BMECs以3×105個/mL的密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，按試驗設(shè)計培養(yǎng)30 h后，收集培養(yǎng)液和細胞。BMECs內(nèi)GPx和硫氧還蛋白還原酶(TrxR)活性采用二硫代二硝基苯甲酸法測定；BMECs培養(yǎng)液中活性氧(ROS)、iNOS活性和NO含量均按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒的說明書進行操作，試劑盒購于睿信生物科技有限公司；BMECs培養(yǎng)液中總抗氧化能力(T-AOC)采用鉬酸銨顯色法測定，SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用比色法測定，試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.3.4 BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)酶活性的測定

BMECs以3×105個/mL的密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，按試驗設(shè)計培養(yǎng)30 h后，收集細胞。BMECs內(nèi)脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)、脂蛋白脂酶(LPL)活性均按照ELISA試劑盒的說明書進行操作，試劑盒購于睿信生物科技有限公司。

1.3.5 BMECs內(nèi)抗氧化和乳脂合成相關(guān)基因表達的測定

BMECs以2×105個/mL的密度接種于6孔板中，按試驗設(shè)計培養(yǎng)30 h后，棄培養(yǎng)基，采用Trizol法[4]提取細胞總RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄使用PrimeScript RT Reagent Kit(TaKaRa)試劑盒并按說明書進行操作。依據(jù)SYBY Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)試劑盒說明書，采用實時熒光定量PCR儀(LightCycler480-Ⅱ)進行基因表達的測定，各基因引物序列見表1。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計算目的基因的mRNA表達量。

表1 引物序列

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2019進行整理和計算，采用SAS 9.0軟件的ANOVA程序進行顯著性檢驗。P<0.05表示差異顯著，0.05

2 結(jié) 果

2.1 BMECs活力

由圖1可知，NO組RGR顯著低于CON組(P<0.05)；與NO組相比，NOA0.1～NOA4組RGR顯著增加(P<0.05)，尤以NOA1組最高，并顯著高于NOA0.1、NOA0.2、NOA0.5、NOA2和NOA4組(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.2 BMECs內(nèi)TG含量

由圖2可知，與CON組相比，NO組TG含量顯著下降(P<0.05)。與NO組相比，NOA0.2～NOA4組TG含量顯著上升(P<0.05)，尤以NOA1組最高，并顯著高于NOA0.1、NOA0.2、NOA0.5、NOA2和NOA4組(P<0.05)，NOA0.5、NOA2和NOA4組間差異不顯著(P>0.05)。

圖2 維生素A對NO誘導損傷的奶牛乳腺上皮細胞內(nèi)甘油三酯含量的影響

2.3 BMECs培養(yǎng)液中iNOS活性、NO含量及抗氧化指標

由表2可知，與CON組相比，NO組iNOS、ROS活性與NO含量顯著增加(P>0.05)，其他抗氧化指標均顯著下降(P<0.05)。與NO組相比，NOA0.2～NOA4組TrxR、CAT和GPx活性顯著增加(P<0.05)，但iNOS和ROS活性顯著下降(P<0.05)；NOA0.1～NOA4組T-AOC顯著增加(P<0.05)，NOA0.05～NOA1組NO含量顯著下降(P<0.05)。

表2 維生素A對NO誘導損傷的BMECs培養(yǎng)液中iNOS活性、NO含量及抗氧化指標的影響

2.4 BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)酶活性

由表3可知，與CON組相比，NO組乳脂合成相關(guān)酶的活性均顯著下降(P<0.05)。NO組FASN、ACC和LPL活性顯著低于NOA0.05～NOA4A組(P<0.05)，SCD活性顯著低于NOA0.05～NOA2組(P<0.05)，F(xiàn)ASN活性以NOA1組最高，SCD和LPL活性以NOA0.2～NOA1組較高。

表3 維生素A對NO誘導損傷的BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)酶活性的影響

2.5 BMECs內(nèi)抗氧化和乳脂合成相關(guān)基因表達

由表4可知，NO組乳脂合成相關(guān)基因的mRNA相對表達量均顯著低于CON組(P<0.05)。與NO組相比，NOA0.05～NOA4組GPx1、FASN、LPL和SREBP1的mRNA相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05)，且均以NOA1組最高；NOA0.1～NOA4組TrxR的mRNA相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05)，以NOA0.2～NOA4組較高。NOA0.05～NOA2組SCD和PPARG的mRNA相對表達量顯著高于NO組(P<0.05)，其中SCD的mRNA相對表達量以NOA0.5～NOA1組較高，PPARG的mRNA相對表達量以NOA1組最高。NOA0.05～NOA1組FABP3的mRNA相對表達量顯著高于NO組(P<0.05)，NOA0.2和NOA1組ACC的mRNA相對表達量顯著高于NO組(P<0.05)。

表4 維生素A對NO誘導損傷的BMECs內(nèi)抗氧化和乳脂合成相關(guān)基因表達的影響

3 討 論

3.1 維生素A對NO誘導損傷的BMECs活力及抗氧化酶活性的影響

在泌乳期高產(chǎn)奶牛BMECs代謝率高，產(chǎn)生大量氧自由基，易導致氧化應(yīng)激發(fā)生。正常情況下可以將代謝產(chǎn)生的自由基及時清除，但當機體由于應(yīng)激產(chǎn)生過量的自由基時，機體自身已經(jīng)無法將其清除，就會對細胞活力、蛋白質(zhì)、氨基酸和DNA等生物大分子造成破壞，影響細胞正常的生理功能[5]。GPx、TrxR、CAT、SOD等抗氧化酶活性是反映機體抗氧化功能的重要指標之一。當機體發(fā)生氧化應(yīng)激后，這些抗氧化酶的活性和BMECs活力都會顯著降低，而NO含量和iNOS活性會顯著提高[6-8]。有研究表明添加視黃酸會顯著提高BMECs中GPx和TrxRmRNA相對表達量，同時細胞RGR也有顯著提高[9]。本課題組前期試驗也表明飼糧中添加適量的維生素A可以顯著上調(diào)奶牛血清中或BMECs內(nèi)GPx和TrxR的mRNA相對表達量，TrxR的蛋白相對表達量也有上調(diào)的趨勢，緩解氧化應(yīng)激[7-8]。本研究進一步證明，在NO損傷BMECs后，細胞RGR及GPx、TrxR等抗氧化酶活性顯著降低，而ROS、iNOS活性與NO含量顯著提高，添加維生素A進行預(yù)保護則使細胞RGR及抗氧化酶活性顯著提高，且維生素A添加量以0.2～4.0 μg/mL較好，這與前人研究結(jié)果相一致，表明維生素A預(yù)保護可以緩解NO誘導的BMECs氧化損傷。

3.2 維生素A對NO誘導損傷的BMECs內(nèi)乳脂合成下降的緩解作用

乳脂是牛奶中重要的營養(yǎng)成分，主要由TG組成，其含量約占所有乳脂成分的98%。TG主要成分是脂肪酸，乳中脂肪酸有2個來源途徑，一是由中短鏈脂肪酸從頭合成，二是從血液中吸收長鏈脂肪酸(LCFA)[10]。ACC和FASN是脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵酶，F(xiàn)ABP3和LPL參與哺乳動物多種組織中長鏈脂肪酸攝取與細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運[11-12]，SCD是催化飽和脂肪酸形成單不飽和脂肪酸的關(guān)鍵限速酶，具有脫氫去飽和作用，SCD的催化產(chǎn)物是TG合成的重要組成部分[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，誘導劑損傷的BMECs內(nèi)抗氧化酶活性下降，同時細胞活力和TG合成、乳脂合成相關(guān)酶ACC、LPL、FASN、SCD等的活性和其基因相對表達量顯著下降[15-16]。本研究使用維生素A預(yù)保護后發(fā)現(xiàn)其可以緩解NO誘導損傷的BMECs內(nèi)FABP3、LPL、FASN、ACC、SCDmRNA相對表達量與TG合成的下降，說明維生素A可能通過緩解脂肪酸的從頭合成和長鏈脂肪酸攝取的下降，進而緩解了TG合成的下降。

PPARγ和SREBP1分別是核轉(zhuǎn)錄因子家族和核激素受體家族中的配體激活受體，是脂肪合成基因網(wǎng)絡(luò)中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子；同時，PPARγ可抑制多種疾病引起的炎癥反應(yīng)和緩解氧化應(yīng)激[17]，當GPx沉默后PPARγ表達下降，硒不能發(fā)揮促進BMECs抗氧化功能的作用[18]，說明GPx-PPARγ被激活后提高了細胞的抗氧化功能。PPARγ和SREBP1正向調(diào)控ACC、FASN、SCD、LPL等靶基因，進而調(diào)節(jié)脂肪酸的轉(zhuǎn)運、合成及去飽和過程[19-21]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，添加維生素A顯著上調(diào)了被氧化損傷的BMECs內(nèi)ACC、FASN、PPARγ和SREBP1的基因表達[22]。本試驗發(fā)現(xiàn)，被NO損傷后BMECs內(nèi)GPx1、ACC、FASN、FABP3、SCD、PPARG和SREBP1的mRNA相對表達量顯著下降，維生素A預(yù)保護可以緩解GPx1、PPARG和SREBP1以及TG合成相關(guān)基因表達的下降，表明維生素A可通過激活GPx1的表達上調(diào)PPARγ緩解NO誘導損傷BMECs的氧化應(yīng)激，進而減緩乳脂合成的下降，但具體的調(diào)節(jié)機理需要進一步研究探討。

4 結(jié) 論

NO誘導損傷的BMECs活力下降，GPx、TrxR、CAT、SOD、ROS、FASN、ACC、SCD、LPL活性和T-AOC以及GPx1、TrxR、PPARγ、SREBP1基因表達下降，iNOS活性和NO含量增加；維生素A預(yù)保護上調(diào)了抗氧化酶活性及其基因表達，抑制了iNOS和ROS活性及NO合成，緩解了乳脂合成相關(guān)酶活性及其基因表達的下降，以0.20～2.00 μg/mL的效果較好，尤以1.00 μg/mL的效果最好。