代謝流分析在C HO細(xì)胞代謝研究中的應(yīng)用進(jìn)展

彭婷 綜述，梅文楓 審校

福建醫(yī)科大學(xué)免疫治療研究院，福建福州 350122

由于CHO細(xì)胞能進(jìn)行正確的翻譯后修飾，如蛋白折疊、糖基化，且其表達(dá)的重組蛋白可分泌至胞外，更便于后續(xù)純化，已成為抗體藥物的首選表達(dá)宿主［1-2］。為建立高表達(dá)、穩(wěn)定、質(zhì)量可控的重組CHO細(xì)胞株及培養(yǎng)工藝，研究者已從營(yíng)養(yǎng)底物優(yōu)化［3-5］、代謝工程［6-8］、過(guò)表達(dá)抗凋亡基因［9-10］、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［11］等多個(gè)方面來(lái)改善CHO細(xì)胞性能［12］。

代謝流分析（metabolic flux analysis，MFA）又稱(chēng)代謝通量分析，可通過(guò)同位素示蹤劑繪制胞內(nèi)流動(dòng)的代謝途徑來(lái)量化這些代謝表型，其綜合底物吸收及產(chǎn)物形成速率、生物合成、化學(xué)計(jì)量反應(yīng)、中間代謝物的生物合成等數(shù)據(jù)，可為重新構(gòu)建細(xì)胞代謝提供關(guān)鍵的量化信息。目前，越來(lái)越多的研究結(jié)合MFA，從多維度來(lái)改善CHO細(xì)胞性能，以建立穩(wěn)定的重組CHO細(xì)胞。13C-MFA是以13C標(biāo)記實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的MFA，已成為探討宿主細(xì)胞工程改造后的變化及指導(dǎo)培養(yǎng)基和生物工藝優(yōu)化的重要工具之一［13］。本文就13C-MFA流程及近年MFA在CHO細(xì)胞代謝研究中的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1 13C-MFA流程

13C-MFA一般流程包括設(shè)計(jì)同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)、同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)、標(biāo)記物信息測(cè)定、代謝流計(jì)算、統(tǒng)計(jì)分析［14］。

1.1設(shè)計(jì)同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn) 同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)仍是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)，選擇合適的同位素和標(biāo)記策略對(duì)估算通量精確度的影響較大，因此標(biāo)記底物的選擇和優(yōu)化對(duì)胞內(nèi)代謝流的計(jì)算至關(guān)重要［15-16］。最新的開(kāi)源軟件IsoDesign有助于選擇合適的同位素，這是一款用于MFA實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)優(yōu)化輸入同位素組成使參數(shù)最大化的軟件，其包括1個(gè)可視化模塊，該模塊可根據(jù)待處理的生物問(wèn)題直觀地選擇輸入最佳標(biāo)簽，同時(shí)用戶可定義每個(gè)同位素含量的上下限，有助于限制同位素成本［17］。D-葡萄糖是常用的底物，其標(biāo)記類(lèi)型有兩種：一種是特定位置13C標(biāo)記的葡萄糖，如［1，2-13C2］葡萄糖；另一種是全標(biāo)記葡萄糖［U-13C6］。不同代謝途徑的計(jì)算需不同標(biāo)記方法，METALLO等［15］對(duì)碳原子采用18種標(biāo)記方法，通過(guò)比較，得出［U-13C6］標(biāo)記的葡萄糖對(duì)估算三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）途徑的通量值比較有效，而［1，2-13C2］葡萄糖和［1-13C］葡萄糖能提供糖酵解和氧化磷酸戊糖途徑（oxidative pentose phosphate pathway，oxPPP）上的信息。TEMPLETON等［18］在研究CHO細(xì)胞中抗體的產(chǎn)生與氧化代謝之間的聯(lián)系時(shí)，選擇的是50%［1，2-13C2］、30%［U-13C6］和20%［1-13C］標(biāo)記的葡萄糖。近年來(lái)，13C不僅標(biāo)記于葡萄糖上的碳原子，還標(biāo)記于丙酮酸、谷氨酰胺上的碳原子，多種標(biāo)記底物組合增加了中間體標(biāo)記，對(duì)流量估算值起到精準(zhǔn)的補(bǔ)充。DEAN等［19］不僅對(duì)葡萄糖上的碳進(jìn)行標(biāo)記，同時(shí)對(duì)丙酮酸［2-13C］和谷氨酰胺［U-13C5］進(jìn)行了標(biāo)記；AHN等［20］也對(duì)谷氨酰胺的［U-13C5］進(jìn)行了標(biāo)記。設(shè)計(jì)中不僅要結(jié)合實(shí)驗(yàn)需求合理選擇標(biāo)記底物，同時(shí)也要考慮標(biāo)記底物的成本，從而以較低的實(shí)驗(yàn)成本獲得更多的通量信息。因此在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，生物反應(yīng)器容積應(yīng)盡量小，可考慮嘗試微小型生物反應(yīng)器，如賽多利斯的Ambr15。

1.2同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn) 在標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，選擇合適的方式進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中根據(jù)設(shè)計(jì)好的同位素標(biāo)記策略于選定的時(shí)間點(diǎn)添加13C標(biāo)記底物，并進(jìn)行取樣，測(cè)量營(yíng)養(yǎng)物和細(xì)胞產(chǎn)物（如葡萄糖、氨基酸、乳酸、生物質(zhì)）的生產(chǎn)速率和消耗速率。（擬）穩(wěn)態(tài)假設(shè)是MFA的重要前提，穩(wěn)態(tài)可分為代謝穩(wěn)態(tài)和同位素穩(wěn)態(tài)，其中代謝穩(wěn)態(tài)指的是細(xì)胞胞內(nèi)代謝通量保持不變，一般呈現(xiàn)于培養(yǎng)對(duì)數(shù)的中后期。根據(jù)取樣時(shí)同位素異構(gòu)體的組成是否己達(dá)到穩(wěn)態(tài)，可將代謝流分為穩(wěn)態(tài)代謝流和非穩(wěn)態(tài)代謝流兩種［21-22］。非穩(wěn)態(tài)代謝流的優(yōu)點(diǎn)是同位素標(biāo)記底物用量少、節(jié)省成本、耗時(shí)短、獲得的胞內(nèi)代謝信息更多、計(jì)算結(jié)果相對(duì)更精確［23-24］；其缺點(diǎn)是計(jì)算復(fù)雜、樣品多且要進(jìn)行快速取樣，需高精準(zhǔn)度的代謝物檢測(cè)設(shè)備。非穩(wěn)態(tài)代謝流分析方法尚需進(jìn)一步發(fā)展和完善，目前已有相關(guān)開(kāi)源軟件，如OpenMebius、INCA。

1.3標(biāo)記物信息測(cè)定 目前，同位素標(biāo)記測(cè)定應(yīng)用最廣泛的方法是氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）和核磁共振（nucleic magnetic resonance，NMR）。MS檢測(cè)具有靈敏度高、分析時(shí)間短、設(shè)備費(fèi)用低和檢測(cè)物質(zhì)種類(lèi)多的優(yōu)點(diǎn)；NMR雖然測(cè)試靈敏度較低，譜圖解析較困難，但數(shù)據(jù)分析發(fā)展較為成熟［25］。近年來(lái)該領(lǐng)域有了新進(jìn)展，即采用串聯(lián)MS來(lái)測(cè)量同位素分布［26］，CHOI等［27］實(shí)驗(yàn)證明，串聯(lián)MS也能為MFA提供信息數(shù)據(jù)，并能測(cè)量完整的同位素分布；JEFFREY等［28］實(shí)驗(yàn)也表明，與單獨(dú)的MS或NMR比較，串聯(lián)MS在13C代謝分析中具有更高靈敏度。底物標(biāo)記物的選擇決定檢測(cè)方式能否獲取最多的信息數(shù)據(jù)，因此在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中檢測(cè)方法的選擇與同位素標(biāo)記策略應(yīng)綜合考慮［29］。

1.4代謝流計(jì)算 在13C-MFA中，通量估算需要數(shù)學(xué)模型結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來(lái)完成［30］，其目標(biāo)是找到最適合通量值，該值能匹配胞外代謝速率和同位素標(biāo)記的數(shù)據(jù)［31-32］。目前，主要有比率分析法和全局迭代擬合法兩種計(jì)算方法［33］。在早期MFA中，研究人員需以自己編寫(xiě)程序代碼來(lái)分析數(shù)據(jù)，較繁瑣，也限制了MFA的發(fā)展。近年來(lái)，開(kāi)發(fā)了多種軟件用于數(shù)據(jù)分析，如可用于通量估算的Metran和Open-Flux［34-35］，再如INCA［36］和OpenMebius［37］軟件能靈活使用單個(gè)建模平臺(tái)執(zhí)行穩(wěn)態(tài)或非穩(wěn)態(tài)代謝流的計(jì)算，另外，INCA還具有執(zhí)行同位素模擬、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和對(duì)限制途徑進(jìn)行分析的功能。目前已有多種可結(jié)合MFA自動(dòng)化輔助數(shù)據(jù)處理和步驟可視化的軟件，見(jiàn)表1［38］，這些軟件簡(jiǎn)化了數(shù)據(jù)分析工作流程，減少了開(kāi)發(fā)定制軟件代碼的負(fù)擔(dān)，使MFA的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

表1 公開(kāi)可用的MFA軟件列表Tab.1 List of publicly available software tools for 13CMFA

1.5統(tǒng)計(jì)分析 MFA是對(duì)實(shí)際通量的模擬，估算的代謝通量值與實(shí)際實(shí)驗(yàn)測(cè)量結(jié)果有一定差異，有時(shí)存在較大偏差。因此估算代謝通量值后，必須評(píng)估擬合優(yōu)度，以確定擬合是否在統(tǒng)計(jì)學(xué)上可接受。在數(shù)據(jù)分析中，擬合優(yōu)度通過(guò)計(jì)算殘差平方和（sum of squared residual，SSR），即測(cè)量值與模擬值之間的加權(quán)平方差來(lái)評(píng)估［32］。CROWN等［39］建議對(duì)SSR進(jìn)行χ2統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，若SSR值落在統(tǒng)計(jì)可接受的范圍內(nèi)，則接受擬合；若SSR超出可接受范圍，則必須重新評(píng)估網(wǎng)絡(luò)模型和測(cè)量數(shù)據(jù)，直至獲得可接受的SSR值。另外，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析重要指標(biāo)之一是通量的置信區(qū)間，該指標(biāo)可反映通量值估算的確定性，確定準(zhǔn)確的置信區(qū)間有兩種首選方法：一種是基于評(píng)估SSR對(duì)通量變化的敏感性來(lái)模擬［40］，另一種是使用蒙特卡羅模擬。

2 MFA在CHO細(xì)胞代謝研究中的應(yīng)用

1999年，NYBERG等［41］利用MFA通過(guò)γ-CHO細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中驗(yàn)證來(lái)源于肽的氨基酸代謝，隨后20年來(lái)，MFA在CHO細(xì)胞代謝中的應(yīng)用得到迅速發(fā)展，現(xiàn)在可通過(guò)該技術(shù)從多方面深入研究CHO細(xì)胞代謝和營(yíng)養(yǎng)需求，包括代謝途徑、營(yíng)養(yǎng)底物優(yōu)化、代謝表型、細(xì)胞生長(zhǎng)階段、代謝工程等方面的研究。見(jiàn)表2［6-7，9，18-20，41-63］。

表2 MFA在CHO細(xì)胞代謝研究中的應(yīng)用情況Tab.2 Overview of metabolic flux analysis studies in metabolisn of CHO cells

2.1代謝途徑研究 MFA能夠表征細(xì)胞代謝能力，識(shí)別細(xì)胞代謝途徑的控制節(jié)點(diǎn)［64］，對(duì)某些代謝途徑的重要性進(jìn)行準(zhǔn)確描述。MFA所關(guān)注的途徑通常為中心碳代謝途徑，包括糖酵解、TCA、PPP途徑，也包括部分生物合成途徑，如氨基酸生物合成。NYBERG等［42］通過(guò)MFA估算得出CHO細(xì)胞表達(dá)的IFNγ糖基化與TCA通量有關(guān)，而不是糖酵解。SENGUPTA等［7］利用MFA研究CHO細(xì)胞晚期非增長(zhǎng)期的代謝，對(duì)糖酵解和PPP途徑分析表明，幾乎所有消耗的葡萄糖均流向PPP，且伴隨產(chǎn)生高水平的NADPH；幾乎所有糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸均進(jìn)入TCA，幾乎無(wú)乳酸產(chǎn)生。

2.2營(yíng)養(yǎng)底物優(yōu)化研究 MFA也能夠闡明CHO細(xì)胞如何響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)需求和替代補(bǔ)料［46，55-56，58，61］。谷氨酰胺是培養(yǎng)基中重要成分之一，添加的量對(duì)細(xì)胞代謝會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響，SHEIKHOLESLAMI等［55］對(duì)不同濃度的谷氨酰胺進(jìn)行了MFA比較，發(fā)現(xiàn)在蛋白表達(dá)期間許多關(guān)鍵的胞內(nèi)通量均受到谷氨酰胺含量影響；TORRES等［61］利用半乳糖和乳酸來(lái)代替葡萄糖，得到一個(gè)平衡更好和更有效的代謝表型。

2.3代謝表型比較的研究 許多研究通過(guò)MFA分析不同代謝表型的胞內(nèi)代謝或代謝差異的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，如DEAN等［19］將高表達(dá)表型與低表達(dá)表型的細(xì)胞系進(jìn)行MFA比較，研究其各自表型相關(guān)的內(nèi)在代謝譜；SHEIKHOLESLAMI等［54］也利用MFA進(jìn)行了誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)和無(wú)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的胞內(nèi)流量圖分布的比較研究，查找代謝差異；2017年，TEMPLETON等［65］利用MFA研究11株不同代謝表型的克隆細(xì)胞早期平臺(tái)期IgG表達(dá)對(duì)應(yīng)的代謝，發(fā)現(xiàn)表達(dá)抗細(xì)胞凋亡Bcl-2Δ基因的克隆細(xì)胞與IgG表達(dá)量增加相關(guān)。

2.4細(xì)胞生長(zhǎng)階段研究 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一，許多研究對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)的不同階段進(jìn)行了研究［6，18，52，57］，如TEMPLETON等［18］利用13C-MFA計(jì)算CHO細(xì)胞流加培養(yǎng)4個(gè)階段的代謝流，發(fā)現(xiàn)比生長(zhǎng)速率峰值與高乳酸產(chǎn)量和最小TCA有關(guān)，當(dāng)TCA和抗體表達(dá)量達(dá)到峰值時(shí)，比生長(zhǎng)速率持續(xù)減小；當(dāng)TCA和oxPPP通量達(dá)高值時(shí)，活細(xì)胞密度開(kāi)始下降。AHN等［52］通過(guò)MFA顯示，細(xì)胞增長(zhǎng)期至非增長(zhǎng)期胞內(nèi)代謝通量具有明顯的重新分配和變化，包括能量代謝、氧化還原代謝、oxPPP途徑和回補(bǔ)途徑。

2.5代謝工程研究 目前，較多研究是通過(guò)MFA闡明CHO細(xì)胞經(jīng)基因工程技術(shù)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)［42］、抗凋亡因子表達(dá)［9，57］、敲除某基因改造后的變化［62］，如TEMPLETON等［9］發(fā)現(xiàn)，表達(dá)Bcl-2Δ基因在乳酸產(chǎn)生階段通過(guò)胞內(nèi)丙酮酸再次流向線粒體氧化來(lái)減少乳酸的積累，且在乳酸消耗階段顯著增加了乳酸的再攝?。籛ILKENS等［62］利用CRISPR/Cas技術(shù)敲除LDHa基因，來(lái)提高細(xì)胞代謝。

3 小結(jié)與展望

MFA是一種用于確定活細(xì)胞內(nèi)代謝通量的技術(shù)，該方法所需的GC-MS、NMR等實(shí)驗(yàn)儀器較為昂貴，樣品處理、數(shù)據(jù)測(cè)定分析較復(fù)雜，且同位素標(biāo)記成本較高，因此在一定程度上阻礙了該技術(shù)的發(fā)展，但近年該技術(shù)已在代謝工程、系統(tǒng)生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)中廣泛應(yīng)用，是建立穩(wěn)定、高表達(dá)、質(zhì)量可控的重組CHO細(xì)胞株的強(qiáng)大工具之一。通過(guò)MFA技術(shù)可從多方面研究CHO細(xì)胞，如以碳為中心的代謝途徑、細(xì)胞培養(yǎng)不同階段、細(xì)胞代謝表型的比較、基因工程技術(shù)改造后的變化、替代補(bǔ)料的響應(yīng)、重組蛋白表達(dá)的差異等。隨著同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)不斷優(yōu)化，進(jìn)一步提高了通量估算的質(zhì)量，研究者能夠通過(guò)更高的準(zhǔn)確性和精確度來(lái)檢測(cè)表型中通量更細(xì)微的差異，微小通量變化將為改良CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，通過(guò)代謝工程優(yōu)化代謝途徑，使建立靈敏早期檢測(cè)代謝表型方法成為可能［14］。同時(shí)，MS和NMR不斷更新的方法能從13C標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中提取更多信息，該進(jìn)展使MFA可應(yīng)用于更廣泛的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，或有選擇性地檢測(cè)特定途徑。隨著同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)和優(yōu)化、標(biāo)記物信息測(cè)定新方法的建立和公開(kāi)軟件的持續(xù)開(kāi)發(fā)，MFA在CHO細(xì)胞代謝研究中的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛，越來(lái)越完善。