張國(guó)林，薛滿綜述，景榮先，邢以文審校

1.蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，江蘇 蘇州 215000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000；3.蘇州市立醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000

以嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cells，CAR-T）技術(shù)為代表的特異性過繼免疫療法是當(dāng)前腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)，主要利用機(jī)體免疫細(xì)胞的活性特異性地殺滅含有某種抗原表型的惡性腫瘤［1-2］。CAR-T免疫療法已成為繼外科手術(shù)、放射治療和化療之后的最有潛力的腫瘤治療方法，在白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤中臨床效果顯著，且在實(shí)體腫瘤治療方面潛力巨大［3-6］。CAR-T免疫療法能夠特異識(shí)別和殺傷表達(dá)蛋白類、糖類、脂類等特異抗原的腫瘤細(xì)胞，不受主要組織相容復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）和抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）的限制。CAR-T免疫療法具有精準(zhǔn)靶向性、活躍持久性和殺傷特異性等優(yōu)點(diǎn)，能夠通過分泌穿孔素等特定蛋白發(fā)揮作用，也可在體內(nèi)持續(xù)增殖并分泌多種細(xì)胞因子發(fā)揮治療作用。另外，CAR-T療法也可改善腫瘤免疫微環(huán)境對(duì)免疫細(xì)胞的抑制作用，并形成記憶T細(xì)胞獲得長(zhǎng)效的抗腫瘤機(jī)制。但CAR-T免疫療法也會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)和誘發(fā)諸如細(xì)胞因子風(fēng)暴、神經(jīng)系統(tǒng)毒性和基因修飾致成瘤風(fēng)險(xiǎn)等不良反應(yīng)［7-8］。未來應(yīng)從制定相關(guān)規(guī)范和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、尋找腫瘤特異抗原設(shè)計(jì)新靶點(diǎn)、強(qiáng)化CAR-T的特異性識(shí)別能力，優(yōu)化CAR-T制備工藝、篩選流程，強(qiáng)化質(zhì)量控制及產(chǎn)品放行等方面，加強(qiáng)CAR-T療法的研究及應(yīng)用。本文就CAR-T免疫療法的原理，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體腫瘤治療中的應(yīng)用及存在的挑戰(zhàn)作一綜述，為相關(guān)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供參考。

1 嵌合抗原受體（CAR）及CAR-T

1.1免疫治療和免疫治療細(xì)胞 免疫治療是針對(duì)機(jī)體免疫狀態(tài)亢進(jìn)或低下時(shí)采用人為干預(yù)的方式抑制或增強(qiáng)機(jī)體免疫功能以達(dá)到治療疾病的方法。腫瘤免疫治療主要通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)，依靠自身免疫機(jī)能殺滅腫瘤細(xì)胞［9-10］。免疫治療的分類方法有多種，根據(jù)所用的制劑類型可分為細(xì)胞治療、分子治療和免疫調(diào)節(jié)治療。免疫細(xì)胞是參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞。發(fā)揮免疫治療作用的細(xì)胞主要有CAR-T、樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）、細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T cell，CTL）、自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer cell，CIK）、DC刺激的CIK細(xì)胞、T細(xì)胞受體嵌合T細(xì)胞（T cell receptor chimeric T，TCR-T）等。

1.2C A R和C A R-T CAR為人工設(shè)計(jì)的全新的基因工程分子，基本結(jié)構(gòu)包括胞外抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)三部分。胞外抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)包括輕鏈和重鏈的單鏈可變區(qū)（single chain variable fragment，scFv），以非MHC限制性的方式直接識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA）或腫瘤特異性抗原（tumor-specific antigen，TSA）?？缒そY(jié)構(gòu)為富含脯氨酸的Ⅰ型跨膜蛋白形成的鉸鏈結(jié)構(gòu)，發(fā)揮連接胞外結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的作用。胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)為酪氨酸活化基序，執(zhí)行共刺激和向T細(xì)胞傳遞活化信號(hào)的作用。根據(jù)胞內(nèi)區(qū)共刺激-第二信使信號(hào)分子的構(gòu)成情況，CAR的發(fā)展已經(jīng)歷4代。第1至第3代CAR不改變嵌合抗原受體的胞內(nèi)和胞外基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，僅對(duì)CAR的基礎(chǔ)部件進(jìn)行替換和改進(jìn)。第4代CAR是在改變基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上構(gòu)建新的結(jié)構(gòu)或引入新的部件，如在原有結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上增加分泌免疫因子白細(xì)胞介素-12（IL-12）等的功能，并可引入自殺基因。第1代CAR打破了MHC的限制，實(shí)現(xiàn)了特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的目的，但T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的釋放能力不足等導(dǎo)致以第1代CAR為基礎(chǔ)的CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤效率不高。目前研究和臨床上以第2和第3代CAR應(yīng)用最為廣泛。第1至第3代嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)的發(fā)展歷程見圖1。

圖1 CAR結(jié)構(gòu)的發(fā)展歷程Fig.1 Development of CAR structure

CAR-T免疫療法屬于特殊的腫瘤免疫治療方式，是利用基因工程改進(jìn)自體（最終形成自體CAR-T）或異體（最終形成異體CAR-T）的免疫細(xì)胞來清除腫瘤細(xì)胞的新型細(xì)胞療法?；舅悸肥遣捎没蚬こ淌侄螌AA或TSA識(shí)別區(qū)基因與細(xì)胞內(nèi)共刺激-第二信使信號(hào)分子基因在體外構(gòu)建重組質(zhì)粒（即CAR基因）后，通過特定方法轉(zhuǎn)染至分離的T淋巴細(xì)胞，使T細(xì)胞表面表達(dá)腫瘤抗原受體蛋白［11-12］。上述經(jīng)基因工程改造的特殊T細(xì)胞經(jīng)純化并在體外大規(guī)模擴(kuò)增、篩選后制備的表達(dá)特異性嵌合抗原受體的T細(xì)胞即為CAR-T。目前體外重組子轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的方法主要有電穿孔法、逆轉(zhuǎn)錄病毒法和慢病毒法等，3種方法在轉(zhuǎn)染效率、安全性和適用范圍等方面存在一定差異性。CAR-T免疫療法通過基因工程的方法將識(shí)別TSA或TAA的CAR基因融合并修飾T細(xì)胞，滿足了特異性識(shí)別、結(jié)合、殺傷腫瘤抗原和T細(xì)胞自我更新的要求，可特異性殺滅特定腫瘤細(xì)胞［13-14］。CAR-T免疫療法在淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤治療中效果顯著，且在實(shí)體腫瘤的治療中有較大潛力［15-16］。CAR-T免疫療法治療效果的關(guān)鍵在于T細(xì)胞表面表達(dá)的人工改造的嵌合抗原受體的特性。CAR-T免疫療法的治療流程為：收集患者血液→除去血小板和紅細(xì)胞，分離T細(xì)胞→活化并進(jìn)行CAR基因修飾→T細(xì)胞的體外擴(kuò)增→擴(kuò)增后T細(xì)胞的篩選→輸回患者體內(nèi)。CAR-T免疫療法的治療流程見圖2。CAR-T療法每一個(gè)步驟均應(yīng)開展充分的工藝研究，確定最優(yōu)工藝參數(shù)。若同一步驟存在兩種及以上工藝，應(yīng)對(duì)兩種工藝均進(jìn)行驗(yàn)證，如外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）包括分離后使用和凍存后使用兩種工藝，應(yīng)對(duì)兩種工藝均進(jìn)行驗(yàn)證。

圖2 CAR-T免疫療法的治療流程Fig.2 Treatment process of CAR-T immunotherapy

與傳統(tǒng)的T細(xì)胞免疫治療相比，CAR-T細(xì)胞免疫療法具有一系列優(yōu)點(diǎn)，如更特異性地識(shí)別腫瘤抗原靶標(biāo)，無需APC參與、不受MHC限制［17-18］。CAR-T細(xì)胞免疫療法可通過共刺激分子增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫殺傷性，降低腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的機(jī)率。

2 CAR-T免疫治療的靶點(diǎn)及臨床應(yīng)用

2.1C A R-T免疫治療的靶點(diǎn)和作用機(jī)制 目前全球針對(duì)CAR-T進(jìn)行基礎(chǔ)和臨床研究的機(jī)構(gòu)有數(shù)百個(gè)，國(guó)外公司以瑞士諾華公司（Novartis）、凱特制藥公司（Kite Pharma）、朱諾醫(yī)療（Juno Therapeutics）等為代表，國(guó)內(nèi)公司有上海恒潤(rùn)達(dá)生生物科技有限公司、南京傳奇生物科技有限公司、復(fù)星凱特生物科技有限公司等。CAR-T免疫治療實(shí)質(zhì)上屬于靶點(diǎn)依賴型療法，其胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)與抗原的結(jié)合特性決定了CAR-T免疫治療的特異性、有效性和安全性［16，19］。CAR-T免疫治療的作用靶點(diǎn)有兩類，即TSA和TAA。已發(fā)現(xiàn)的TSA數(shù)量較少，除了TSA外，目前CAR-T免疫治療多圍繞腫瘤相關(guān)抗原展開。作為靶點(diǎn)的腫瘤抗原也在正常細(xì)胞表面表達(dá)，是造成CAR-T免疫療法脫靶效應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)毒性等副反應(yīng)的重要原因。針對(duì)腫瘤免疫治療新靶點(diǎn)的探索及研究從未停止。腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原，如Cluster of Differentiation 19（CD19）、CD20、CD30、CD33等均可作為CAR-T免疫治療各種腫瘤的潛在靶點(diǎn)。腫瘤相關(guān)抗原如間皮素（mesothelin，MSLN）、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2/3（epithelial growth factor receptor 2/3，HER2/3）、神經(jīng)節(jié)苷酯2（ganglioside，GD2）、前列腺特異性膜抗原（prostate specific membrane antigen，PSMA）和癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）等也可作為治療的潛在靶點(diǎn)，但應(yīng)注意脫靶效應(yīng)等副反應(yīng)的發(fā)生。目前已報(bào)道的部分腫瘤抗原靶點(diǎn)見表1。

表1 部分可作為靶點(diǎn)的腫瘤表面抗原Tab.1 Partial tumor surface antigens which may be used as target

2017年8月30日，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)諾華制藥公司用于治療兒童和青少年復(fù)發(fā)性/難治性急性B淋巴細(xì)胞白血病的CAR-T產(chǎn)品Kymriah（CTL019）上市，成為首個(gè)上市的CAR-T治療產(chǎn)品。Kymriah在治療復(fù)發(fā)性或難治性急性B淋巴細(xì)胞白血病方面效果顯著［20-22］。2017年10月19日，凱特制藥公司的Yescarta（KTE-C19）也被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療成人彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤［23-24］。上述兩個(gè)已被批準(zhǔn)上市的Kymriah和Yescarta均是以CD19作為靶點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)的。雖然目前CAR-T治療的應(yīng)用仍限制在無特效治療手段的晚期腫瘤患者，但隨著對(duì)特異性抗原靶點(diǎn)研究的深入和臨床應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估數(shù)據(jù)的積累，將有越來越多的患者適宜采用CAR-T治療。

CAR-T免疫療法可通過直接殺滅作用和形成長(zhǎng)效抗腫瘤機(jī)制發(fā)揮腫瘤治療作用。一方面，CAR-T直接與腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原結(jié)合后，通過釋放穿孔素、顆粒霉素B等直接殺傷腫瘤細(xì)胞；另一方面，CAR-T免疫療法也可通過釋放細(xì)胞因子募集人體內(nèi)源性免疫細(xì)胞殺滅腫瘤細(xì)胞，還可在治療后形成記憶T細(xì)胞獲得特異性的長(zhǎng)效抗腫瘤功能。

2.2C A R-T免疫療法在血液系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用CAR-T免疫療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療中的安全性和有效性已得到廣泛證實(shí)。FDA批準(zhǔn)的第1個(gè)CAR-T用于治療復(fù)發(fā)性/難治性B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。╮ecurrent/refractory B-cell acute lympho-blastic leukemia，r/r-ALL）［52］。另外，CAR-T用于治療慢性淋巴細(xì)胞白血病、肥大細(xì)胞白血病、彌漫性B細(xì)胞淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤均已處于臨床試驗(yàn)和實(shí)踐應(yīng)用階段［53-55］。CAR-T免疫療法治療B細(xì)胞復(fù)發(fā)/難治性急性淋巴細(xì)胞白血病具有較高的安全性和有效性。在對(duì)1例12歲女孩患者接受氟達(dá)拉濱、丁磺胺和環(huán)磷酰胺聯(lián)合CD19-CAR-T細(xì)胞作為治療方案的研究中發(fā)現(xiàn)，包括CD19-CAR-T調(diào)節(jié)聯(lián)合異基因造血干細(xì)胞移植治療r/r-ALL安全有效，提示CD19-CAR-T可作為低強(qiáng)度毒性治療r/r-ALL的一部分［56］。CD19-CAR-T治療的難治性/復(fù)發(fā)性急性淋巴細(xì)胞白血病患者獲得了更高的緩解率和更長(zhǎng)的生存期，也證實(shí)了CD19-CAR-T治療在r/r-ALL中的效果［57］。JACOBY等［58］在對(duì)21例r/r-ALL患者采用CD19-CAR-T治療時(shí)也發(fā)現(xiàn)，患者的治療緩解率達(dá)90%，但也同時(shí)伴隨有較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，其中16例患者出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合征，11例患者出現(xiàn)神經(jīng)毒性。雖然CD19-CAR-T治療對(duì)復(fù)發(fā)或難治性急性淋巴細(xì)胞白血病效果顯著，但嚴(yán)重的神經(jīng)毒性副反應(yīng)也應(yīng)引起重視。在對(duì)53例成人復(fù)發(fā)或難治性急性淋巴細(xì)胞白血病患者的治療中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)毒性的發(fā)生可能與CD19-CAR-T細(xì)胞以外的細(xì)胞成分有關(guān)，且系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)也與特征性神經(jīng)毒性癥狀存在一定相關(guān)性［59］。免疫逃逸和脫靶效應(yīng)等是影響CAR-T免疫療法臨床效果的重要方面。在急性髓系白血病細(xì)胞上同時(shí)定位CD123和CD33抗原可在治療急性髓系白血病的同時(shí)消除白血病干細(xì)胞，預(yù)防由于抗原逃逸或白血病干細(xì)胞持續(xù)引起的疾病復(fù)發(fā)［60］。CAR-T免疫療法用于血液系統(tǒng)腫瘤治療的臨床試驗(yàn)不斷增多，但仍需對(duì)該技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，包括探索腫瘤表面特異性靶抗原、優(yōu)化CAR的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和CAR-T的制備工藝及篩選方法，在不斷提高臨床治療效果的同時(shí)降低副反應(yīng)或不良反應(yīng)的發(fā)生率［61-62］。

2.3C A R-T免疫療法在實(shí)體腫瘤治療中的應(yīng)用CAR-T免疫療法在血液系統(tǒng)腫瘤治療中的安全性和有效性已經(jīng)得到廣泛的證實(shí)，但由于實(shí)體腫瘤復(fù)雜的生物學(xué)特性和高異質(zhì)性等特點(diǎn)，CAR-T免疫療法在實(shí)體腫瘤治療過程中的低浸潤(rùn)性、脫靶效應(yīng)等是臨床應(yīng)用的較大挑戰(zhàn)。同時(shí)，實(shí)體腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用也是影響CAR-T免疫療法用于實(shí)體腫瘤治療的不利因素［63-64］。

CAR-T免疫療法特異性或相關(guān)性抗原靶點(diǎn)的選擇是治療實(shí)體腫瘤的首要問題。血液腫瘤細(xì)胞表面存在CD19等特異性靶點(diǎn)是其有效治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的最主要原因。但實(shí)體腫瘤中特異性抗原靶點(diǎn)較少，相關(guān)性抗原靶點(diǎn)雖然在腫瘤組織中表達(dá)較高，但在正常組織中也有一定量的表達(dá)，最終會(huì)引起脫靶效應(yīng)等，對(duì)其臨床治療造成障礙。雖然目前尚無CAR-T免疫療法被批準(zhǔn)用于實(shí)體腫瘤的治療，但針對(duì)腫瘤表面不同抗原設(shè)計(jì)的CAR-T免疫療法在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）、胃癌等實(shí)體腫瘤的治療應(yīng)用中已經(jīng)廣泛開展［65-67］。EGFR為實(shí)體腫瘤表面的相關(guān)性抗原靶點(diǎn)，據(jù)此設(shè)計(jì)的EGFR-CAR-T細(xì)胞與靶細(xì)胞孵育后，細(xì)胞因子的分泌顯著增加，且EGFR-CAR-T細(xì)胞對(duì)下咽癌腫瘤細(xì)胞的殺傷作用高于CAR-T對(duì)照組，證實(shí)EGFRCAR-T免疫療法對(duì)下咽癌有顯著的治療作用［68］。NSCLC的有效治療是腫瘤治療領(lǐng)域最有挑戰(zhàn)的課題之一。經(jīng)EGFR修飾的CAR-T細(xì)胞在體外表現(xiàn)出時(shí)間和抗原依賴性的擴(kuò)張能力和抗癌效果，在體內(nèi)也顯示出明顯的消退肺癌轉(zhuǎn)移瘤的作用，即EGFRCAR-T治療是提高NSCLC過繼免疫治療有效性的方法［67］。EGFR-CAR-T免疫治療有望成為NSCLC治療的新思路。HER2蛋白在胃癌中高比例表達(dá)并影響腫瘤干細(xì)胞亞群的維持，是臨床治療HER2陽性胃癌的靶點(diǎn)［69-70］。以不依賴MHC的方式激活HER2-CAR-T可有效殺死HER2陽性胃癌細(xì)胞，且與未轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞相比，HER2-CAR-T細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤抑制能力，提示CAR-T免疫療法在HER2陽性晚期胃癌患者中具有較好的應(yīng)用前景［71］。雖然目前尚無CAR-T免疫療法被批準(zhǔn)用于實(shí)體腫瘤的治療，但研究證實(shí)，HER2-CAR-T細(xì)胞可在體內(nèi)外殺死葡萄膜和皮膚黑色素瘤細(xì)胞，且HER2-CAR-T也能殺死對(duì)過繼性T細(xì)胞移植耐藥患者的黑色素瘤細(xì)胞［72］。探索實(shí)體腫瘤特異性的表面抗原（尤其是特異性抗原）、改善腫瘤微環(huán)境對(duì)CAR-T免疫療法的抑制作用、降低副反應(yīng)或不良反應(yīng)的發(fā)生率將是CAR-T免疫療法治療實(shí)體腫瘤的探索方向。

3 CAR-T治療存在的問題

通過設(shè)計(jì)不同類型的CAR基因，可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的個(gè)體化精準(zhǔn)治療。CAR-T免疫治療在血液系統(tǒng)惡性腫瘤及實(shí)體腫瘤的治療中均表現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。但同時(shí)，CAR-T免疫治療后患者會(huì)出現(xiàn)脫靶效應(yīng)及各種副反應(yīng)，如神經(jīng)系毒性、細(xì)胞因子風(fēng)暴、基因修飾致瘤風(fēng)險(xiǎn)等，部分嚴(yán)重的副反應(yīng)甚至?xí)＜盎颊叩纳?/p>

3.1脫靶效應(yīng) 脫靶效應(yīng)是CAR-T免疫治療最主要的風(fēng)險(xiǎn)。CAR-T細(xì)胞能高效識(shí)別、親和TAA，但當(dāng)正常組織也表達(dá)與腫瘤相同的TAA抗原時(shí)，CAR-T細(xì)胞則無法區(qū)分正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而對(duì)正常組織和細(xì)胞也造成攻擊損傷［73］。理想的目標(biāo)抗原應(yīng)為特異性抗原，即僅在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)而不在正常細(xì)胞表面表達(dá)的TSA。CAR-T免疫療法對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤臨床效果顯著的原因之一就是其特異性表面抗原。目前作為實(shí)體腫瘤靶點(diǎn)的大多數(shù)腫瘤抗原通常在正常細(xì)胞中也有低水平的表達(dá)，最終會(huì)引起脫靶效應(yīng)的發(fā)生。CAR-T攻擊表達(dá)目標(biāo)抗原的正常細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致正常細(xì)胞死亡和臟器損傷，甚至?xí)＜盎颊呱?。識(shí)別腫瘤表面特異性抗原并建立T細(xì)胞表面表達(dá)體系對(duì)避免脫靶效應(yīng)的發(fā)生意義重大。因此，尋找腫瘤表面特異抗原是CAR-T免疫技術(shù)研究和臨床應(yīng)用的首要任務(wù)之一。

3.2神經(jīng)系統(tǒng)毒性 CAR-T免疫治療會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)毒性，也稱為CAR-T相關(guān)腦病綜合征。神經(jīng)系統(tǒng)毒性癥狀包括運(yùn)動(dòng)障礙、嗜睡、譫妄、語言障礙、癲癇等。CAR-T免疫治療產(chǎn)生的神經(jīng)系統(tǒng)毒性可能與細(xì)胞因子被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入腦部有關(guān)，但其確切機(jī)制尚不明確。已有的證據(jù)提示，神經(jīng)系統(tǒng)毒性可能與細(xì)胞因子風(fēng)暴同時(shí)發(fā)生，但也可能發(fā)生在細(xì)胞因子風(fēng)暴消退后［74-76］。CAR-T免疫治療的神經(jīng)系統(tǒng)毒性按照嚴(yán)重程度可分為5級(jí)，輕度的神經(jīng)系統(tǒng)毒性通常是自限性的，可自行緩解，但重度神經(jīng)系統(tǒng)毒性可能會(huì)危及患者生命，需進(jìn)行干預(yù)治療［77-78］。

3.3細(xì)胞因子風(fēng)暴 也稱為細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS），是臨床應(yīng)用CAR-T治療的最常見的急性不良反應(yīng)［79］。CRS通常發(fā)生于患者接受治療后的6~20 d。CAR-T細(xì)胞單鏈抗體可變區(qū)與靶抗原相互接觸活化后，在清除腫瘤細(xì)胞的同時(shí)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)-共刺激分子雙重信號(hào)刺激會(huì)引起CAR-T釋放大量的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素γ（IFNγ）、白細(xì)胞介素和C反應(yīng)蛋白等炎癥因子，誘發(fā)炎性反應(yīng)。產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)進(jìn)而造成機(jī)體組織和器官的損害。細(xì)胞因子風(fēng)暴會(huì)誘發(fā)患者發(fā)生呼吸衰竭、發(fā)熱、疲勞、低血壓、心動(dòng)過速以及毛細(xì)血管滲透綜合征等［80］。CRS損害的嚴(yán)重程度與患者腫瘤負(fù)荷、靶抗原密度以及接受到的CAR-T數(shù)量有關(guān)。根據(jù)發(fā)生的嚴(yán)重程度CRS可分為5級(jí)，其中≥3級(jí)為嚴(yán)重CRS。輕度的CRS通常是自限性的，但重度CRS可能會(huì)危及患者生命，需密切關(guān)注并采取干預(yù)措施。目前認(rèn)為白細(xì)胞介素家族成員（IL-6、IL-10和IL-13）、C反應(yīng)蛋白、TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP1）等可作為預(yù)測(cè)CRS嚴(yán)重程度的參考指標(biāo)。

3.4基因修飾風(fēng)險(xiǎn) CAR-T免疫療法是基因治療與細(xì)胞治療相結(jié)合的產(chǎn)物。雖然采用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒可將CAR基因整合至T細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)CAR基因的穩(wěn)定表達(dá)，但CAR基因整合位點(diǎn)的不確定性也可能導(dǎo)致CAR-T免疫治療造成潛在的致瘤性風(fēng)險(xiǎn)［81-82］。因此，采用新型的轉(zhuǎn)導(dǎo)方式以降低CAR-T的致瘤性風(fēng)險(xiǎn)也是CAR-T免疫療法研究的方向之一。

3.5疾病復(fù)發(fā) CAR-T免疫療法在治療惡性腫瘤中顯示了較好的臨床效果，但部分患者也存在復(fù)發(fā)的現(xiàn)象。白血病患者在接受CD19-CAR-T治療后多數(shù)患者能夠得到緩解，但少數(shù)患者在治療一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)的情況，其主要原因可能是由于白血病腫瘤細(xì)胞的CD19抗原丟失導(dǎo)致CD19-CAR-T無法識(shí)別，造成抗原的逃逸引起的［83-85］。設(shè)計(jì)雙特異性嵌合抗原受體基因修飾T細(xì)胞能降低因抗原逃逸而導(dǎo)致的白血病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

3.6實(shí)體腫瘤微環(huán)境與免疫耐受 實(shí)體腫瘤微環(huán)境中存在大量的免疫抑制分子，與成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)等一起構(gòu)成巨大的免疫抑制網(wǎng)［86］。實(shí)體腫瘤微環(huán)境免疫抑制網(wǎng)能過分泌大量的白細(xì)胞介素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等細(xì)胞因子，嚴(yán)重抑制CAR-T對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制和殺滅作用。因此，避免實(shí)體腫瘤微環(huán)境的抑制作用是CAR-T免疫療法用于實(shí)體腫瘤必須解決的問題。將CAR基因與IL-4和IL-7等細(xì)胞因子受體結(jié)合是提高CAR-T細(xì)胞對(duì)抗腫瘤微環(huán)境免疫抑制性、發(fā)揮抗腫瘤活性的策略之一［87］。

4 展望

CAR-T免疫治療是目前最有潛力的腫瘤治療方法。但國(guó)內(nèi)尚缺乏CAR-T細(xì)胞的制備及質(zhì)量控制的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)及管理規(guī)范，限制了制備機(jī)構(gòu)和應(yīng)用機(jī)構(gòu)之間的有效交流。為了更好地控制CAR-T的質(zhì)量，發(fā)揮更佳的治療效果、降低不良反應(yīng)的發(fā)生，應(yīng)從以下幾個(gè)方面加強(qiáng)：①制定確保CAR-T細(xì)胞制劑安全和可追溯的質(zhì)量控制體系及管理規(guī)范，確保CAR-T治療的有效性、安全性和規(guī)范性；②尋找腫瘤細(xì)胞的特異性抗原并設(shè)計(jì)CAR-T，強(qiáng)化T細(xì)胞識(shí)別能力；③優(yōu)化CAR-T的制備工藝及篩選流程，降低副反應(yīng)和不良反應(yīng)的發(fā)生。CAR-T療法屬于自體（自體CART療法）或異體（異體CAR-T療法）T細(xì)胞療法，治療過程涉及抽血、分離、激活、轉(zhuǎn)染、擴(kuò)增、制劑、放行、凍干、運(yùn)輸和給藥，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，條件要求高，因此，必須優(yōu)化制備工藝及篩選流程、縮短生產(chǎn)周期、降低用藥成本；④加強(qiáng)CAR-T細(xì)胞制劑的質(zhì)量控制，完善產(chǎn)品放行標(biāo)準(zhǔn)。制劑的質(zhì)量控制參數(shù)包括但不局限于鑒別、轉(zhuǎn)染效率、效價(jià)、T細(xì)胞亞群、細(xì)胞存活率以及安全性指標(biāo)（無菌檢查、支原體檢測(cè)、內(nèi)毒素檢測(cè)、致瘤細(xì)胞殘留、核酸殘留、殘余磁珠量、培養(yǎng)基及添加劑殘留量等）。CAR-T療法的每個(gè)產(chǎn)品均為獨(dú)立批次，需要完整的放行檢測(cè)。由于CAR-T免疫療法的時(shí)效性要求較高，需探索快速、高效的檢測(cè)方法。據(jù)估計(jì)，CAR-T的質(zhì)控成本可能遠(yuǎn)高于工藝成本；⑤腫瘤治愈或緩解患者體內(nèi)殘存的CAR-T的消除。在設(shè)計(jì)CAR時(shí)在原有結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上一方面增加分泌免疫因子功能，一方面引入自殺基因就是一個(gè)思路；⑥探索CAR-T免疫治療不良反應(yīng)的應(yīng)對(duì)措施，降低治療過程中不良反應(yīng)的損害。

CAR-T作為一個(gè)新興的治療領(lǐng)域取得了較大的進(jìn)展，但也存在諸多挑戰(zhàn)，如多種新技術(shù)進(jìn)入該領(lǐng)域后的安全性評(píng)估，起始材料差異性大與生產(chǎn)工藝一致性的難調(diào)和等。目前CAR-T免疫治療領(lǐng)域尚無足夠的相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估數(shù)據(jù)。因此，基于CAR-T治療個(gè)體化、產(chǎn)量小和批次有限等特點(diǎn)，需要在原材料及輔料控制、生產(chǎn)制備工藝、安全性評(píng)價(jià)等方面進(jìn)一步突破。在以后的研究和應(yīng)用中應(yīng)著重解決CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品的安全性、有效性、質(zhì)量可控性和生產(chǎn)工藝的一致性，在確保治療效果和安全性的基礎(chǔ)上不斷突破使用人群的限制。