王富偉 ， 梁冰純 ， 趙文鵬 ， 朱春燕 ， 高 健

( 1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司 ， 北京 大興 100076 ；3.上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心 ， 上海 青浦 201708)

奶牛乳房炎是病原菌進(jìn)入乳房?jī)?nèi)引起的乳腺組織炎癥，可分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎[1]。隱性乳房炎(Subclinical mastitis,SCM)會(huì)導(dǎo)致奶牛的產(chǎn)奶量和繁育能力下降。由于沒(méi)有明顯的臨床癥狀，無(wú)法及時(shí)治療，因此，該病給規(guī)?；膛?chǎng)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。近年來(lái)，隱性乳房炎在亞洲國(guó)家的流行率已經(jīng)超過(guò)50%[4]。河北省作為中國(guó)奶牛養(yǎng)殖的第三大省，也面臨著隱性乳房炎高發(fā)的問(wèn)題。葡萄球菌是一種革蘭陽(yáng)性菌，通常包括金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase negativeStaphylococci,CNS)(如產(chǎn)色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血性葡萄球菌等)，在感染奶牛乳腺后會(huì)引發(fā)隱性乳房炎。目前，針對(duì)主要病原菌引起的隱性乳房炎采取的措施包括泌乳期治療新發(fā)病例、淘汰慢性病例或干奶期治療，均有助于降低傳染性或環(huán)境性乳房炎的發(fā)病率，提高奶牛場(chǎng)效益[5]。隨著細(xì)菌抗生素耐藥性的增加以及超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)，尋找替代療法和改善防控措施至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)對(duì)象 從河北地區(qū)19個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)(存欄600～2 500頭)中隨機(jī)抽取495頭奶牛，采集1 819份乳區(qū)乳樣，進(jìn)行隱性乳房炎檢測(cè)。

1.2 隱性乳房炎檢測(cè) 用加州乳房炎檢測(cè)法(CMT)進(jìn)行測(cè)定。隱性乳房炎評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：奶樣中體細(xì)胞數(shù)(SCC)0～20萬(wàn)/mL時(shí)為“-”；20萬(wàn)～50萬(wàn)/mL時(shí)為“±”；50萬(wàn)～80萬(wàn)/mL時(shí)為“+”；80萬(wàn)～500萬(wàn)/mL時(shí)為“++”；500萬(wàn)/mL以上時(shí)為“+++”。

1.3 收集奶樣 棄去前3把奶，無(wú)菌收集奶樣，樣品采集后標(biāo)明牛號(hào)及日期，4 ℃保存并盡快進(jìn)行病原菌培養(yǎng)。

1.4 病原菌分離與鑒定 參照Gao等[6]的方法進(jìn)行病原菌的分離與鑒定。

1.5 藥物敏感性試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行CNS的藥敏試驗(yàn)。將分離得到的CNS分別接種至BHI培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)24 h(37 ℃，220 r/min)制成懸液，稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，用滅菌棉簽蘸取適量菌液均勻涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基表面，貼藥敏紙片(青霉素、頭孢氨芐、頭孢噻呋、克林霉素和萬(wàn)古霉素)。置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑(mm)。根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)(2017年)[7]藥敏試驗(yàn)國(guó)標(biāo)判定標(biāo)準(zhǔn)，分為敏感株(S)和耐藥株(R)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0偏相關(guān)分析的方法對(duì)河北地區(qū)奶牛乳房炎的流行情況進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 隱性乳房炎的乳區(qū)流行率 如圖1所示，共檢出隱性乳房炎陽(yáng)性乳區(qū)乳樣266份，乳區(qū)陽(yáng)性率為15%；本試驗(yàn)調(diào)查的19個(gè)牛場(chǎng)中存欄、隱性乳房炎檢測(cè)牛、檢測(cè)乳區(qū)和隱性乳房炎陽(yáng)性乳區(qū)數(shù)量這4個(gè)變量?jī)蓛芍g的關(guān)系，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，存欄、隱性乳房炎檢測(cè)牛、檢測(cè)乳區(qū)和隱性乳房炎陽(yáng)性乳區(qū)兩兩間不存在顯著的相關(guān)關(guān)系(正相關(guān)和負(fù)相關(guān))，即隱性乳房炎陽(yáng)性乳區(qū)、檢測(cè)乳區(qū)、隱性乳房炎檢測(cè)牛和存欄量不會(huì)隨存欄、隱性乳房炎檢測(cè)牛、檢測(cè)乳區(qū)和隱性乳房炎陽(yáng)性乳區(qū)的增加(或減少)而增加(或減少)；但是在存欄和隱性乳房炎檢測(cè)牛數(shù)一定的情況下，檢測(cè)乳區(qū)和隱性乳房炎陽(yáng)性乳區(qū)之間呈顯著負(fù)相關(guān)(P=-0.061)。

圖1 河北地區(qū)隱性乳房炎樣本采集及檢測(cè)情況

2.2 隱性乳房炎的病原菌分布 如圖2所示，在266份隱性乳房炎陽(yáng)性乳樣中，檢出CNS 95株(36%)、無(wú)乳鏈球菌18株(7%)、肺炎克雷伯菌17株(6%)、乳房鏈球菌15株(6%)、大腸埃希菌15株(6%)、棒狀桿菌14株(5%)、停乳鏈球菌8株(3%)和其他病原菌10株(4%)；此外，混合感染18份(7%)、污染15份(6%)和無(wú)生長(zhǎng)41份(15%)。

圖2 不同感染類(lèi)型奶樣的陽(yáng)性情況

2.3 隱性乳房炎級(jí)別與病原菌類(lèi)型的相關(guān)性 CMT檢測(cè)結(jié)果顯示(表1)，在“+、++、+++”中，感染CNS樣本量最多(49份、32份、14份)；其中，“+”占比最高(52%)，“+++”占比最低(15%)。在“+”中，感染停乳鏈球菌樣本量最少(4份)；在“++”中，感染無(wú)乳鏈球菌樣本量最少(2份)；在“+++”中，感染肺炎克雷伯菌、棒狀桿菌和停乳鏈球菌樣本量最少(0份)。在已檢測(cè)出病原菌樣本中，CNS、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌和棒狀桿菌感染樣本易呈“+”；乳房鏈球菌感染樣本易呈“++”；無(wú)乳鏈球菌感染樣本易呈“+++”。

表1 不同病原菌感染的體細(xì)胞評(píng)分情況

2.4 凝固酶陰性葡萄球菌耐藥性 如圖3所示，CNS對(duì)青霉素耐藥率高達(dá)87%，對(duì)克林霉素(33%)、頭孢噻呋(29%)和頭孢氨芐(20%)耐藥性較高，對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥率為7%。

圖3 95株凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)檢測(cè)抗生素的耐藥率

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，河北地區(qū)19個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)495頭奶牛中隱性乳房炎乳區(qū)陽(yáng)性率為15%。據(jù)高健[8]報(bào)道，2012年調(diào)查的8個(gè)河北地區(qū)規(guī)模化奶牛場(chǎng)228頭奶牛中隱性乳房炎乳區(qū)陽(yáng)性率為28.2%。由此可見(jiàn)，近年來(lái)河北地區(qū)隱性乳房炎乳區(qū)陽(yáng)性率呈下降趨勢(shì)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，CNS為河北地區(qū)隱性乳房炎的主要病原菌。2012年我國(guó)奶牛隱性乳房炎最主要病原菌為CNS、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌[8]。在我國(guó)奶牛臨床型乳房炎主要病原菌中，革蘭陽(yáng)性球菌分離率高于革蘭陰性桿菌[6]。因此，革蘭陽(yáng)性球菌是河北地區(qū)隱性乳房炎的防控關(guān)鍵。

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，CNS對(duì)青霉素有較高耐藥率，對(duì)克林霉素、頭孢噻呋、頭孢氨芐耐藥率其次，對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥率最低。據(jù)Cheng等[9]報(bào)道，2018年中國(guó)大型奶牛場(chǎng)CNS對(duì)苯唑西林(84%)和青霉素(62%)有較高耐藥性。其中，恩諾沙星-苯唑西林-青霉素-四環(huán)素是CNS最常見(jiàn)的多重耐藥模式。

在過(guò)去10年中，CNS已被許多國(guó)家認(rèn)為是奶牛(尤其是頭胎牛)乳房炎的主要病原菌，其中最常見(jiàn)的種類(lèi)為產(chǎn)色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、擬葡萄球菌和木糖葡萄球菌[10-11]。據(jù)Qu等[11]報(bào)道，我國(guó)最常見(jiàn)的CNS為產(chǎn)色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌和表皮葡萄球菌。CNS主要引起隱性和輕度臨床型乳房炎，相關(guān)病原菌可分為傳染性和環(huán)境性?xún)深?lèi)[12]。其中，傳染性病原菌來(lái)源單一，主要為患病牛的乳區(qū)，并通過(guò)媒介(奶襯、毛巾或擠奶工的手等)在奶牛之間傳播；而環(huán)境性病原菌來(lái)源較廣，包括牛舍、墊料、糞便、行走通道、奶牛皮膚等，但不會(huì)在奶牛之間傳播。

由于河北地區(qū)隱性乳房炎主要病原菌為CNS，根據(jù)其特點(diǎn)，需從以下3個(gè)方面加強(qiáng)防控。首先，加強(qiáng)牛體衛(wèi)生管理。奶牛乳頭是病原菌入侵的主要端口，為了預(yù)防隱性乳房炎，需要對(duì)產(chǎn)后奶牛乳頭進(jìn)行嚴(yán)格消毒，例如使用紙巾或毛巾浸潤(rùn)消毒劑對(duì)產(chǎn)后乳頭進(jìn)行消毒。同時(shí)，要求擠奶工佩戴橡膠手套，并在擠奶前對(duì)奶杯進(jìn)行清潔和消毒[13]。其次，加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生管理。由于環(huán)境中存在隱性乳房炎病原菌，因此需要注意對(duì)牛舍、臥床、墊料、飲水和奶廳的清潔消毒。最后，加強(qiáng)奶牛干奶期管理。通過(guò)使用乳頭內(nèi)封閉劑和干奶牛抗生素療法，完善干奶牛營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境管理等，從而有效預(yù)防隱性乳房炎的發(fā)生。