金盞花精油的微波輔助提取及其成分與抗氧化活性研究

劉 歡，趙巨堂，何 力，羅海濤，熊文俊，鄒恩凱,

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047；2.江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，江西南昌 330096）

金盞花（Calendula officinalisL.）是菊科金盞菊屬植物，別名金盞菊、盞盞菊等。其在世界各地均有廣泛種植，尤其以歐洲及美國為主[1]，目前在國內(nèi)主要分布于四川、安徽、廣西、廣東等地。金盞花中不僅含有糖類、脂肪、氨基酸等基本營養(yǎng)物質(zhì)[2]，還富含類胡蘿卜素、類固醇、三萜皂苷、黃酮等有效成分，具有很強(qiáng)的健胃、收斂、止血和愈傷的功效，此外還有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)細(xì)胞再生等藥理作用[3?4]。精油作為金盞花中主要活性組分之一，其優(yōu)異的抗菌、抗氧化等功效，正受到消費(fèi)者及研究人員的關(guān)注。

水蒸氣蒸餾法是提取精油最為常用的方法之一，可以較好地保留原料的香氣，且工藝及設(shè)備都較為簡(jiǎn)單，但耗時(shí)長(zhǎng)，能耗高。近年來微波輔助法以其快速省時(shí)、節(jié)約能耗的特點(diǎn)在植物精油的提取中廣泛應(yīng)用，并取得了較好效果，微波輻射所產(chǎn)生的熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)都可以加速活性物質(zhì)的溶出，從而使目標(biāo)產(chǎn)物得率上升，而且不會(huì)改變精油的成分組成[5]。很多研究者利用微波輔助水蒸氣蒸餾法對(duì)許多植物原料的精油進(jìn)行了提取。楊婷等[6]采用微波輔助水蒸氣提取法對(duì)香桂葉精油進(jìn)行了提取，經(jīng)過優(yōu)化后得率達(dá)到了4.43%，與單一水蒸氣提取相比得率上升了0.14%，同時(shí)達(dá)到了減少耗時(shí)、提高效率的目的。李曉嬌等[7]利用微波結(jié)合水蒸氣蒸餾法提取的清香木葉精油得率最高可達(dá)到2.09%，對(duì)比超聲波輔助法（1.78%）和蒸餾萃取法（0.93%）精油得率顯著提高。Farhat等[8]利用微波蒸氣擴(kuò)散法提取橙皮精油，與普通蒸餾法相比得到了相似的得率，但是極大縮短了提取時(shí)間，而且含有相同數(shù)量的揮發(fā)性次生代謝物，且產(chǎn)率相近。綜上，微波輔助水蒸氣蒸餾法是一種綠色、高效的精油提取方法。

目前，關(guān)于金盞花精油的研究多集中在化學(xué)成分的鑒定和比較，而有關(guān)其工藝和抗氧化活性的研究還不充分。本研究在傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法基礎(chǔ)上結(jié)合微波輔助，以干燥的金盞花為原料，優(yōu)化了制備金盞花精油的三項(xiàng)關(guān)鍵工藝參數(shù)，并用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法對(duì)金盞花精油的化學(xué)組分及含量進(jìn)行鑒定分析，檢測(cè)了其體外抗氧化性。本研究將為金盞花精油的大規(guī)模生產(chǎn)提供較為可靠的工藝參數(shù)，并為探索其作為天然抗氧化劑的潛力提供理論依據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金盞花花瓣 產(chǎn)自內(nèi)蒙古，亳州市連銳商貿(mào)有限公司；無水硫酸鈉、水楊酸、30%過氧化氫、過硫酸鉀、抗壞血酸、氯化鈉、正己烷、無水乙醇、七水合硫酸亞鐵（均為分析純） 西隴科學(xué)股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2 ,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）（均為分析純） 索萊寶生物科技有限公司。

GZX-9420 MBE鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DFY-500中藥粉碎機(jī) 大德中藥機(jī)械有限公司；KE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-III型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；Agilent7890-7000A氣相色譜-三重串接四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司；ZNHW型智能恒溫電熱套 上海錦岐儀器設(shè)備有限公司；LE2202E電子天平 梅特勒托利多儀器有限公司；U-T6紫外可見分光光度計(jì) 屹譜儀器制造有限公司；BD/BC-218E冰柜 浙江星星冷鏈集成股份有限公司；WBFY-205型微波化學(xué)反應(yīng)器 上海秋佐科學(xué)儀器有限公司；VORTEX 3旋渦振蕩器 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金盞花精油的提取 參考段賓賓等[9]的提取方法并做出一些改動(dòng)：將干燥的金盞花粉碎，過60目篩子，得到金盞花粉末。量取50 g金盞花粉末于5000 mL燒瓶中，加水后經(jīng)微波加熱再進(jìn)行水蒸氣蒸餾，探究提取時(shí)間（2、3、4、5、6 h）、NaCl質(zhì)量濃度（1%、2%、3%、4%、5%）、料液比（1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 g/mL）、微波功率（80、240、400、640、800 W）、微波時(shí)間（2、4、6、8、10 min）五個(gè)因素對(duì)精油得率的影響，蒸餾結(jié)束后用10 mL正己烷把上層金黃色的金盞花精油萃取出來放入50 mL離心管，然后加入適量無水硫酸鈉，再放入?18 ℃的冰箱冷凍8 h，將固體濾除后減壓蒸發(fā)，即得金盞花精油。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 提取時(shí)間對(duì)精油得率的影響 將50 g金盞花粉置于蒸餾燒瓶中，按照1:40 g/mL料液比與水混合再加3%質(zhì)量濃度的NaCl，經(jīng)過6 min功率為400 W的微波輻射后蒸餾提取一定時(shí)間，后續(xù)操作如1.2.1所述，觀察了金盞花精油在2、3、4、5、6 h的蒸餾時(shí)長(zhǎng)下產(chǎn)量的變化。

1.2.2.2 NaCl濃度對(duì)精油得率的影響 將50 g金盞花粉置于蒸餾燒瓶中，按照1:40 g/mL料液比與水混合再加一定量的NaCl，經(jīng)過6 min功率為400 W的微波輻射后蒸餾提取4 h，后續(xù)操作如1.2.1所述，觀察了金盞花精油在1%、2%、3%、4%、5%質(zhì)量濃度的NaCl條件下產(chǎn)量的變化。

1.2.2.3 料液比對(duì)精油得率的影響 將50 g金盞花粉置于蒸餾燒瓶中，按照一定料液比與水混合再加3%質(zhì)量濃度NaCl，經(jīng)過6 min功率為400 W的微波輻射后蒸餾提取4 h，后續(xù)操作如1.2.1所述，觀察了金盞花精油在1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 g/mL料液比條件下產(chǎn)量的變化。

1.2.2.4 微波功率對(duì)精油得率的影響 準(zhǔn)確稱取50 g金盞花粉于蒸餾燒瓶中，按照1:30 g/mL料液比與水混合再加3%質(zhì)量濃度NaCl，在一定功率下微波輻射6 min后蒸餾提取4 h，后續(xù)操作如1.2.1所述，觀察了金盞花精油在80、240、400、640、800 W微波功率條件下產(chǎn)量的變化。

1.2.2.5 微波時(shí)間對(duì)精油得率的影響 準(zhǔn)確稱取50 g金盞花粉于蒸餾燒瓶中，按照1:30 g/mL料液比加入水以及3%質(zhì)量濃度NaCl，經(jīng)過功率為240 W的微波輻射一定時(shí)間后蒸餾提取4 h，后續(xù)操作如1.2.1所述，觀察了金盞花精油在2、4、6、8、10 min微波時(shí)間條件下產(chǎn)量的變化。

1.2.3 正交試驗(yàn) 參照單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以金盞花精油得率為指標(biāo)，選取三個(gè)得率波動(dòng)較大的因素（NaCl濃度、料液比、微波功率）進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，其他兩項(xiàng)因素水平固定在提取時(shí)間4 h，微波時(shí)間8 min。試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平安排如表1。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 金盞花精油得率的計(jì)算

1.2.5 GC-MS分析金盞花精油成分

1.2.5.1 色譜條件 色譜柱：HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫至120 ℃，保持3 min，再以4 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，流量：1 mL/min，進(jìn)樣量：1 μL；分流比：30:1。

1.2.5.2 質(zhì)譜條件 電離方式EI，電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃，溶劑延遲：4 min;掃描離子質(zhì)量范圍：35～550 amu。對(duì)照質(zhì)譜庫NIST08結(jié)合參考文獻(xiàn)進(jìn)行成分定性，使用面積歸一化法計(jì)算金盞花精油各組分的相對(duì)含量。

1.2.6 金盞花精油對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定 參考蘇瑾等[10]的方法：將1 mL精油-無水乙醇稀釋液用移液槍轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中，再移取1 mmol/L的DPPH反應(yīng)液3 mL，渦旋后在陰暗條件下反應(yīng)30 min，測(cè)得混合液在517 nm下的吸光值A(chǔ)1，無水乙醇代替精油測(cè)得A0，無水乙醇代替DPPH反應(yīng)液測(cè)得A2，用無水乙醇作調(diào)零，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照，平行操作重復(fù)3次。清除率按下式計(jì)算：

式中：R：清除率，%；A0：空白組吸光值；A1：樣品組吸光值；A2：無水乙醇代替DPPH反應(yīng)液所得吸光值。

1.2.7 金盞花精油對(duì)羥自由基清除能力測(cè)定 參考范三紅等[11]和刑穎等[12]的方法：首先用移液槍移取6 mmol/L的FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液各1 mL加入到5 mL離心管中，再移取1 mL精油-無水乙醇稀釋液，最后加入1 ml 6 mmol/L H2O2于37 ℃水浴30 min，在510 nm下測(cè)定吸光度值A(chǔ)1，蒸餾水代替精油測(cè)得A0，蒸餾水代替H2O2測(cè)得A2，用無水乙醇調(diào)零，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照，平行操作重復(fù)3次。清除率按下式計(jì)算：

式中：R：清除率，%；A0：空白組吸光值；A1：樣品組吸光值；A2：蒸餾水代替H2O2所得吸光值。

1.2.8 ABTS+自由基清除能力測(cè)定 參考李娜等[13]的方法：分別用10 mL容量瓶以蒸餾水為溶劑配制好7 mmol/L ABTS溶液與2.5 mmol/L過硫酸鉀溶液后在燒杯中混合，避光保存16 h后即為ABTS儲(chǔ)備液，然后用無水乙醇將其稀釋成734 nm下OD值為0.70±0.02的淡綠色的ABTS工作液。將1 mL精油?無水乙醇稀釋液與2 mL上述工作液在5 mL離心管中混合后于陰暗條件下反應(yīng)30 min，在734 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1，無水乙醇代替精油測(cè)得A0，無水乙醇代替ABTS工作液測(cè)得A2，用無水乙醇調(diào)零，以抗壞血酸為陽性對(duì)照，平行操作重復(fù)3次。清除率按下式計(jì)算：

式中：R：清除率，%；A0：空白組吸光值；A1：樣品組吸光值；A2：無水乙醇代替ABTS工作液所得吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel（版本：2010；微軟公司，美國）和SPSS（版本：25.0；IBM公司，美國）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，方差分析（ANOVA）采用鄧肯多重比較（α=0.05），使用Origin（版本：2018；IBM公司，美國）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。所有測(cè)定重復(fù)三次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)精油得率的影響 不同提取時(shí)間對(duì)金盞花精油得率的影響如圖1所示，可以看出金盞花精油的得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在2～4 h時(shí)間里精油隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷積累，所以得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，反應(yīng)4 h可得最高得率（0.13%）；當(dāng)反應(yīng)超過4 h后，金盞花精油不再延續(xù)積累的態(tài)勢(shì)，出現(xiàn)略微下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榻鸨K花精油長(zhǎng)時(shí)間在較高的溫度下會(huì)揮發(fā)而造成損失[14]，因此最佳提取時(shí)間為4 h。

圖1 提取時(shí)間對(duì)金盞花精油得率的影響Fig.1 Effect of extract time on the yield of essential oil from Calendula officinalis L.

2.1.2 NaCl濃度對(duì)精油得率的影響 不同NaCl添加量對(duì)金盞花精油得率的影響如圖2所示，可以看出金盞花精油的收率一開始會(huì)隨著NaCl添加量的升高而提高，在NaCl濃度升高至為3%時(shí)折線圖達(dá)到頂點(diǎn)，這是因?yàn)镹aCl作為一種無機(jī)鹽夾帶劑可以使體系中精油溶解度降低，同時(shí)一定量的NaCl可以讓組織與溶液形成較大的滲透壓差，迫使精油溶出而被提取出來[15]。另外經(jīng)過NaCl溶液的浸泡可以利用其鹽析作用使精油更透亮美觀。隨后繼續(xù)提高NaCl濃度，精油的收率出現(xiàn)急劇下降的態(tài)勢(shì)，這可能是根據(jù)拉烏爾定律，高濃度的NaCl使體系飽和蒸氣壓降低，難以達(dá)到大氣壓強(qiáng)，導(dǎo)致精油更難蒸出[16]。因此最佳NaCl濃度為3%。

圖2 NaCl濃度對(duì)金盞花精油得率的影響Fig.2 Effect of NaCl content on the yield of essential oil from Calendula officinalis L.

2.1.3 料液比對(duì)精油得率的影響 不同料液比對(duì)金盞花精油的得率影響如圖3所示，可以看出，隨著料液比的增加，金盞花精油的得率提高，但當(dāng)原料與加水量的比例超過1:30 g/mL后，得率便會(huì)出現(xiàn)斷崖式下跌。這是因?yàn)楫?dāng)加水量較少時(shí)，原料與水接觸并不完全，浸潤度不高，精油不能完全釋放從而限制得率。加水量提高之后，有更充足的溶液與原料接觸，精油可以更多地隨蒸氣蒸發(fā)出來。但如果加水量過高的話，則會(huì)使得精油更多地溶解分散在水中，同時(shí)液量的增加亦會(huì)減弱微波熱效應(yīng)，最終導(dǎo)致得率嚴(yán)重降低[17?18]。因此最佳料液比為1:30 g/mL。

圖3 料液比對(duì)金盞花精油得率的影響Fig.3 Effect of material to liquid on the yield of essential oil from Calendula officinalis L.

2.1.4 微波功率對(duì)精油得率的影響 不同微波功率對(duì)金盞花精油得率的影響如圖4所示，可以看出，隨著微波功率的提高，收率呈現(xiàn)先增加后降低的現(xiàn)象，在240與400 W收率相差不明顯，但240 W提取效果略好于400 W。當(dāng)微波功率逐漸增加時(shí)，料液的溫度也會(huì)隨之升高，加劇了分子熱運(yùn)動(dòng)，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)更容易滲出，從而提高了金盞花精油得率。但隨著功率的持續(xù)增大，精油成分中熱敏性物質(zhì)會(huì)因過高的加熱溫度而受破壞和損失，從而降低了金盞花精油的得率[19]。因此最佳微波功率為240 W。

圖4 微波功率對(duì)金盞花精油得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on the yield of essential oil from Calendula officinalis L.

2.1.5 微波時(shí)間對(duì)精油得率的影響 不同微波時(shí)間對(duì)金盞花精油得率的影響如圖5所示，整體來看，金盞花精油在2～10 min內(nèi)得率的變化浮動(dòng)相比其他因素較小，最高與最低相差只有0.02%左右。精油產(chǎn)量隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，微波輻射8 min產(chǎn)出效果最好，若再延長(zhǎng)在微波反應(yīng)器中的反應(yīng)時(shí)間，會(huì)使產(chǎn)量下降。這可能是由于短時(shí)間的微波輻射所產(chǎn)生的熱效應(yīng)較小，對(duì)于植物細(xì)胞的腺體和細(xì)胞的破壞不完全，有效成分溶出較少；而微波加熱時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)熱敏成分揮發(fā)或降解的現(xiàn)象[20?21]。因此最佳微波時(shí)間為8 min。

圖5 微波時(shí)間對(duì)金盞花精油得率的影響Fig.5 Effect of microwave time on the yield of essential oil from Calendula officinalis L.

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。從表2極差分析中可以得出影響金盞花精油產(chǎn)量的主次順序?yàn)锳>C>B，即NaCl濃度大于微波功率大于料液比。由表3可知，NaCl濃度對(duì)金盞花精油得率影響極顯著（P<0.01），微波功率對(duì)得率的影響顯著（P<0.05），料液比對(duì)于得率的影響未表現(xiàn)出顯著性，這說明方差分析與極差分析結(jié)果一致。根據(jù)結(jié)果得出，金盞花精油的最佳提取工藝為A2B2C2，即NaCl濃度3%，料液比1:30 g/mL，微波功率240 W。由于最優(yōu)組合在正交結(jié)果中不存在，所以在經(jīng)過三次驗(yàn)證試驗(yàn)后，在此條件下金盞花精油產(chǎn)量為0.156%±0.002%，該結(jié)果比正交表中的結(jié)果都要高，理論與實(shí)際相吻合，由此可見通過正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的最優(yōu)工藝參數(shù)呈現(xiàn)較好重復(fù)性及可靠性。相比于以往文獻(xiàn)[22]中金盞花精油得率（0.02%～0.06%）有了極大提高。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results of orthogonal test

2.3 GC-MS結(jié)果分析

金盞花精油的GC-MS結(jié)果如圖6和表4所示，總計(jì)分離出25種組分，占被檢總量的97.74%，其中有11種醇類化合物，占總成分的67.42%；6種萜烯類化合物，占總成分的22.53%；3種萜烯類氧化物，占總成分的3.75%；2種酮類化合物，占總成分的2.24%；2種烷烴化合物，占總成分的1.31%；1種酯類化合物，占總成分的0.49%。

表4 金盞花精油成分的GC-MS分析結(jié)果Table 4 GC-MS analysis of essential oil from Calendula officinalis L.

圖6 金盞花精油的總離子流色譜圖Fig.6 Total ion flow chromatography of essential oil from Calendula officinalis L.

通過采用面積歸一化法計(jì)算金盞花精油各組分相對(duì)含量可以看出，在已鑒定的揮發(fā)性成分中含量超過1%的成分共有15個(gè)，占據(jù)主導(dǎo)的是α-杜松醇（37.27%），是一種倍半萜醇類化合物，具有很強(qiáng)的殺螨活性[23]，這與黃妙玲等[24]和Petrovic等[25]的分析結(jié)果相似；其次是β-杜松烯（13.59%），是一種倍半萜烯，具有百里香和木材的香氣[26]，然后是T-依蘭油醇（13.08%）、愈創(chuàng)醇（6.22%）、γ-杜松烯（3.34%）、喇叭烯（2.15%）等，這些主要成分占總成分的90.67%。Khalid等[27]研究了不同培養(yǎng)狀態(tài)下金盞花精油的成分組成，發(fā)現(xiàn)其主要成分為α-杜松醇（32.01%～65.99%）、δ-杜松烯（17.79%～23.14%）、α-桉葉醇（0.26%～9.77%）。Okoh等[28]分析了金盞花干葉、鮮葉、鮮花中精油的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)在這三個(gè)部位中都具有較高的α-側(cè)柏烯（17.8%～26.9%）、T-依蘭油烯（13.1%～40.9%）以及δ-杜松烯（9.0%～13.1%），除此之外，在鮮花精油中還有較多的大牛兒烯（2.8%）、α-可巴烯（2.7%）等[28]，但這些物質(zhì)在本試驗(yàn)中并未檢出，可能是由于金盞花品種及產(chǎn)地、處理?xiàng)l件和提取方式的不同，導(dǎo)致得到的精油成分種類及含量具有一定差異性，但大部分檢出組分與前人報(bào)道保持一致。

2.4 金盞花精油抗氧化活性分析

2.4.1 金盞花精油對(duì)DPPH自由基的清除作用 金盞花精油抵御DPPH自由基氧化的原理是精油所含的有效組分提供單電子將DPPH所帶的電子捕獲從而使其紫色減褪，紫色消褪越明顯其抗氧化性越強(qiáng)[29?30]。由圖7可以看出，在5～35 mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，精油對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸增高，濃度為35 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到55.71%，且有繼續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，IC50為28.89 mg/mL，但相比于VC來說，金盞花精油抵御DPPH自由基的氧化能力較弱。Sahingil[1]研究了金盞花精油的DPPH抗氧化性，在精油用量為200 μg/mL的條件下，DPPH自由基清除率為72.48%，相較于本試驗(yàn)對(duì)于DPPH的抗氧化性更強(qiáng)，可能是因?yàn)槠渌苽涞慕鸨K花精油里具備本次試驗(yàn)未能檢出的γ-萜品烯和檸檬烯，這兩種成分都具有可觀的DPPH自由基清除活性[10,31]。

圖7 金盞花精油對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of essential oil from Calendula officinalis L. on DPPH free radical

2.4.2 金盞花精油對(duì)羥自由基的清除作用 由圖8可知，在5～35 mg/mL濃度范圍內(nèi)，金盞花精油對(duì)羥自由基的清除能力呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系，隨著濃度的增大，精油對(duì)羥自由基的清除率逐漸增高，濃度為5 mg/mL時(shí)清除率為44.92%，濃度為35 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到92.18%，且仍有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，此時(shí)已接近同濃度VC的清除活性，金盞花精油清除羥自由基的IC50為6.77 mg/mL。研究表明精油中的α-松油醇具有很好的羥自由基清除效果[32]，因此金盞花精油較強(qiáng)的羥自由基清除能力可能與其含一定的α-松油醇有關(guān)。

圖8 金盞花精油對(duì)羥自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of essential oil from Calendula officinalis L. on hydroxyl free radical

2.4.3 金盞花精油對(duì)ABTS+自由基的清除作用 ABTS+·在734 nm下具有最大吸收波長(zhǎng)，可通過過硫酸鉀與ABTS反應(yīng)獲得，在與抗氧化成分反應(yīng)后可使其藍(lán)綠色減褪，褪色程度與抗氧化能力呈正相關(guān)[33]。由圖9可知，VC在5～35 mg/mL濃度范圍內(nèi)均處于99%以上。在2～14 mg/mL濃度范圍內(nèi)，金盞花精油對(duì)ABTS+自由基的清除能力呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系，隨著濃度的增大，精油對(duì)ABTS+自由基的清除率逐漸增高，濃度為2 mg/mL時(shí)清除率為43.79%，濃度為14 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到98.40%，且有繼續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，此時(shí)已接近同濃度VC的清除活性。金盞花精油清除ABTS+自由基的IC50為2.21 mg/mL，表明金盞花精油具有良好的ABTS+自由基清除能力，而且其相關(guān)的成分主要是β-桉葉醇和α-松油醇[34]。

圖9 金盞花精油對(duì)ABTS+自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effect of essential oil from Calendula officinalis L. on ABTS+ free radical

3 結(jié)論

本研究采取微波輔助法提取的金盞花精油外觀呈金黃色澄清液體，散發(fā)濃郁金盞花香氣，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了金盞花精油的最優(yōu)提取工藝為NaCl濃度3%，料液比1:30 g/mL，微波功率240 W，此參數(shù)下金盞花精油收率為0.156%±0.002%，較先前文獻(xiàn)極大提高了金盞花精油的產(chǎn)量。由GC-MS結(jié)果可知從金盞花精油中分離出25種化學(xué)組分，最為主要的是α-杜松醇（37.27%）、β-杜松烯（13.59%）和T-依蘭油醇（13.08%）。從抗氧化試驗(yàn)中可以看出金盞花精油對(duì)三種自由基都呈現(xiàn)一定清除能力，三者相比來說對(duì)于ABTS+自由基清除能力最好，對(duì)于DPPH自由基清除能力較弱。綜上所述，金盞花精油是一種有潛力的天然抗氧產(chǎn)物，在天然抗氧化劑和抗衰老的化妝品、藥物中有著極大的應(yīng)用價(jià)值與潛力，接下來還需要進(jìn)一步研究的是其抗氧化效果與相應(yīng)成分的關(guān)系以及具體的抗氧化機(jī)理。