陸必燊,晏峻峰

(湖南中醫(yī)藥大學信息科學與工程學院,中國湖南 長沙 410208)

食管癌(esophageal carcinoma,EC)是一種常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率全球排名第七,總死亡率排名第六,被認為是每年影響50萬人的第六大惡性腫瘤[1～2]。食管早期癌在組織學上可分為腺癌(adenocarcinoma,AC)和鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)[3]。食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)在亞洲更為常見,是一種致死性惡性腫瘤,生存率低[4～5]。在食管鱗狀細胞癌治療指南中,金標準是經(jīng)胸食管次全切除加雙野淋巴結(jié)切除術(shù)[6]。雖然手術(shù)切除聯(lián)合輔助化療是治療食管鱗狀細胞癌的一種有效途徑,但手術(shù)與化療帶給病人的痛苦仍是巨大的。

近年來,食管鱗狀細胞癌的生物標志物成為研究重點。已有研究發(fā)現(xiàn),一些生長因子和相應的受體,如表皮生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子,與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生及患者預后效果相關(guān)[7]。因此,深入研究食管鱗狀細胞癌細胞惡性生物學行為的潛在分子機制,將有助于鑒定可靠的分子標記物,對早期診斷、預后評估、復發(fā)監(jiān)測、控制食管癌細胞增殖和新藥靶標的探索非常重要。

本研究運用R語言及其相關(guān)軟件包,選取GEO數(shù)據(jù)庫中5個類型為陣列表達譜的食管鱗狀細胞癌基因數(shù)據(jù)集為分析材料,篩選了食管鱗狀細胞癌與癌旁非腫瘤組織之間的差異表達基因(differentially expressed gene,DEG),進行了GO(Gene Ontology)與KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析,并通過構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(protein-protein interaction network,PPI network),篩選出食管鱗狀細胞癌密切相關(guān)的關(guān)鍵基因與功能模塊,以期能為食管鱗狀細胞癌的診斷提供潛在的分子標記和治療靶標。

1 材料與方法

1.1 材料

從GEO數(shù)據(jù)庫[8](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載編號為 GSE20347、GSE29001、GSE33426、GSE45168和GSE70409的食管鱗狀細胞癌基因表達譜矩陣文件以及對應的平臺文件。GSE20347數(shù)據(jù)集[9]基于GPL571平臺,共有34例樣本,包含17例食管鱗狀細胞癌組織和17例正常食管組織。GSE29001數(shù)據(jù)集[10]共45例樣本,包含24例正常食管組織和21例癌癥組織,其平臺為GPL571。GSE33426數(shù)據(jù)集[11]共有71例樣本,包含12例正常組織和59例食管鱗狀細胞癌組織,同樣為GPL571平臺。GSE45168數(shù)據(jù)集基于GPL13497平臺,共10例樣本,正常食管組織和癌癥組織各5例。GSE70409數(shù)據(jù)集[12]基于GPL13287平臺,共34例樣本,正常食管組織與癌癥組織各17例。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)處理與差異基因篩選

依次將5個食管鱗狀細胞癌芯片數(shù)據(jù)集導入R Studio軟件,使用R語言命令將基因表達譜矩陣文件中的基因探針I(yè)D轉(zhuǎn)換為平臺文件中的基因符號,以獲得包含國際標準基因名稱的矩陣文件。剔除沒有相對應的基因名和一個探針對應多個基因的數(shù)據(jù),對多個探針對應一個基因的數(shù)據(jù)取均值。使用limma R軟件包對每個數(shù)據(jù)集進行標準化處理[13],并將所有基因表達數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)化。

本研究根據(jù)下載的GEO數(shù)據(jù)集中樣本性狀信息,將樣本分為正常組織組以及癌癥組織組,以校正后的 P＜0.05 和|log2FC|＞1(FC:fold change)為篩選標準,使用limma R軟件包篩選每個數(shù)據(jù)集中的差異表達基因。使用RobustRankAggreg(RRA)R軟件包整合按值排序的所有基因列表的5個數(shù)據(jù)文件[14]。

1.2.2 差異表達基因的GO以及KEGG富集分析

DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)是用于基因富集和功能注釋分析的常用數(shù)據(jù)庫[15]。該數(shù)據(jù)庫整合了生物學數(shù)據(jù)和分析工具,可為大規(guī)模的基因或蛋白質(zhì)列表提供系統(tǒng)而全面的生物學功能注釋。本研究采用DAVID對已識別的差異表達基因進行GO注釋和KEGG通路富集分析,分析結(jié)果以P＜0.05作為納入標準。

1.2.3 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建與hub基因及功能模塊篩選

將篩選的全部差異表達基因?qū)隨TRING 11.0數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建食管鱗狀細胞癌差異表達基因的PPI網(wǎng)絡圖[16]。應用Cytoscape 3.7.2軟件對KEGG通路分析結(jié)果和STRING數(shù)據(jù)庫分析的相互作用數(shù)據(jù)進行可視化網(wǎng)絡分析?；贑ytoscape 3.7.2軟件,cytoHubba插件用于篩選食管鱗狀細胞癌hub基因,MCODE(Molecular Complex Detection)插件用于篩選PPI網(wǎng)絡中的功能模塊[17]。對篩選的功能模塊進行通路富集分析。利用jvenn網(wǎng)站(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/index.html)繪制hub基因的韋恩圖[18]。

1.2.4 關(guān)鍵基因驗證

利用GEPIA[19](http://gepia.cancer-pku.cn/)對篩選的關(guān)鍵基因在食管鱗狀細胞癌組織與正常組織中的表達情況進行驗證。其中,癌癥組織樣本選擇TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù),正常組織樣本選擇TCGA和GTEx(Genotype-Tissue Expression)中的數(shù)據(jù),箱圖抖動大小設(shè)置為0.4,以|log2FC|＞1和P＜0.05作為檢驗閾值。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)處理與差異表達基因篩選結(jié)果

對食管鱗狀細胞癌芯片表達數(shù)據(jù)集GSE-20347、GSE29001、GSE33426、GSE45168 和 GSE-70409進行歸一化處理。差異表達基因篩選結(jié)果表明,GSE20347數(shù)據(jù)集包含1 007個差異表達基因,其中上調(diào)基因453個,下調(diào)基因554個;GSE29001數(shù)據(jù)集篩選出1 909個差異表達基因,包括1 015個上調(diào)基因和894個下調(diào)基因;GSE-33426數(shù)據(jù)集篩選出3 811個差異表達基因,涉及1 992個表達上調(diào)的基因和1 819個表達下調(diào)的基因;GSE45168數(shù)據(jù)集篩選出1 365個差異表達基因,包括583個表達上調(diào)的基因和782個表達下調(diào)的基因;GSE70409數(shù)據(jù)集包含1 817個差異表達基因,其中上調(diào)基因829個,下調(diào)基因988個。

采用RRA軟件包篩選5個數(shù)據(jù)集整合后的差異表達基因,通過等級分析鑒定了373個共同的差異表達基因,其中包括154個表達上調(diào)的基因和219個表達下調(diào)的基因。圖1展示了排名前20的上調(diào)/下調(diào)基因。

圖1 RRA整合后的前20個上調(diào)和下調(diào)的差異表達基因熱圖橫坐標表示數(shù)據(jù)集ID,縱坐標表示基因名稱,紅色表示log2FC＞0,綠色表示log2FC＜0。Fig.1 Heat map of the top 20 up-and down-regulated DEGs after RRA integrationAbscissa represents dataset ID,ordinate represents gene name,red indicates log2FC＞0,and green indicates log2FC＜0.

2.2 差異表達基因的GO以及KEGG富集分析結(jié)果

整合的差異表達基因的GO功能分析分為以下3個部分:生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細胞組分(cellular component,CC)。圖2和圖3顯示了整合的差異表達基因的不同GO功能富集分布。上調(diào)與下調(diào)的差異表達基因的前15個GO富集分析結(jié)果如表1和表2所示。上調(diào)的基因主要富集在細胞外基質(zhì)組織(ontology:BP)、細胞質(zhì)(ontology:CC)和蛋白質(zhì)結(jié)合(ontology:MF),而下調(diào)的基因主要富集在氧化還原過程(ontology:BP)、細胞外外泌體(ontology:CC)和鈣離子結(jié)合(ontology:MF)。KEGG通路分析結(jié)果顯示,整合的差異表達基因主要集中在以下5個途徑:阿米巴病、PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導通路、ECM-受體相互作用、黏著斑和蛋白質(zhì)消化吸收(表3,圖4)。使用Cytoscape軟件繪制富集通路網(wǎng)絡圖,結(jié)果如圖5所示。

圖2 整合后上調(diào)的差異表達基因的GO富集分布Fig.2 GO enrichment and distribution of up-regulated DEGs after integration

圖3 整合后下調(diào)的差異表達基因的GO富集分布Fig.3 GO enrichment and distribution of down-regulated DEGs after integration

表1 與上調(diào)基因相關(guān)的前15個GO富集術(shù)語Table 1 Top 15 GO enrichment terms related to up-regulated genes

表2 與下調(diào)基因相關(guān)的前15個GO富集術(shù)語Table 2 Top 15 GO enrichment terms related to down-regulated genes

表3 整合后的差異表達基因的KEGG通路富集分析Table 3 KEGG pathway analysis of integrated DEGs

圖4 整合后的差異表達基因的KEGG通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of integrated DEGs

圖5 富集通路網(wǎng)絡圖藍色代表通路,紅色代表上調(diào)的基因,綠色代表下調(diào)的基因。Fig.5 Network diagram of enrichment pathwaysBlue represents pathways,red represents up-regulated genes,and green represents down-regulated genes.

2.3 Hub基因與功能模塊篩選結(jié)果

將篩選得到的373個差異表達基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡。下載結(jié)果并使用Cytoscape軟件的cytoHubba插件篩選 Degree、MCC(maximal clique centrality)、MNC(maximum neighborhood component)、EPC(edge percolated component)4種算法得分靠前的15個hub基因,結(jié)果如表4所示。利用jvenn網(wǎng)站繪制4種算法篩選出的hub基因的韋恩圖,得到7個共同hub基因:CDK1、KIF20A、TTK、CDC45、CCNB2、TPX2、KIF4A(圖6)。

表4 Degree、MCC、MNC、EPC算法篩選的前15個hub基因Table 4 Top 15 hub genes screened by Degree,MCC,MNC,and EPC algorithms

圖6 Degree、MCC、MNC、EPC算法篩選的前15個hub基因的韋恩圖Fig.6 Venn diagram of the top 15 hub genes screened by Degree,MCC,MNC,and EPC algorithms

此外,使用Cytoscape軟件的MCODE插件從PPI網(wǎng)絡中篩選了11個功能模塊,其中MCODE得分靠前的兩個功能模塊如圖7所示。對這兩個功能模塊進行通路富集分析,結(jié)果顯示:模塊A的基因主要富集在細胞周期、p53信號通路和卵母細胞減數(shù)分裂;模塊B的基因主要富集在ECM-受體相互作用、蛋白質(zhì)消化吸收、阿米巴病、黏著斑、PI3K-Akt信號通路。

圖7 兩個PPI網(wǎng)絡功能模塊Fig.7 Two PPI network function modules

2.4 關(guān)鍵基因驗證

通過GEPIA對篩選得到的關(guān)鍵基因進行分析,結(jié)果顯示:CDK1、KIF20A、TTK、CDC45、CCNB2、TPX2、KIF4A在食管鱗狀細胞癌中均表達增高(圖8)。

圖8 關(guān)鍵基因表達水平的驗證結(jié)果紅色代表腫瘤組織,灰色代表正常組織。Fig.8 Validation results of key gene expression levelsRed represents tumor tissue,and gray represents normal tissue.

3 討論

在食管鱗狀細胞癌的早期階段對患者進行檢測可以提高診斷的準確性,促進個性化治療并改善預后的效果。然而,食管鱗狀細胞癌的主要發(fā)生原因尚不清楚。本研究通過分析GSE20347、GSE29001、GSE33426、GSE45168和GSE70409五個基因芯片數(shù)據(jù)集,篩選得到373個食管鱗狀細胞癌相關(guān)的差異表達基因,其中154個表達上調(diào)基因和219個表達下調(diào)基因。GO功能分析發(fā)現(xiàn),差異表達基因主要參與細胞外基質(zhì)組織、細胞質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)合、氧化還原過程、細胞外外泌體和鈣離子結(jié)合等。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),差異表達基因主要富集在阿米巴病、PI3K-Akt信號通路、ECM-受體相互作用、黏著斑和蛋白質(zhì)消化吸收等通路。PPI網(wǎng)絡和韋恩圖法共篩選得到以下7個關(guān)鍵基因:CDK1、KIF20A、TTK、CDC45、CCNB2、TPX2、KIF4A。

CDK1(cyclin-dependent kinase 1)的相關(guān)途徑包括卵母細胞減數(shù)分裂和胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信號轉(zhuǎn)導[20]。其編碼的蛋白質(zhì)是Ser/Thr蛋白激酶家族的成員,是高度保守的蛋白激酶復合物的催化亞基,被稱為M期促進因子,對于真核細胞周期的G1/S和G2/M相變至關(guān)重要[21]。Hansel等[22]發(fā)現(xiàn),CDC2/CDK1在食管腺癌及其前體病變中的表達既可作為診斷癌癥進展的標志物,又可以作為潛在的藥物治療靶點。有研究報道,CDK1是食管鱗狀細胞癌G2/M通路的調(diào)節(jié)劑,并且CDK1與其他調(diào)節(jié)劑(例如CDC25)的組合可增強對患者預后的預測[23]。

KIF20A(kinesin family member 20A)的相關(guān)途徑包括JAK/STAT3信號通路,以及高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的逆行轉(zhuǎn)運[24]?，F(xiàn)有研究表明,KIF20A的上調(diào)與胃癌預后不良有關(guān)[25],其過表達通過促進細胞增殖和抑制細胞凋亡導致肺腺癌惡性轉(zhuǎn)移[26],但其與食管鱗狀細胞癌的相關(guān)研究報道較少。

TTK(TTK protein kinase)是一種具有磷酸化酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸能力的雙重特異性蛋白激酶,對細胞分裂的調(diào)節(jié)至關(guān)重要,與細胞增殖相關(guān),且參與中心體復制過程[27]。已有研究發(fā)現(xiàn),TTK的過表達可能參與了食管鱗狀細胞癌的增殖過程[28]。

CDC45(cell division cycle 45)的相關(guān)途徑包括E2F介導的DNA復制和細胞周期調(diào)控,其在真核生物DNA復制的早期步驟中起著重要作用[29～30]。Huang等[31]發(fā)現(xiàn),CDC45的表達敲低在體外和體內(nèi)均抑制非小細胞肺癌細胞增殖,并使細胞停滯在細胞周期的G2/M期。Ke等[32]報道,RING1和YY1結(jié)合蛋白通過下調(diào)CDC6和CDC45抑制食管鱗狀細胞癌的增殖,從而抑制G1/S過渡。

CCNB2(cyclin B2)的相關(guān)途徑包括卵母細胞減數(shù)分裂和調(diào)控有絲分裂細胞周期階段過渡[33],其重要旁系同源物是CCNB1。研究表明,CCNB1的表達與食管鱗狀細胞癌患者的惡性腫瘤和預后有關(guān)[34],CCNB2在食管鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用[35]。

TPX2(TPX2 microtubule nucleation factor)的相關(guān)途徑包括在G2/M過渡時調(diào)控PLK1(Polo-like kinase 1)活性和基因表達[36]。TPX2在多種腫瘤類型(例如子宮頸癌和胃癌)中表達上調(diào)[37],且其表達與肝細胞癌的生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)[38]。研究表明,TPX2調(diào)節(jié)食管鱗狀細胞癌細胞的增殖和侵襲性[39],且其高表達與食管鱗狀細胞癌患者較差的總生存期和較短的無病生存期有關(guān)[40]。

KIF4A(kinesin family member 4A)的相關(guān)途徑包括表皮生長因子受體的內(nèi)吞運輸和p53信號通路[41]。該基因編碼的蛋白質(zhì)是一種基于ATP的微管運動蛋白,參與膜細胞器的細胞內(nèi)運輸,與濃縮的染色體臂相關(guān)聯(lián),并且可能參與有絲分裂期間染色體完整性的維持[42]。

綜上所述,本文通過對食管鱗狀細胞癌及癌旁組織的差異表達基因進行分析,篩選得到7個關(guān)鍵基因:CDK1、KIF20A、TTK、CDC45、CCNB2、TPX2、KIF4A,其中 CDK1、TTK、TPX2、CDC45、CCNB2在食管鱗狀細胞癌中的作用已有研究進行報道,而KIF20A、KIF4A在食管鱗狀細胞癌中的相關(guān)研究較少。通過生物信息學方法,對食管鱗狀細胞癌相關(guān)基因數(shù)據(jù)進行分析,將有助于增強人們對食管鱗狀細胞癌病癥發(fā)生發(fā)展機制的了解;分析得到的關(guān)鍵基因與生物學通路,將有望為食管鱗狀細胞癌的早期診斷、預后評估及靶向治療提供新思路。