施露　高慶超　李亞輝　梁穎　張志勇

摘要：梨是溫帶地區(qū)生產(chǎn)最廣泛、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的水果之一。近年來，圍繞梨果實(shí)品質(zhì)的研究取得了較大進(jìn)展。本文對(duì)梨果實(shí)品質(zhì)的4個(gè)方面（香氣、甜味、果皮色澤以及石細(xì)胞）分別進(jìn)行系統(tǒng)梳理，然后從克隆與梨果實(shí)優(yōu)質(zhì)品質(zhì)相關(guān)的基因，利用多組學(xué)聯(lián)合分析方法解析梨品質(zhì)形成的分子網(wǎng)絡(luò)，改進(jìn)遺傳轉(zhuǎn)化方法以及利用基因編輯技術(shù)創(chuàng)制梨優(yōu)質(zhì)果實(shí)新種質(zhì)4個(gè)方面對(duì)利用現(xiàn)有技術(shù)在未來培育高品質(zhì)梨果實(shí)上的研究提出建議，以期為優(yōu)質(zhì)梨品種選育和創(chuàng)制提供參考。

關(guān)鍵詞：梨;香氣;甜味;果皮色澤;石細(xì)胞;組學(xué);基因編輯

中圖分類號(hào)：S661.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2022）02-0567-10

Research progress and prospects of potential technology application in pear fruit quality

SHI Lu GAO Qing-chao LI Ya-hui LIANG Ying ZHANG Zhi-yong

Abstract：Pear is one of the most widely produced and economically valuable fruits in temperate regions. In recent years， much progress has been made in the research on the fruit quality of pears. In this paper， we reviewed four aspects of pear fruit quality （aroma， sweetness， skin color and stone cell）， and discussed key research areas that would provide the scientific basis and the genetic tool for the cultivation of high-quality pears in the future. These included cloning genes involved in the formation of high-quality fruits， analyzing the network of genes involved in fruit quality using multi-omics analyses， improving genetic transformation methods， and applying gene-editing technology to create new germplasm for high-quality pears. This review will provide a reference for research on the breeding and creation of high-quality pear varieties.

Key words：pear;aroma;sweetness;skin color;stone cell;omics;gene editing

梨屬于薔薇科（Rosaceae）梨屬（Pyrus L.）多年生果樹，是世界上種植最廣泛的果樹之一。按照植物起源，梨屬可分為東方梨和西方梨兩大類，中國(guó)是東方梨的起源中心[1]。梨的栽培歷史悠久，人類從兩千多年前就開始從事梨的栽培。在中國(guó)，梨的栽培歷史已有1 300年，主要的5個(gè)栽培種類包括砂梨（Pyrus pyrifolia）、新疆梨（Pyrus sinkiangensis）、白梨（Pyrus bretschneideri）、秋子梨（Pyrus ussuriensis）、西洋梨（Pyrus communis），廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)的栽培品種更是多達(dá)130余個(gè)，例如碭山酥梨、庫爾勒香梨、鴨梨等[2]。

梨是全球主要的水果之一，在中國(guó)，梨是僅次于蘋果和柑橘的第三大水果[2-3]，2020年中國(guó)的梨產(chǎn)量達(dá)到1.78×107 t。梨因其獨(dú)特的風(fēng)味和較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值深受消費(fèi)者喜歡[4]。然而與日本、韓國(guó)相比，中國(guó)梨果實(shí)的品質(zhì)相對(duì)較差，存在風(fēng)味偏淡，果肉較粗等問題，這些問題使中國(guó)梨果實(shí)在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上競(jìng)爭(zhēng)力不足[5]。有數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)消費(fèi)者對(duì)梨的選擇趨于高端化，更加注重果實(shí)的品質(zhì)[3]。因此，梨果實(shí)品質(zhì)提升一直是梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展的方向之一。

梨果實(shí)品質(zhì)包括風(fēng)味品質(zhì)、外觀品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等，是內(nèi)在遺傳特性與外在環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。本研究主要從梨果實(shí)內(nèi)在的遺傳特性著手，分別從香氣、甜味、果皮色澤以及石細(xì)胞形成4個(gè)方面進(jìn)行綜述，然后結(jié)合梨產(chǎn)業(yè)當(dāng)前遇到的發(fā)展瓶頸，從克隆與梨果實(shí)優(yōu)質(zhì)品質(zhì)相關(guān)的基因、利用多組學(xué)聯(lián)合分析方法解析梨品質(zhì)形成的分子網(wǎng)絡(luò)、改進(jìn)遺傳轉(zhuǎn)化方法以及利用基因編輯技術(shù)創(chuàng)制梨優(yōu)質(zhì)果實(shí)新種質(zhì)4個(gè)方面提出在高品質(zhì)梨的研究中可借鑒的方法，為進(jìn)一步改善梨果實(shí)品質(zhì)提供參考。

1梨果實(shí)香氣物質(zhì)研究進(jìn)展

梨果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育經(jīng)歷了一系列的生理生化過程，同時(shí)伴隨著其獨(dú)特風(fēng)味的形成。果實(shí)的香氣是果實(shí)風(fēng)味的重要方面，也是衡量果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，影響消費(fèi)者的選擇。

1.1梨果實(shí)的香氣物質(zhì)

香氣的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，香氣是經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)產(chǎn)生的各種揮發(fā)性物質(zhì)[6]。從1927年起，人們就開始研究梨果實(shí)的香氣成分[7]。通過采用氣相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等檢測(cè)技術(shù)，科研工作者們陸續(xù)從不同梨品種中鑒定到芳香烴酯化合物和含硫化合物，達(dá)300多種[6]。這些芳香化合物香氣值（香氣成分的含量/香氣閾值）大于1時(shí)，才會(huì)影響果實(shí)的香氣。果實(shí)芳香化合物以酯類為主的屬于“果香型”，以醛醇類為主的則屬于“清香型”[8-9]。

不同品種梨的香氣特點(diǎn)不同。西洋梨品種中，果實(shí)的香氣成分主要有酯類、醇類和烷烴類[10]，其中（2E，4Z）-癸二烯酸甲（乙）酯是西洋梨品種Bartlett的特征香氣成分[11-12]。而在亞洲梨中，果實(shí)的香氣物質(zhì)成分主要為酯類和醛類[13]。己醛是庫爾勒香梨、白梨以及砂梨中最主要的“清香型”香氣物質(zhì)[8，14]，并且白梨品種主要的香氣物質(zhì)成分種類和己醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于砂梨品種[14]。隨著基因組學(xué)和代謝組學(xué)的發(fā)展，梨果實(shí)香氣物質(zhì)的生物合成以及對(duì)香氣物質(zhì)代謝的調(diào)控越來越受到關(guān)注。

1.2梨果實(shí)香氣物質(zhì)的合成

香氣物質(zhì)的生物合成途徑根據(jù)參與生物合成反應(yīng)的前體物質(zhì)類型不同，主要可分為脂肪酸代謝途徑、氨基酸代謝途徑和糖類代謝途徑[15]。

1.2.1脂肪酸代謝途徑脂肪酸代謝途徑是果實(shí)香氣形成的重要途徑，脂肪酸的減少會(huì)導(dǎo)致果實(shí)香氣不佳[16]。如圖1所示，β-氧化和脂氧合酶（LOX） 途徑是脂肪酸代謝途徑中最主要的2條分支。β-氧化是以飽和脂肪酸硬脂酸為底物，LOX途徑以不飽和脂肪酸亞油酸和亞麻酸為底物，在一系列酶的催化作用下生成酯[17]。例如，氫過氧化物裂解酶（HPL）和LOX將不飽和脂肪酸裂解或氧化成醛類物質(zhì)，醛繼續(xù)在乙醇脫氫酶（ADH）作用下不斷還原成醇，最后，醇通過醇酰基轉(zhuǎn)移酶 （AAT）生成酯（圖1）。其中脂氧合酶是LOX途徑中第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，決定反應(yīng)的進(jìn)行[6]，并且能將無揮發(fā)性的風(fēng)味前體轉(zhuǎn)化成具有特殊風(fēng)味的物質(zhì)。與綠色果實(shí)相比，成熟的果實(shí)中酶的活性更高，而亞油酸、亞麻酸的含量相對(duì)較低[16]。

1.2.2氨基酸代謝途徑果實(shí)芳香化合物組成中的一些低碳數(shù)的醇、酯、醛等以氨基酸為前體物質(zhì)合成。參與這個(gè)過程的氨基酸主要有亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸等，它們經(jīng)過脫氨酶、脫羧酶、脫氫酶的作用生成醇或者酯（圖1）。

ADH能夠催化醛類及醇類之間的相互轉(zhuǎn)化[18]，在果實(shí)芳香物質(zhì)形成中起重要作用[19]。Speirs等[20]發(fā)現(xiàn)ADH活性降低會(huì)導(dǎo)致果實(shí)的風(fēng)味下降。通過將梨基因組與其他物種進(jìn)行序列比對(duì)，Qin等[21]鑒定到了8個(gè)PbrADHs基因，并且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在果實(shí)成熟過程中，ADH活性與ADH6基因轉(zhuǎn)錄呈正相關(guān)，總ADH活性與果實(shí)酯類的產(chǎn)生相關(guān)。Zeng等[22]從進(jìn)化和ADH基因表達(dá)特性方面進(jìn)一步揭示了3個(gè)ADH基因與果實(shí)中芳香物質(zhì)的形成有關(guān)。

1.2.3糖類代謝途徑果實(shí)中另一大類物質(zhì)是糖類，包括單糖、雙糖、糖醇等，也是果實(shí)香氣物質(zhì)合成的重要前體物質(zhì)，影響著果實(shí)的風(fēng)味[6]。

β-葡萄糖苷酶可以提高蘋果和橙子果實(shí)中的揮發(fā)性物質(zhì)含量[23-24]。Li等[19]在碭山酥梨生長(zhǎng)的3個(gè)重要階段進(jìn)行iTRAQ蛋白表達(dá)譜分析，鑒定到3個(gè)差異表達(dá)的β-葡萄糖苷酶（Pbr042200.2、Pbr028992.1、Pbr020361.1），其中Pbr042200.2和Pbr020361.1活性在果實(shí)成熟期下降，在果實(shí)成熟階段碭山酥梨香氣的濃郁程度比歐洲梨低，表明β-葡萄糖苷酶與果實(shí)的香氣形成有關(guān)。

參與梨果實(shí)香氣物質(zhì)形成的這些代謝途徑依賴于酶的催化以及酶相關(guān)基因的表達(dá)。那么如何調(diào)控這些酶的活性在梨果實(shí)香氣形成中的作用尤為重要。在果實(shí)冷藏過程中，茉莉酸甲酯預(yù)處理提高了梨果實(shí)香氣物質(zhì)形成代謝途徑中重要酶（AAT、ADH、LOX）的活性和LOX途徑中主要基因和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而增加了酯類和不飽和脂肪酸的濃度，減少梨在冷藏過程中風(fēng)味物質(zhì)的降低[25]。Luo等[26]發(fā)現(xiàn)甘氨酸甜菜堿的添加通過調(diào)控LOX途徑促進(jìn)酯類的合成，提高果實(shí)的抗氧化能力，從而有效增加冷藏過程中梨果實(shí)酯類香氣物質(zhì)含量。

2梨果實(shí)甜味物質(zhì)研究進(jìn)展

梨果實(shí)中的糖類，主要有蔗糖、果糖、葡萄糖、山梨醇等，它們的濃度和種類對(duì)果實(shí)成熟和商品性起到重要作用[27]。果實(shí)糖類不僅影響果實(shí)的甜度，還是有機(jī)酸、芳香化合物以及花色素等合成的基礎(chǔ)原料，它的代謝貫穿果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育到成熟的整個(gè)過程，因此了解梨果實(shí)糖的代謝過程及其運(yùn)輸對(duì)提高梨果實(shí)品質(zhì)非常重要。

2.1梨果實(shí)中糖代謝

果實(shí)作為庫器官，能夠用于糖分代謝和儲(chǔ)存。按照糖代謝產(chǎn)物可將糖代謝分為3類，分別為山梨醇代謝、蔗糖代謝以及己糖代謝。這些代謝途徑中的關(guān)鍵酶，如山梨醇氧化酶（SOX）、 山梨醇脫氫酶（SDH）、山梨醇-6-磷酸脫氫酶（S6PDH）、蔗糖合成酶（SS）、轉(zhuǎn)化酶（Ivr）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）以及己糖激酶（HXK）等，在糖分積累中起到重要作用，直接影響果實(shí)糖代謝進(jìn)程。

蔗糖代謝是糖代謝最主要的途徑。蔗糖的積累是決定果實(shí)膨大和品質(zhì)的重要因素之一，受其合成途徑中酶活性和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的影響。Moriguchi等[28]通過比較高蔗糖品種Chojuro和低蔗糖鴨梨品種果實(shí)成熟階段酶活性的變化發(fā)現(xiàn)，在Chojuro果實(shí)成熟期SS和SPS活性高于低蔗糖鴨梨品種，并且SS和SPS活性與蔗糖積累量呈正相關(guān)。在對(duì)105份梨的糖圖譜評(píng)估后，Lyu等[29]又進(jìn)一步選擇高蔗糖品種Hosui和低蔗糖品種Korla進(jìn)行轉(zhuǎn)錄圖譜分析，建立共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，鑒定到7個(gè)與蔗糖生物合成相關(guān)的酶和轉(zhuǎn)錄因子，并且將預(yù)測(cè)的基因與梨果實(shí)蔗糖含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，這些預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控梨蔗糖積累中發(fā)揮重要作用。PuWRKY31轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子發(fā)生組蛋白甲基化，提高了蔗糖的積累[30]。

2.2梨果實(shí)光合產(chǎn)物的運(yùn)輸

梨的光合產(chǎn)物主要以山梨醇的形式運(yùn)輸[31]，從韌皮部運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。SDH可催化山梨醇分解為果糖和葡萄糖，在維持果實(shí)高庫強(qiáng)度、競(jìng)爭(zhēng)碳水化合物、糖分轉(zhuǎn)化等方面具有重要作用。Dai等[32]通過RNA-seq在砂梨品種中鑒定到14個(gè)PpySDH基因，并對(duì)其表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，PpySDH在梨小果期和接近成熟時(shí)表達(dá)量增加。

果實(shí)中的糖分由葉片光合作用產(chǎn)生，經(jīng)長(zhǎng)距離運(yùn)輸后卸載而來，并且糖分的卸載途徑主要為質(zhì)外體卸載途徑[33]。卸載進(jìn)入果實(shí)的糖一部分進(jìn)入液泡，液泡是糖的主要儲(chǔ)存場(chǎng)所，糖可通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白到達(dá)液泡中。糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要有3類，分別為蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SUT）、單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及SWEET轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[5]。

蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要是將蔗糖從質(zhì)外體或者液泡運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)。梨中的多個(gè)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已被發(fā)現(xiàn)和克隆[34]。借助碭山酥梨基因組數(shù)據(jù)庫，李甲明[5]通過生物信息學(xué)手段發(fā)現(xiàn)18個(gè)PbSWEET糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并且解析了其基因家族的結(jié)構(gòu)。糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PuSWEET15和轉(zhuǎn)錄因子PuWRKY31在南果梨高糖芽變果實(shí)中表達(dá)量顯著高于南果梨果實(shí)，李馨玥[35]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PuWRKY31是通過結(jié)合PuSWEET15的啟動(dòng)子促進(jìn)其表達(dá)的。

3梨果實(shí)色澤形成的調(diào)控

梨果皮按照色澤主要分為3種類型，即綠皮、褐皮和紅皮[36]。在中國(guó)5大主栽梨品種中，秋子梨和白梨主要是綠皮，砂梨主要是綠皮和褐皮，西洋梨和新疆梨主要是綠皮和紅皮[2]。梨果皮著色主要與植物色素[葉綠素、類胡蘿卜素、酚類色素（花青素、黃酮等）]的含量和比例相關(guān)[37]。其中，果皮紅色主要受花青素苷合成和降解的影響。

花青素苷是類黃酮代謝途徑產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，它的合成受其結(jié)構(gòu)基因、轉(zhuǎn)錄因子以及外界環(huán)境的調(diào)控。這三者相互影響共同調(diào)控花青素的合成。Zhai等[38]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子PbMYB10b和PbMYB9分別通過激活二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）和花青素合成酶（PbANS）的啟動(dòng)子的表達(dá)來調(diào)控花青素和原花青素合成途徑，二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）以及花青素合成酶（ANS）基因是花青素苷合成階段主要的結(jié)構(gòu)基因，決定花青素從無色到有色。研究發(fā)現(xiàn)，參與花青素苷合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子有MYB、bHLH、WDR、HD-zip等[39]。科研工作者以亞洲紅梨為材料，克隆了PyMYB114和PyMYB10轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)它們參與花青素的合成，并且它們具有加成作用，在煙草和草莓中共表達(dá)這2個(gè)基因提高了花青素的生物合成[40-41]。轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH和WD40可以形成MBW三元復(fù)合物，該復(fù)合物通過激活花青素生物合成途徑的關(guān)鍵基因，從而促進(jìn)花青素的合成與累積。Liu等[42]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子PyPIF5在強(qiáng)光作用下表達(dá)量降低，減少了其與PymiR156a啟動(dòng)子中的G-box基序結(jié)合，使PymiR156a表達(dá)上調(diào)，降解其靶標(biāo)PySPL，從而減少PySPL與PyMYB114和PyMYB10形成異二聚體，使MYB轉(zhuǎn)錄因子（PyMYB114、PyMYB10）更多地參與對(duì)花青苷合成途徑結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控，最終促進(jìn)了花青苷生物合成和積累。

紅皮梨主要以西洋梨為主。張震等[43]以西洋梨品種為材料克隆了1個(gè)HD-ZipI家族基因PcHB12，研究結(jié)果表明，PcHB12作用在PyMYB10.1的啟動(dòng)子序列上，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，從而減少了梨果實(shí)花青素苷的合成。部分西洋梨品種引種到中國(guó)栽培，出現(xiàn)了果皮紅色在發(fā)育期消退的現(xiàn)象，從而降低了商品價(jià)值。Wang等[44]推測(cè)這可能與花青素苷的降解有關(guān)。而李俊才等[45]研究發(fā)現(xiàn)，果皮紅色消退現(xiàn)象與花青素苷合成減少相關(guān)，他們從巴梨紅色芽變品種紅巴梨果皮中克隆了PcUFGT基因，該基因作為花青素苷合成過程中的結(jié)構(gòu)基因，將糖基連接到不穩(wěn)定的花青素上，形成穩(wěn)定的花青素苷;研究還發(fā)現(xiàn)，PcUFGT在幼果果皮中大量表達(dá)，加速產(chǎn)生花青素苷，果實(shí)成熟期該基因表達(dá)下降，表明花青素苷合成減少。為進(jìn)一步探明果皮褪色的原因，Wang等[46]以紅星和紅巴梨這2個(gè)西洋梨品種為材料，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析它們不同發(fā)育時(shí)期基因的表達(dá)情況，篩選出61個(gè)與紅巴梨果皮褪色相關(guān)的候選基因，包括花青素合成、降解、轉(zhuǎn)運(yùn)與調(diào)控。通常，西洋梨果實(shí)從發(fā)育階段開始著色，褪色，直到成熟又開始著色，而亞洲紅皮梨在接近果實(shí)成熟階段才開始著色。這表明這2個(gè)品種的梨果皮著色的分子機(jī)制不同[41]。早酥紅梨是從優(yōu)質(zhì)脆肉型梨品種早酥中鑒定到的一個(gè)紅色芽變品種[38]。研究發(fā)現(xiàn)，PpBBX24基因編碼區(qū)上的14個(gè)堿基缺失變異與早酥紅梨的紅色性狀密切相關(guān)[47]。這些研究有助于解析梨果皮著色的調(diào)控機(jī)制，為梨果皮顏色育種和優(yōu)質(zhì)紅梨的著色調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

褐色是砂梨品種果皮特有的顏色，主要有日本梨品種豐水、今村秋、長(zhǎng)十郎等和中國(guó)梨品種黃花梨、三花、蒼溪雪梨等[48]。部分研究者認(rèn)為褐色果皮是梨果皮細(xì)胞發(fā)生木栓化，積累大量木栓質(zhì)形成的[36，49]。木栓層中含有許多木質(zhì)素，木質(zhì)素的積累與梨果皮褐色的形成密切相關(guān)，并且已有許多文獻(xiàn)報(bào)道木質(zhì)素合成途徑的相關(guān)基因參與梨褐色果皮性狀的形成。果皮在轉(zhuǎn)色階段各種物質(zhì)合成代謝旺盛，例如苯丙烷代謝、脂質(zhì)代謝等[50]。李浩男等[51]利用GC-MS和LC-MS技術(shù)對(duì)黃花梨及其芽變品種綠黃花成熟期的果皮代謝產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)，代謝物的不同導(dǎo)致了兩者果皮顏色的差異。

梨的褐色果皮性狀由多個(gè)基因控制，科研工作者都試圖探尋哪些基因控制梨的褐皮性狀。多個(gè)研究組已經(jīng)通過數(shù)量性狀基因座（Quantitative trait locus，QTL）定位將調(diào)控褐色果皮性狀的主效QTL定位在梨的8號(hào)染色體上。Jiang等[52]進(jìn)一步在定位區(qū)間找到PpC3H23基因，通過瞬時(shí)過表達(dá)該基因發(fā)現(xiàn)，PpC3H23基因提高了果皮褐化的速率，由此推測(cè)，PpC3H23基因可能在梨果皮褐化中起重要作用。并且該課題組利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較褐色果皮梨品種早生新水和綠色果皮梨品種秋水發(fā)現(xiàn)403個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因包含轉(zhuǎn)錄因子基因（MYB、HD、BHLH）和功能基因，涉及脂肪酸、木栓質(zhì)、角質(zhì)等生物合成途徑。該研究從分子層面解析了梨果皮褐化的機(jī)制，為高品質(zhì)梨品種的培育提供指導(dǎo)。

4梨石細(xì)胞形成的調(diào)控

石細(xì)胞是梨果實(shí)組織特有的一類厚壁組織細(xì)胞，含有豐富的木質(zhì)素和纖維素[53]。大量研究結(jié)果表明，石細(xì)胞的大小、數(shù)量以及密度等各種特性都與梨果實(shí)食用品質(zhì)和加工品質(zhì)密切相關(guān)[54]。果實(shí)中石細(xì)胞團(tuán)較大，密度較高，則果肉較粗，反之果肉較細(xì)膩;石細(xì)胞還影響梨果實(shí)的糖、酸、維生素C的含量以及果實(shí)的耐貯性[53]。如何減少梨果實(shí)石細(xì)胞含量，是改善梨果實(shí)品質(zhì)的重要方面。

近年來，科研工作者在石細(xì)胞的形成調(diào)控方面取得了較大進(jìn)展。Xue等[55]研發(fā)出一種能簡(jiǎn)便快捷地評(píng)估石細(xì)胞的工具，該工具基于計(jì)算機(jī)圖像識(shí)別技術(shù)，能快速評(píng)估石細(xì)胞的數(shù)量、大小、面積以及密度這4大性狀，對(duì)395份梨種質(zhì)材料的這些性狀量化分析發(fā)現(xiàn)，不同梨品種間相差較大，并且這些性狀與果實(shí)的口味相關(guān)，其中梨果實(shí)中的石細(xì)胞密度是影響梨果實(shí)口感最重要的因素。碭山酥梨在中國(guó)栽培較廣，是主要的栽培品種，但其果肉較粗糙影響口感。Gong等[56]和Xu等[57]從碭山酥梨中克隆了類半胱氨酸蛋白酶基因（PbMC1a/1b）和咖啡酰莽草酸酯酶基因（PbCSE1），在擬南芥中分別過表達(dá)這2個(gè)基因發(fā)現(xiàn)，植株莖中木質(zhì)素的積累增加，并且導(dǎo)管、木質(zhì)纖維以及維管束間纖維細(xì)胞壁增厚，植株的生長(zhǎng)受到抑制，同時(shí)提高了木質(zhì)素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)[56-57]。課題組進(jìn)一步通過酵母雙雜交（Yeast two-hybrid， Y2H）、雙分子熒光互補(bǔ)（Bimolecular Fluorescent Complimentary， BiFC）以及GST融合蛋白沉降技術(shù)證明了PbMC1a/1b蛋白能與PbRD21互作，并且同時(shí)在梨果實(shí)和愈傷組織中瞬時(shí)表達(dá)這2個(gè)基因顯著改變了木質(zhì)素的含量，表明PbMC1a/1b可能與PbRD21互作提高木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)梨果實(shí)中石細(xì)胞的形成[56]。果實(shí)石細(xì)胞中木質(zhì)素含量較高，達(dá)29.8%以上[58]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素合成相關(guān)基因與石細(xì)胞形成相關(guān)，例如PbCAD基因家族[59]。近期，Wang等[60]構(gòu)建了梨果實(shí)石細(xì)胞eQTL圖譜和木質(zhì)素纖維素共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，定位到一個(gè)重要調(diào)控因子PbrNSC，通過梨果實(shí)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化和擬南芥的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該調(diào)控因子通過激活PbrMYB169、Pbr4CL4和PbrLAC4基因的啟動(dòng)子，調(diào)控梨果實(shí)石細(xì)胞、木質(zhì)素以及纖維素的形成。

5梨優(yōu)質(zhì)果實(shí)培育的潛在技術(shù)應(yīng)用與展望

梨是典型的自交不親和物種，同一品種相互授粉后不能正常結(jié)實(shí)，這使得梨的序列高度雜合[61]，并且梨許多品質(zhì)性狀多由多基因控制，因此，運(yùn)用傳統(tǒng)雜交手段選育新品種周期較長(zhǎng)、效率較低[62]。如何加快優(yōu)質(zhì)梨的選育來滿足消費(fèi)者多樣化的需求是亟待解決的問題。以下就針對(duì)梨育種和基因功能研究中遇到的問題，探討在梨優(yōu)質(zhì)果實(shí)培育上可應(yīng)用的潛在技術(shù)，以期為梨果實(shí)品質(zhì)的提高提供新的思路。

5.1克隆與梨果實(shí)優(yōu)質(zhì)品質(zhì)相關(guān)的基因

梨的許多品質(zhì)性狀，如果實(shí)的含糖量、含酸量、果實(shí)大小等主要為受多基因控制的數(shù)量性狀（QTL）[63]。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展和梨高質(zhì)量全基因圖譜的構(gòu)建，科研工作者發(fā)現(xiàn)了許多與梨果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的重要基因位點(diǎn)[61]。

韓明麗等[63]將果實(shí)性狀差異較大的2個(gè)品種八月紅梨和碭山酥梨雜交，構(gòu)建他們F1雜合群體的分子遺傳連鎖圖譜，并對(duì)后代群體的品質(zhì)性狀，包括單果質(zhì)量、果實(shí)的縱橫徑、可溶性固形物等進(jìn)行基因位點(diǎn)分析，共檢測(cè)到21個(gè)基因位點(diǎn)，同時(shí)將控制果皮紅色、果銹、萼片脫落、梨酸/低酸等性狀的基因分別定位于不同的連鎖群上[41，64]。通過對(duì)更多不同梨品種進(jìn)行雜交，科研工作者陸續(xù)地構(gòu)建出不同的分子遺傳圖譜，分別定位到控制梨果實(shí)蔗糖、果糖和葡萄糖等單一糖含量的基因位點(diǎn)[65]，以及果皮紅色性狀[66]、單果質(zhì)量、果心大小、果肉硬度、果實(shí)橫縱徑等性狀的基因位點(diǎn)[67]。砂梨起源于中國(guó)西南地區(qū)，是中國(guó)目前種植面積最大的栽培種，并且砂梨的遺傳多樣性較為豐富。Zhang等[68]利用全基因組遺傳變異解析了312份砂梨品種的重測(cè)序數(shù)據(jù)，并進(jìn)一步對(duì)梨果實(shí)品質(zhì)性狀和物候期性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS），共獲得42個(gè)關(guān)聯(lián)區(qū)間[68]。

梨的基因組測(cè)序已于2012年完成，第一個(gè)梨基因組測(cè)序品種為中國(guó)第一大栽培品種碭山酥梨，Zhang等[68]組裝了長(zhǎng)度達(dá)512.0 Mb的梨基因組[61]。梨基因組精細(xì)圖譜的構(gòu)建以及梨品種資源的遺傳變異和果實(shí)相關(guān)性狀的GWAS研究，都為定位和挖掘與梨果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的基因位點(diǎn)提供了基礎(chǔ)。目前，控制梨果實(shí)大小的FWL5基因[69]、黃花梨及其芽變綠黃花梨HHT基因[70]、碭山酥梨褐色果皮芽變基因（PbXET）[71]、蘋果梨果皮花青素苷合成基因（PyANS）[72]等與梨果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的基因被克隆。這方面的研究結(jié)果與技術(shù)手段為今后梨果實(shí)品質(zhì)的遺傳改良提供了基礎(chǔ)，同時(shí)也為挖掘未知功能新基因提供了有效途徑。

5.2利用多組學(xué)聯(lián)合分析方法解析梨品質(zhì)形成的分子網(wǎng)絡(luò)

多種組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)可以更加全面地了解不同性狀的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目前通過組學(xué)的手段挖掘重要性狀的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)廣泛運(yùn)用于梨和其他物種中[56]。李甲明[5]通過對(duì)碭山酥梨果實(shí)發(fā)育初期、發(fā)育中期以及接近成熟期3個(gè)階段蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)聯(lián)分析共鑒定到35個(gè)與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。利用基因組學(xué)的研究手段，張明月[73]基于已經(jīng)測(cè)序的白梨基因組數(shù)據(jù)，挖掘了與果實(shí)品質(zhì)和物候期相關(guān)的重要基因和調(diào)控因子。Zhu等[74]運(yùn)用基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組等組學(xué)方法對(duì)610份番茄材料進(jìn)行多組學(xué)分析，構(gòu)建了番茄多組學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，涉及代謝物-遺傳位點(diǎn)-基因三者之間的關(guān)系，其中包括371種代謝物質(zhì)，970個(gè)遺傳位點(diǎn)和535個(gè)基因。這些數(shù)據(jù)不僅加速了番茄風(fēng)味相關(guān)候選基因的鑒定，而且有助于其代謝途徑的解析。這也是首次利用多組學(xué)的手段解析作物在育種過程中代謝物的變化，為番茄品質(zhì)的改良奠定了理論基礎(chǔ)[74]。

這些多組學(xué)聯(lián)合分析的方法，未來可以更多運(yùn)用于梨果實(shí)品質(zhì)的研究，破譯與梨果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的“基因密碼”，形成果實(shí)品質(zhì)調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)，有助于提高我們從遺傳和代謝等方面理解對(duì)梨果實(shí)品質(zhì)的調(diào)控機(jī)制。

5.3改進(jìn)遺傳轉(zhuǎn)化方法創(chuàng)制梨優(yōu)質(zhì)果實(shí)新種質(zhì)

遺傳轉(zhuǎn)化可以通過定向引入外源基因有目的地改良作物品種，加快作物的育種進(jìn)程[75]。目前，梨主要通過莖尖、葉片、子葉、花藥等外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因?qū)隱76-81]。雖然梨的組織培養(yǎng)與遺傳轉(zhuǎn)化研究已有20多年，但仍然受到基因型的影響，能穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和再生的基因型有限，而且利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法需經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、抗生素篩選、再生等階段，各階段都受到多種因素影響，再生體系轉(zhuǎn)化效率較低[82]，這些方面都制約了通過轉(zhuǎn)基因和基因編輯手段定向改良梨品質(zhì)以及相關(guān)功能基因的研究。因此，今后在梨組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化方面可以從以下2個(gè)方面進(jìn)行嘗試：

5.3.1利用基因槍進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化基因槍可以將外源DNA分子直接導(dǎo)入細(xì)胞，并且與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法相比，可轉(zhuǎn)化的品種和基因型范圍更廣[83]。目前基因槍轉(zhuǎn)化的方法已經(jīng)在多種作物（水稻、小麥、大豆等）中成功實(shí)現(xiàn)。Scorza等[84]將基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法結(jié)合起來使用，葡萄的遺傳轉(zhuǎn)化率有所提升。梨的遺傳轉(zhuǎn)化也可以嘗試將這2種方法聯(lián)合起來使用，提高單獨(dú)使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化效率低的問題。

5.3.2挖掘和利用能提高梨組織培養(yǎng)再生能力和遺傳轉(zhuǎn)化效率的生長(zhǎng)調(diào)控因子植物莖頂端分生組織形成和其再生能力保持的分子機(jī)制解析，對(duì)于改良遺傳轉(zhuǎn)化具有重要作用。目前研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些生長(zhǎng)調(diào)控因子與植物的遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)。Wuschel（Wus）是調(diào)控莖端分生組織的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能保持分生組織中心區(qū)域細(xì)胞的分裂能力[85];Baby boom（Bbm）是AP2/ERF家族的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，與植物的分生組織發(fā)育有關(guān)[86]。Lowe等[87]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)玉米的Bbm和Wus2基因可以將玉米的轉(zhuǎn)化效率提高到25%～50%，并且在很難轉(zhuǎn)化的玉米品種PHH5G中也能成功轉(zhuǎn)化。Debernardi等[88]將生長(zhǎng)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子GRF4與其輔助因子GIF1綁定在一起形成GRF4-GIF1復(fù)合蛋白體，研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)該復(fù)合蛋白體顯著提高了小麥的再生能力，并且拓寬了可轉(zhuǎn)化的基因型范圍。GRF4-GIF1復(fù)合蛋白體不僅在單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化中起作用，還可以提高雙子葉植物柑橘的再生效率。梨是雙子葉植物，而且GRF和GIF蛋白在植物中具有高度保守性[88]，因此可嘗試將GRF4-GIF1復(fù)合蛋白體表達(dá)技術(shù)擴(kuò)展應(yīng)用于梨的遺傳轉(zhuǎn)化中。

5.4利用基因編輯技術(shù)創(chuàng)制梨優(yōu)質(zhì)果實(shí)新種質(zhì)

基因編輯技術(shù)是生物領(lǐng)域的一項(xiàng)技術(shù)飛躍，科研工作者可以通過基因編輯技術(shù)精準(zhǔn)定向改造作物。CRISPR/Cas9技術(shù)是基因編輯的一種，因其簡(jiǎn)單高效使得該技術(shù)快速發(fā)展[89-90]，被應(yīng)用于多種作物的性狀改良上。與轉(zhuǎn)基因相比，CRISPR/Cas9技術(shù)在對(duì)特定基因進(jìn)行修飾后，可以通過雜交或者自交的方式分離掉外源基因，這為改良后的作物產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了機(jī)遇。

CRISPR/Cas9技術(shù)在梨上已開始應(yīng)用[91]。但是僅在第一代株系或者在梨的愈傷組織中Cas9的編輯效率較高。到了第二代株系，Charrier等[92]發(fā)現(xiàn)編輯過的梨植株大多數(shù)是以嵌合體形式存在，并且因?yàn)槔孀越徊挥H和，不能通過自交的方式將嵌合體去除。為了克服CRISPR/Cas9技術(shù)在梨應(yīng)用上的限制，Malabarba等[93]將編輯過的T0代植株再次進(jìn)行不定芽的再生，可有效降低嵌合體產(chǎn)生。隨著基因編碼技術(shù)的發(fā)展，基于CRISPR/Cas9技術(shù)的單堿基編輯技術(shù)可以在基因組定點(diǎn)對(duì)單個(gè)堿基進(jìn)行精準(zhǔn)編輯，例如胞嘧啶堿基編輯技術(shù)（Cytosine base editor， CBE）、引導(dǎo)編輯技術(shù)（Prime editing， PE）[94]。2017年開始，科學(xué)家先后嘗試將該技術(shù)應(yīng)用在多種植物上，目前主要在大田作物上應(yīng)用，例如水稻NRT1.1B和SLR1基因的編輯，分別提高了氮的利用率和降低了水稻植株高度[95]。該技術(shù)在梨上的應(yīng)用才剛開始，Charrier等[92]通過單堿基編輯技術(shù)編輯ALS和PDS基因，成功獲得了抗氯磺隆和白化的梨株系。未來該技術(shù)可以更多地應(yīng)用于梨優(yōu)異果實(shí)品質(zhì)相關(guān)基因的研究上。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2021-11-10

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX（20）3002]

作者簡(jiǎn)介：施露（1991-），女，浙江安吉人，博士，助理研究員，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)調(diào)控。（E-mail） lus202010@163.com

通訊作者：梁穎，（ E-mail）lyjaas@163.com;張志勇，（E-mail）yzuzzy@163.com