王 彬，文 琳，劉詩羽，趙紅瓊，郝智慧*

(1.新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊 830052；2.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，中獸醫(yī)藥創(chuàng)新中心，北京海淀 100193)

隨著集約化養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，動物疾病嚴重威脅著畜牧養(yǎng)殖業(yè)的安全。數據表明，我國細菌性疫病高達111種，占動物傳染病種類的50%以上[1-2]，給畜牧生產造成了巨大的損失。且隨著我國“禁抗令”的全面推行，中草藥和天然藥物成為當今的研究重點。據Wikins等[3]報道，世界上有1389種植物有成為抑菌劑的可能，且研究表明植物精油具有廣譜高效的抗菌活性[4-5]。目前有大量關于植物精油抑菌的研究，都證明了植物精油對細菌或霉菌有一定的抑制效果[6-7]，其中研究表明山蒼子精油具有多種生物活性，可以抑制多種致病菌[8-9]，但尚未有單獨使用山蒼子精油為主要成分的溶液劑抑菌的研究。

本試驗通過測定山蒼子精油中主要活性成分的含量、山蒼子精油原油的抑菌效果、以及輔料的篩選，制備出6種不同配方的山蒼子精油的溶液劑。并且通過檢測上述溶液劑對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和白色念珠菌的最小抑菌濃度(MIC)來比較不同山蒼子精油溶液劑的抑菌效果，為山蒼子精油溶液劑在細菌病的防治和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)，大腸埃希氏菌(8099)，白色念珠菌(ATCC 10231)，中國工業(yè)微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 主要試劑 MH肉湯培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司產品；大豆酪蛋白瓊脂(TSA)培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術有限責任公司產品；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術有限責任公司產品；LB肉湯培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術有限責任公司產品；丙三醇，丙二醇，無水乙醇，吐溫-80，國藥集團化學試劑有限公司產品；山蒼子精油，青島植物當家生物科技有限公司產品；檸檬醛標準品，AccuStandard公司產品。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(SW-CJ-2FD)，蘇州凈化設備有限公司產品；恒溫生化培養(yǎng)箱(LRH-250F)，恒溫生化搖床(HZQ-X300C)，上海一恒科學儀器有限公司產品；高壓蒸汽滅菌鍋(Gi80DS)，ZEALWAY公司產品；電子天平(ME203)，梅特勒-托利多集團產品；麥氏濁度儀(WGZ-2XJB)，上海昕瑞儀器儀表有限公司產品；烘箱，上海精宏實驗設備有限公司產品；牛津杯，福建艾杰爾進出口有限公司產品；游標卡尺(NR0158)，銳能公司產品；氣質聯用儀(exactive GC orbitrap)，Thermo Fisher科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 氣質聯用儀檢測山蒼子精油主要成分含量 將山蒼子精油原油通過氣質聯用儀測定其組分含量。根據GB 1886.35-2015方法進行檢測，檢測條件如下：

固定相：聚乙二醇。膜厚：0.25 μm。色譜爐溫度：線性程序升溫從70℃～250℃，速度2℃/min。進樣口溫度：250℃。檢測器溫度：250℃。檢測器：氫火焰離子化檢測器。載氣：氮氣。載氣流速：1 mL/min。進樣量：約0.3 μL。分流比：100∶1。

質譜儀條件參數：傳輸管溫度250℃，掃描范圍50～500Da。

1.2.2 體外抑菌試驗 在無菌條件下，取生長至3代～18代的菌株平板，取典型單菌落，用滅菌的PBS溶液稀釋成含菌(1×105～5×105)CFU/mL的菌懸液，取150 μL菌懸液涂布于平板培養(yǎng)基。取1只滅菌的牛津杯放于涂好菌液的平板培養(yǎng)基上，在牛津杯中加入150 μL的山蒼子精油，蓋好皿蓋。金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌用營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，白色念珠菌用TSA平板培養(yǎng)基置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后測量抑菌圈大小。每組試驗重復3次。

抑菌圈判定的標準為[10]：抑菌圈直徑>20 mm為極敏感，15 mm～20 mm為高度敏感，10 mm～14 mm為中度敏感，7 mm～9 mm為低度敏感，<7 mm為無抑菌作用或者不敏感，抑菌圈直徑與抗菌活性成正比。

1.2.3 溶劑篩選試驗 選取幾種常用的輔料助劑，將山蒼子精油與單個輔料助劑等比混合，靜置后，觀察山蒼子精油在輔料中的溶解度。篩選出山蒼子精油溶解度好且溶液劑穩(wěn)定的輔料助劑。

1.2.4 山蒼子精油溶液的制備 根據篩選出的輔料助劑，按照表1中的配方，將山蒼子精油配制成不同濃度的山蒼子精油溶液劑。

表1 6種山蒼子精油溶液劑的不同配方表

1.2.5 溶液劑最小抑菌濃度檢測 在無菌環(huán)境下，取長有第3代～第14代菌株[11]的平板，挑取具有典型特征的單菌落于無菌的MH肉湯中制得約含1×106CFU/mL的菌液備用。取U型底的96孔培養(yǎng)板，第1列加入配制好的山蒼子精油溶液劑200 μL，其余各孔加入無菌MH肉湯100 μL，按照倍比稀釋的方法稀釋山蒼子精油溶液劑，混勻后加入備用的菌液，使培養(yǎng)板中菌液的最終濃度保持為5×105CFU/mL。同時設立細菌陽性對照組和陰性對照組。將96孔培養(yǎng)板置于溫度適宜的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h～24 h后，讀取結果并做好記錄[12]。試驗重復3次。

2 結果

2.1 山蒼子精油主要成分的檢測結果

山蒼子精油GC-MS的色譜譜圖如圖1所示。經GC-MS檢測分析及點對點法計算，本次使用的山蒼子精油中檸檬醛的含量為19.87μg/mL。

2.2 山蒼子精油的體外抑菌試驗結果

根據十字交叉法測定山蒼子精油原油對金黃色葡萄球菌ATCC 6538、大腸埃希氏菌8099和白色念珠菌ATCC 10231的抑制效果如表2所示。山蒼子精油對金黃色葡萄球菌ATCC 6538的3次試驗結果分別為27.5 mm、29.0 mm、24.0 mm；對大腸埃希氏菌8099的3次試驗結果分別為21.0 mm、23.5 mm、21.0 mm；對白色念珠菌ATCC 10231的3次試驗結果分別為27.0 mm、24.0 mm、25.5 mm，試驗結果表明其抑菌圈直徑均 > 20 mm，表示此3種菌株對山蒼子精油的抑制極為敏感。且從表2中可以看出，本試驗中的山蒼子精油對金黃色葡萄球菌ATCC 6538和白色念珠菌ATCC 10231的抑制效果優(yōu)于大腸埃希氏菌8099。

注：A.檸檬醛標準品的圖譜，B.山蒼子精油的圖譜Note:A.The chromatogram of citral standard,B.The chromatogram of Litsea cubeba essential oil

表2 山蒼子精油的抑菌試驗結果

2.3 溶劑篩選結果

從表3中可以看出，山蒼子精油不溶于丙三醇，其與丙三醇混合靜置后會出現分層現象。山蒼子精油分別加入至丙二醇、吐溫-80和無水乙醇中混勻靜置后得到一種穩(wěn)定的溶液，且保存一定時間后未出現沉淀和分層現象，表示山蒼子精油可以溶于上述溶劑。通過上述結果可以看出，山蒼子精油不溶于丙三醇，但是可以溶于丙二醇、吐溫-80和無水乙醇。

表3 山蒼子精油的溶解情況

2.4 不同山蒼子精油溶液劑對金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)的MIC的測定結果

分別用6種不同配方的山蒼子精油溶液劑對金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)進行最小抑菌濃度檢測，結果如表4所示。其中溶液劑A、溶液劑D和

溶液劑F的抑菌效果最好，其MIC值均為1.95 μL/mL。而溶液劑B和溶液劑C的抑菌效果最差，其MIC值為125.00 μL/mL。溶液劑E的抑菌效果介于二者之間，其MIC值為62.50 μL/mL。

表4 不同山蒼子精油溶液劑對金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)的MIC結果

2.5 不同山蒼子精油溶液劑對大腸埃希氏菌(8099)的MIC的測定結果

分別用6種不同配方的山蒼子精油溶液劑對大腸埃希氏菌(8099)進行最小抑菌濃度檢測，結果如表5所示。其中溶液劑B和溶液劑C對大腸埃希氏菌的抑制效果最好，其MIC值均為125.00 μL/mL。而溶液劑D對大腸埃希氏菌的抑制效果最差，其MIC值為500.00 μL/mL。溶液劑A、溶液劑E和溶液劑F的抑菌效果相同，且MIC值介于上述二者之間，其MIC值均為250.00 μL/mL。

表5 不同山蒼子精油溶液劑對大腸埃希氏菌(8099)的MIC結果

2.6 不同山蒼子精油溶液劑對白色念珠菌(ATCC 10231)的MIC的測定結果

分別用6種不同配方的山蒼子精油溶液劑對白色念珠菌(ATCC 10231)進行最小抑菌濃度檢測，結果如表6所示。結果顯示，在3次重復試驗中，6種不同配方的山蒼子精油溶液劑對白色念珠菌(ATCC 10231)均未表現出抑制菌株生長的效果。

表6 不同山蒼子精油溶液劑對白色念珠菌(ATCC 10231)的MIC結果

2.7 不同山蒼子精油溶液劑的MIC結果對比

如圖2所示，6種山蒼子精油溶液對白色念珠菌(ATCC 10231)均無抑制效果，但對金黃色葡萄球菌的抑制效果均高于對大腸埃希氏菌的抑制效果。溶液劑A和溶液劑F對3種菌株的抑菌效果相同，均顯示出其對金黃色葡萄球菌的抑制效果明顯優(yōu)于大腸桿菌，二者之間相差大約為128倍。溶液劑B和溶液劑C對3種菌株的抑制效果相同，其對金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌的MIC均為125.00 μL/mL。溶液劑D對此3種菌株的抑菌效果差異最大，此溶液劑對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好(MIC1.95 μL/mL)，對大腸埃希氏菌的抑制效果最差(MIC為500.00 μL/mL)，二者之間相差大約為256倍。溶液劑E對3種菌株的抑制效果存在差異，對金黃色葡萄球菌的MIC為62.50 μL/mL，對大腸埃希氏菌的MIC為250.00 μL/mL，二者之間抑菌濃度相差4倍。

圖2 不同山蒼子精油溶液劑的MIC值

3 討論

山蒼子精油是天然植物精油具有防腐保鮮、趨避害蟲等多種活性，且大量研究表明山蒼子精油具有很好的抗菌作用[13-14]，然而目前還未有以山蒼子精油為單獨有效成分的溶液劑抗菌研究。本試驗中首先檢驗了山蒼子精油中主要成分檸檬醛的含量，并驗證了山蒼子精油的抑菌效果。然后進行了輔料的篩選，并制備了6種不同配方的山蒼子精油溶液劑，并且通過測定上述溶液劑的最低抑菌濃度(MIC)評價了山蒼子精油溶液劑對金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、大腸埃希氏菌(8099)和白色念珠菌(ATCC 10231)的抑菌效果。

表2中山蒼子精油原液對3種菌株的抑菌圈直徑均>20 mm，表現為菌株對山蒼子精油的抑制極敏感，證明了山蒼子精油對上述3種菌株具有很好的抑制效果。且可看出山蒼子精油對金黃色葡萄球菌ATCC 6538和白色念珠菌ATCC 10231的抑制作用優(yōu)于大腸埃希氏菌8099。

從圖2和表4可看出在受試的6種不同配方的山蒼子精油溶液劑中，抑菌效果最好的溶液劑A、溶液劑D和溶液劑F在達到最低抑菌濃度時所使用的山蒼子精油的濃度低于王小麗等[15]應用純山蒼子精油進行最小抑菌濃度的精油濃度。故推測，本研究中選用的溶液劑的輔料增加了一定的抑制金黃色葡萄球菌的效果。而溶液劑B和溶液劑C對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最差，在溶液劑濃度為125.00 μL/mL時才能達到抑制細菌生長的效果，此結果結合表1可以推斷出溶液劑中山蒼子精油含量的多少影響了山蒼子精油溶液劑對金黃色葡萄球菌的抑制效果。

6種山蒼子精油溶液劑對大腸埃希氏菌的抑菌效果如圖2和表5所示，抑菌效果最好的是溶液劑B和溶液劑C，其MIC均為125.00 μL/mL。但是在上述2種溶液劑達到最低抑菌濃度時所使用的山蒼子精油的濃度高于吳均等[16]應用純山蒼子精油進行最小抑菌濃度的精油濃度，這可能是由于本文中使用的山蒼子精油溶液劑中精油濃度較低，減弱了山蒼子精油抑制大腸埃希氏菌的能力，或因溶液劑中輔料的配比沒有達到最佳的比例而導致其對大腸埃希氏菌的抑制效果減弱，后續(xù)還應繼續(xù)進行驗證和研究。

根據圖2和表6的結果，可以看出山蒼子精油溶液劑對白色念珠菌無抑制效果，而根據表2的結果表明山蒼子精油原油對白色念珠菌是有抑菌作用的，出現此結果的原因推測可能是因為山蒼子精油中抑制白色念珠菌成分的含量變化引起的。研究表明，山蒼子精油是通過抑制白色念珠菌初始階段生物被膜的形成而達到抑制菌株生長的效果，但是其不能殺滅酵母細胞體[17]。因此推測，在將山蒼子精油配制為山蒼子精油溶液劑的過程中，對抑制白色念珠菌被膜的有效成分進行了稀釋，達不到抑制濃度，故此山蒼子精油溶液劑失去了抑制白色念珠菌的能力；或者是在配制山蒼子精油溶液劑的過程中，山蒼子精油中抑制白色念珠菌被膜的主要成分與溶液劑輔料發(fā)生反應而失去活性，故此山蒼子精油溶液劑失去抑制白色念珠菌的能力。后續(xù)還應繼續(xù)進行驗證和研究。

綜上所述可以得出結論，此6種山蒼子精油溶液劑對革蘭氏陽性菌的抑菌效果最好，對革蘭氏陰性菌有一定的抑菌效果，但是沒有對革蘭氏陽性菌的抑菌效果好，且此6種山蒼子精油溶液劑對真菌無抑菌效果。通過本試驗的研究，為以山蒼子精油為主要成分的溶液劑的抑菌效果研究提供了一定的數據支撐。