李春花，李忠新，張春雷，曾學輝，陳甜甜，宋林立

在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)發(fā)病早期，由于臨床表現(xiàn)不明顯，極易被忽略，導致病情進展。若未能及時接受治療，CHB患者病情可進一步進展為肝硬化、肝細胞癌(HCC)或終末期肝病[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，大部分CHB患者存在程度不一的肝纖維化，早期積極干預可有效逆轉病變[3-5]，故及早評估CHB患者肝纖維化程度可為臨床干預提供指導，有效改善預后。臨床上，針對CHB患者肝纖維化程度的判斷多依賴于肝穿刺組織學檢查[6]，但肝活檢操作本身具有創(chuàng)傷性，可重復性差，且容易受取樣誤差等因素影響結果，在實際應用中面臨一定的限制。故探尋無創(chuàng)、操作性強、可重復性好且準確性良好的評估手段已成為臨床相關研究的重點。血清學標志物作為一類非創(chuàng)傷性檢測指標被廣泛應用于多種疾病的診斷。成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factors-21，F(xiàn)GF-21)作為近年來被發(fā)現(xiàn)的一類分泌性蛋白，由肝臟細胞分泌產(chǎn)生，并以肝臟為靶器官，發(fā)揮抑制氧化應激反應和炎癥反應、調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用[7]，可有效降低肝損傷，但有關其與肝纖維化關系方面的研究仍較少。血小板衍生生長因子-BB(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)為肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)的有絲分裂原，被認為可能參與肝纖維化進展過程[8]。纖維蛋白(fibrosin，F(xiàn)BRS)系一類由CD4+T細胞產(chǎn)生的細胞因子，具有一定的促纖維化作用[9]。本研究檢測了不同肝纖維化程度的CHB患者血清這些細胞因子的水平變化，以探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2020年1月～2021年1月我院收治的CHB患者92例，男性61例，女性31例；年齡為21～53歲，平均年齡為(34.3±8.5)歲。診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》的標準[10]。排除標準：(1)合并甲型、丙型肝炎病毒或HIV感染者；(2)自身免疫性、藥物性、酒精性肝病患者；(3)合并惡性腫瘤、嚴重的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和血液系統(tǒng)疾病者；(4)妊娠期或哺乳期婦女。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審批通過，所有受試者簽署知情同意書。

1.2 肝活檢 患者取左側臥位或平臥位，在超聲導引下行肝穿刺檢查，取出肝組織，固定于10%甲醛溶液內(nèi)、送檢。按照《肝纖維化診斷及療效評估共識》[11]進行肝纖維化分期評估，非顯著性肝纖維化為S0～1期，顯著性肝纖維化為S2～4期，其中S0期為無纖維化表現(xiàn)；S1期為存在匯管區(qū)纖維化擴大，纖維化僅局限于竇周和小葉內(nèi)；S2期為匯管區(qū)周圍發(fā)生纖維化，伴隨纖維間隔產(chǎn)生，保留小葉結構；S3期為形成纖維間隔，出現(xiàn)小葉結構紊亂，無肝硬化；S4期為早期肝硬化。

1.3 實驗室指標檢測 采集空腹外周靜脈血4ml，分為2份，其中1份及時分取血清，采用ELISA法檢測血清FGF-21和PDGF-BB水平(北京普利萊基因技術有限公司)；使用南京貝登醫(yī)療股份有限公司生產(chǎn)的邁瑞B(yǎng)S-280型全自動生化分析儀檢測血生化指標，計算肝纖維化指數(shù)-4(fibrosis-4，F(xiàn)IB-4)=年齡×AST/(血小板計數(shù)×ALT1/2)；使用邁瑞B(yǎng)C-5000型全自動血細胞分析儀檢測血常規(guī)；使用全自動免疫分析儀檢測血清HBsAg和HBeAg(美國Abbott公司)；使用德國羅氏公司Light Cycler熒光定量PCR儀檢測血清HBV DNA(深圳匹基生物工程股份有限公司)；采用放射免疫法檢測血清透明質酸(hyaluronic acid，HA)、層粘連蛋白(laminin，LN)、Ⅳ型膠原(type Ⅳ collagen，ⅣC)和Ⅲ型前膠原(procollagen Ⅲ，PCⅢ，廈門波生生物技術有限公司)；對另一份血液標本，采用實時熒光定量PCR法測定FBRS mRNA水平，具體步驟如下：采用Ficoll-Hyapque密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMCs)，加入Trizol試劑提取總RNA，使用NanoDrop 2000微量紫外可見分光光度計檢測RNA濃度和質量，置入-80°冰箱凍存?zhèn)溆?。應用Primer Premier 5.0基因設計軟件設計引物，F(xiàn)BRS正向引物序列：5'-CCTGCCTTCCGGGGCCCTAT-3'，反向引物序列：5'-TGGGGCCCCTGGGCTTTCTT-3'。PCR反應體系：dd H2O 32.5μl，10×LA PCR Buffer 5μl，dNTP Mixture(10mM) 8 μl，正反向引物各1 μl，模板2 μl，TakaRa LA Taq 6 μl，總反應體系為50 μl。PCR反應設定：預變性：95℃ 3 min，PCR擴增：95℃ 30 s，56℃ 30 s，72 ℃ 90 s，擴增35個循環(huán)，延伸：72 ℃ 10 min，冷卻：16℃ 10 min。將GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△CT法計算FBRS mRNA相對水平。

1.4 肝臟硬度檢測(LSM) 使用法國EchoSens公司提供的Fibroscan檢測。

2 結果

2.1 組織病理學檢查情況 經(jīng)肝組織病理學檢查，在92例CHB患者中，發(fā)現(xiàn)S0期12例，S1期37例，S2期16例，S3期15例，S4期12例，其中非顯著性肝纖維化組49例，顯著性肝纖維化組43例。

2.2 兩組基線資料比較 顯著性肝纖維化組血清AST、ALT、FIB-4、LSM、LN、PCⅢ、PDGF-BB和PBMCs FBRS水平均顯著高于非顯著性肝纖維化組(P<0.05)，而血清FGF-21水平顯著低于非顯著性肝纖維化組(P<0.05，表1)。

表1 兩組基線資料比較

2.3 FGF-21、PDGF-BB和FBRS診斷CHB患者顯著性肝纖維化的效能分析 四項指標聯(lián)合診斷的效能顯著高于各單項指標(表2、圖1)。

表2 各指標診斷CHB患者顯著性肝纖維化的效能

圖1 各指標診斷CHB患者顯著性肝纖維化的ROC曲線

3 討論

肝纖維化為多種致病因素作用下肝內(nèi)纖維組織異常增生的病理學過程。若肝損傷、肝細胞炎癥壞死等致病因素持續(xù)存在，則肝纖維化將持續(xù)存在，直至出現(xiàn)肝小葉結構改變、假小葉形成，形成早期肝硬化[12-14]。肝纖維化屬于機體面對肝臟炎癥的一種修復反應，但其過度增生可使肝小葉結構發(fā)生破壞，阻礙局部淋巴回流和血液流通，從而導致門脈高壓癥。雖然造成肝細胞損傷的因素較為復雜，但肝纖維化的形成主要與肝星狀細胞(HSC)相關[15,16]。在HSC異常激活的情況下，細胞外基質可被大量分泌，同時參與降解細胞外基質的基質金屬蛋白酶活性降低或合成減少，導致肝內(nèi)纖維基質沉積增多，而在這一過程中各種細胞因子發(fā)揮了重要的作用。本研究結果顯示，顯著性肝纖維化患者肝損傷更為明顯，血清FGF-21水平顯著低于非顯著性肝纖維化組。FGF21屬于一類脂肪細胞因子，在正常情況下由肝臟脂肪細胞分泌，可參與調(diào)節(jié)胰島素敏感性，降低胰島素抵抗并減少脂肪變性，進而增加能量消耗。當CHB患者發(fā)生脂質代謝異常時，可引起細胞外基質合成途徑改變，促進HSC活化，加重肝纖維化，而此時FGF21可通過對氧化應激反應的抑制改善對乙酰氨基酚造成的肝損傷。同時，它可參與抑制HSC活化，減輕肝纖維化程度[17]。隨著CHB患者病情持續(xù)進展，循環(huán)FGF21由最初的代償性升高逐漸演變?yōu)榉置诓蛔?，肝纖維化程度可進一步加重。

HBV感染系肝纖維化的常見誘因，肝臟可出現(xiàn)實質性損傷，出于機體自身修復反應，肝臟局部纖維組織可發(fā)生顯著增生。雖然肝組織病理性檢查可作為肝纖維化診斷的金標準，但其具有創(chuàng)傷性，慢性肝病患者接受檢查的依從性較差。目前，臨床上常用的肝損傷血清指標在評估肝纖維化時往往容易受局部炎癥反應的影響，診斷效能不高。相關研究指出，肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)為HSC激活、細胞外基質大量分泌[18]，而期間各類細胞因子對HSC的調(diào)節(jié)、活化作用以及對細胞外基質的降解平衡均可參與肝纖維化的發(fā)生過程。在本研究，顯著性肝纖維化組血清PDGF-BB和PBMCs FBRS mRNA水平顯著高于非顯著性肝纖維化組，經(jīng)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB和FBRS診斷CHB患者顯著性肝纖維化的AUC分別為0.714和0.690，診斷的敏感度和特異度分別為69.8%和69.4%及65.1%和73.5%。當上述指標與FGF-21和LSM聯(lián)合診斷時，其AUC可達到0.989，敏感度和特異度分別為95.3%和63.3%，提示聯(lián)合多種指標診斷CHB患者顯著性肝纖維化具有良好的效能，但其特異度還不夠高。PDGF-BB屬于HSC的有絲分裂原。當CHB患者發(fā)生肝纖維化時，HSC、肝竇內(nèi)皮細胞、庫普弗細胞在慢性炎癥刺激下可生成并分泌PDGF-BB，而PDGF-BB可進一步與HSC所表達的受體結合，刺激HSC活化和增殖[19,20]，從而促進肝纖維化的發(fā)生。FBRS可經(jīng)由成纖維細胞和T淋巴細胞等多種細胞分泌產(chǎn)生，在CHB患者肝損傷和肝纖維化進展過程中，受炎癥刺激而活化的HSC和淋巴細胞均可合成并分泌FBRS，而FBRS可進一步刺激HSC活化、膠原分泌和成纖維細胞增殖，從而加重肝纖維化程度。