谷胱甘肽過氧化物酶在膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)及對(duì)生存預(yù)后的影響

任曉梅，張 立，辛 寶，錢文文，夏曾潤(rùn)，祁 蒙，杜小平，史傳道，劉啟玲，張榮強(qiáng)

1陜西中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，陜西咸陽 712046 2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科，山東煙臺(tái) 264000 3安康市富硒產(chǎn)品研發(fā)中心，陜西安康 725000 4陜西中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，陜西咸陽 712046

膠質(zhì)瘤是一種人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的腫瘤，具有較強(qiáng)的侵襲性。根據(jù)惡性程度，世界衛(wèi)生組織將其分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，其中Ⅰ、Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤的增殖性低、不具有侵襲性，患者的預(yù)后相對(duì)較好，稱為低級(jí)別膠質(zhì)瘤(low grade glioma，LGG)。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)為Ⅳ級(jí)，其惡性程度高，呈現(xiàn)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，且具有壞死傾向[1]，預(yù)后極差，中位總體生存時(shí)間約14.6個(gè)月[2]，被公認(rèn)為是最致命的膠質(zhì)瘤[3]。谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)是人體主要的過氧化物分解酶，其家族包含8種亞型(GPX1～GPX8)，在體內(nèi)發(fā)揮重要的抗氧化作用[4]。目前，GPX家族基因?qū)δz質(zhì)瘤的影響及作用機(jī)制尚不清楚。本研究擬從腫瘤基因圖譜計(jì)劃(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫獲取膠質(zhì)瘤患者的臨床數(shù)據(jù)及其GPX家族基因表達(dá)譜，利用生物信息學(xué)技術(shù)分析GPX在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤樣本中表達(dá)情況及其對(duì)患者預(yù)后的影響，篩選出影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素并建立預(yù)測(cè)模型，探索GPX在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，為預(yù)測(cè)患者生存期限和制定靶向治療措施提供依據(jù)。

資料和方法

數(shù)據(jù)收集從TCGA數(shù)據(jù)庫(https：//cancergenome.nih.gov)中獲取膠質(zhì)瘤患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，根據(jù)腫瘤分級(jí)將其分為GBM和LGG兩組。同時(shí)選取TCGA數(shù)據(jù)庫中5例癌旁組織與基因型和基因表達(dá)量關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫中的2642例正常組織作為對(duì)照組，分析GPX1～GPX8基因在腫瘤組織和對(duì)照組中表達(dá)水平的差異。

生存與預(yù)后分析采用Kaplan-Meier生存分析和Cox回歸分析不同GPX表達(dá)水平患者的總生存率(overall survival，OS)、無病生存期(disease-free survival，DFS)、疾病特異性生存期(disease-specific survival，DSS)和無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)的情況。

生存預(yù)后的影響因素分析利用多因素和單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析判定GPX表達(dá)水平、年齡、性別、腫瘤分期、治療方式等因素與患者OS之間的關(guān)系，從而篩選出與膠質(zhì)瘤患者OS存在顯著相關(guān)性的危險(xiǎn)因素。

最小絕對(duì)收縮選擇算子模型構(gòu)建最小絕對(duì)收縮選擇算子(least absolute shrinkage and selection operator，Lasso)回歸是一種基于懲罰的變量選擇方法。為驗(yàn)證Cox回歸分析結(jié)果，本研究進(jìn)一步通過R語言“glmnet”程序，采用Lasso回歸法對(duì)GPX1～GPX8 8個(gè)變量進(jìn)行降維處理，進(jìn)而篩選影響膠質(zhì)瘤患者的危險(xiǎn)因素。Lasso模型中的最優(yōu)參數(shù)(λ)選擇通過最小標(biāo)準(zhǔn)使用5倍交叉驗(yàn)證，部分似然偏差為軸，log(λ)為X軸。

生存預(yù)測(cè)模型的建立基于Cox和Lasso回歸得到的危險(xiǎn)因素建立膠質(zhì)瘤患者列線圖預(yù)測(cè)模型。列線圖是一種可視化的回歸模型，根據(jù)預(yù)測(cè)模型中自變量回歸系數(shù)制定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，然后給每個(gè)自變量一個(gè)評(píng)分值，從而計(jì)算出每例患者的總分，最后通過總得分與預(yù)后概率之間的轉(zhuǎn)換函數(shù)計(jì)算每例患者的預(yù)后概率[5- 6]。

危險(xiǎn)因素驗(yàn)證中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計(jì)劃數(shù)據(jù)庫中下載數(shù)據(jù)集mRNA-seq_325，收集患者的基因表達(dá)和生存資料，將篩選出來的影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素進(jìn)行再次驗(yàn)證，確定其對(duì)患者預(yù)后的影響。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料的比較采用秩和檢驗(yàn)，使用R語言對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用R語言軟件包制作列線圖，計(jì)算一致性指數(shù)，并繪制校正曲線評(píng)估模型的預(yù)測(cè)效能。計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

基本特征共納入膠質(zhì)瘤患者663例，其中LGG 510例、GBM 153例，GBM患者的病死率顯著高于LGG患者(P=0.001)，男性患者明顯多于女性(P=0.036)，各族人群之間的患者分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.259)(表1)。

表1 兩組膠質(zhì)瘤患者的基本特征(n)

Kaplan-Meier生存分析對(duì)兩組膠質(zhì)瘤患者生存資料和臨床資料進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示LGG和GBM患者的DSS中位時(shí)間分別為7.6、1.2年，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；OS中位時(shí)間分別為6.5、1.1年，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；PFS中位時(shí)間分別為3.4、0.5年，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；但DFS中位時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

GPX家族基因mRNA表達(dá)情況與TCGA數(shù)據(jù)庫中2647例配對(duì)的正常人群比較，GPX1、GPX3、GPX4、GPX7、GPX8的表達(dá)在膠質(zhì)瘤患者中顯著升高(P均<0.001)，且除GPX3外，GBM患者的表達(dá)顯著高于LGG患者(P均<0.001)；膠質(zhì)瘤患者GPX2的表達(dá)顯著高于正常人群(P<0.001)，但是兩組患者之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LGG患者的GPX5的表達(dá)顯著低于正常人群(P<0.001)，但是兩組患者之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

GPX：谷胱甘肽過氧化物酶

GPX表達(dá)與兩組患者預(yù)后的關(guān)系為進(jìn)一步研究GPX基因表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的相關(guān)性，以GPX水平高低為分組依據(jù)，繪制Kaplan-Meier生存曲線，通過Log Rank法分別比較兩組患者生存曲線差異，結(jié)果顯示在GBM組，與低表達(dá)相比，GPX1(P=0.013)和GPX4(P=0.040)高表達(dá)患者的PFS明顯縮短(圖3)，GPX對(duì)患者OS、DSS和DFS無影響；在LGG組，GPX1、GPX7和GPX8高表達(dá)患者的OS、DSS和PFS明顯縮短(P均<0.001)(圖4)。

圖3 GPX1(A)和GPX4(B)表達(dá)與GBM患者預(yù)后的關(guān)系

圖4 GPX表達(dá)與LGG患者預(yù)后的關(guān)系

膠質(zhì)瘤患者生存預(yù)后的影響因素單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸顯示，年齡是影響GBM患者生存的因素，GPX表達(dá)對(duì)GBM患者生存無影響(圖5)。GPX7、GPX8、年齡和腫瘤分級(jí)是影響LGG患者生存的重要因素(圖6A)。為避免這4個(gè)因素之間的交互作用，進(jìn)一步進(jìn)行多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，結(jié)果提示GPX7和年齡是LGG患者生存的獨(dú)立影響因素(圖6B)。使用Lasso回歸將GPX1～GPX8納入進(jìn)行再次篩選，并使用交叉驗(yàn)證建立模型，進(jìn)一步分析GPX對(duì)LGG患者OS的影響，結(jié)果顯示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=0.2996×GPX7+0.3898×GPX8，即GPX7和GPX8是影響LGG患者生存預(yù)后的關(guān)鍵基因(圖7)。

圖5 單因素(A)和多因素(B)Cox回歸分析GBM患者預(yù)后

圖6 單因素(A)和多因素(B)Cox回歸分析LGG患者預(yù)后

圖7 LGG患者最小絕對(duì)收縮選擇算子關(guān)鍵基因篩選(A)和交叉驗(yàn)證(B)

LGG患者生存預(yù)測(cè)模型建立基于多因素Cox回歸結(jié)果構(gòu)建LGG患者OS列線圖，最終進(jìn)入模型的危險(xiǎn)因素為GPX7，一致性指數(shù)為0.843(95%CI=0.809～0.853)，表明該模型具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。為進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)效果，使用校正曲線對(duì)列線圖進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示預(yù)測(cè)效果基本上未偏離真實(shí)標(biāo)簽結(jié)果，再次證明該模型具有可靠的預(yù)測(cè)性能(圖8)。

圖8 LGG患者總生存率列線圖(A)及校準(zhǔn)曲線(B)

危險(xiǎn)因素驗(yàn)證中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計(jì)劃數(shù)據(jù)庫的mRNA-seq_325數(shù)據(jù)集中包含具有GPX7有效數(shù)據(jù)的LGG患者90例，驗(yàn)證結(jié)果顯示，與GPX7高表達(dá)組比較，低表達(dá)的LGG患者生存期限明顯延長(zhǎng)(P<0.001)(圖9)，與利用TCGA數(shù)據(jù)庫獲得的研究結(jié)果一致。

圖9 GPX7表達(dá)與中國(guó)LGG患者預(yù)后的關(guān)系

討 論

顱內(nèi)腫瘤是危害人類生命和健康的重要腫瘤之一，2018年全世界顱內(nèi)腫瘤新發(fā)病例接近30萬例，在全部惡性腫瘤新發(fā)病例中約占1.6%，位居惡性腫瘤發(fā)病順位的第17位[7]。其中膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤，其年發(fā)病率為5/10萬～8/10萬，5年病死率僅次于胰腺癌和肺癌[8]。臨床醫(yī)生通常根據(jù)年齡、病理分期、腫瘤類型等對(duì)患者的生存率進(jìn)行預(yù)測(cè)。GPX是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，能夠有效清除代謝中產(chǎn)生的過多的活性氧簇，減輕細(xì)胞氧化損傷，兩者在維持機(jī)體內(nèi)氧化-抗氧化平衡中發(fā)揮重要作用[2]。

研究顯示GPX1的表達(dá)狀態(tài)對(duì)GBM細(xì)胞的活力、遷移和侵襲能力有顯著的調(diào)控作用[9]。GPX4參與肝癌[10]、前列腺癌[11]、乳腺癌[12]等腫瘤的發(fā)生，其低表達(dá)水平能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[13]。GPX7能夠在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上介導(dǎo)蛋白質(zhì)的折疊[14]，其異常表達(dá)通過影響細(xì)胞氧化應(yīng)激和基因甲基化水平參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[15]。GPX的異常高表達(dá)能清除某些腫瘤藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧簇而出現(xiàn)耐藥[16]，進(jìn)而對(duì)腫瘤患者的預(yù)后造成影響。

本研究結(jié)合生存資料和臨床資料，對(duì)663例膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行了Kaplan-Meier生存分析，并利用生物信息學(xué)技術(shù)，分析其組織中GPX的表達(dá)情況，結(jié)果顯示GPX1、GPX3、GPX4、GPX7、GPX8的表達(dá)在膠質(zhì)瘤患者中明顯升高，且GBM組的表達(dá)水平顯著高于LGG組。進(jìn)一步關(guān)于GPX表達(dá)水平與患者生存分析結(jié)果顯示，GPX1和GPX4高表達(dá)的GBM患者PFS明顯縮短，GPX1、GPX7和GPX8高表達(dá)的LGG患者OS、DSS和PFS明顯縮短。

GPX4是一種單體蛋白，能夠通過高效還原磷脂過氧化物和抑制花生四烯酸的活化發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的作用。研究顯示NADH脫氫酶鐵-硫蛋白8高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肺癌患者的OS明顯縮短，而其表達(dá)水平與GPX4呈顯著正相關(guān)[17]。此外，細(xì)胞中的不飽和脂肪酸在受到氧化損傷時(shí)會(huì)產(chǎn)生磷脂氫過氧化物，進(jìn)而引發(fā)Fenton反應(yīng)，最終導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生[18]。近年來，誘導(dǎo)癌細(xì)胞鐵死亡已經(jīng)逐漸發(fā)展為一些腫瘤的治療措施。抑制GPX4的表達(dá)也因此成為潛在的抗癌策略[19]。本研究顯示GBM患者體內(nèi)GPX4呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)，患者無進(jìn)展生存期明顯縮短，嚴(yán)重影響預(yù)后，推測(cè)這可能與高表達(dá)的GPX4干擾了腫瘤細(xì)胞的鐵死亡及影響腫瘤代謝有關(guān)。

Cox和Lasso回歸分析結(jié)果顯示，GPX7、GPX8和年齡是LGG患者生存的獨(dú)立影響因素，但僅年齡是GBM患者生存的影響因素，GPX表達(dá)對(duì)GBM患者生存無影響，這可能與數(shù)據(jù)庫中GBM患者樣本量較小有關(guān)，有待于進(jìn)一步通過大樣本研究確定。

GPX1是一種機(jī)體內(nèi)廣泛存在的過氧化物分解酶，其在腫瘤中的作用目前尚無定論。陳文彬和鐘文洲[20]的研究結(jié)果提示，結(jié)直腸癌組織GPX1 mRNA的表達(dá)明顯低于癌旁組織。邵帥等[21]的研究顯示，在肺癌細(xì)胞模型BERP35T1細(xì)胞中，GPX1蛋白的過度表達(dá)可以通過緩解細(xì)胞DNA氧化損傷抑制癌細(xì)胞的惡性表型發(fā)揮腫瘤抑制作用。然而，在頭頸部腫瘤中，GPX1的表達(dá)增加，增強(qiáng)了腫瘤的增殖和侵襲能力[22]。有研究顯示GPX1的過表達(dá)與G蛋白α抑制活性肽2、蛋白酶體亞單位β10和Ras同源基因家族成員G表達(dá)呈顯著正相關(guān)，反映了GPX1對(duì)腫瘤發(fā)生、炎癥和血管生成的調(diào)控作用[23- 25]。研究顯示GPX1的異常表達(dá)可能與腫瘤患者對(duì)抗腫瘤藥物的耐藥相關(guān)，在順鉑耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，GPX1的表達(dá)明顯上調(diào)，而其表達(dá)下調(diào)又可以恢復(fù)癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[26]。本研究顯示GPX1是影響LGG患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，推測(cè)這可能與高表達(dá)的GPX1導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和腫瘤耐藥有一定關(guān)系。

GPX7是GPX家族中的非含硒成員，被稱為非硒代半胱氨酸。目前關(guān)于GPX7在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用說法不一。有研究顯示GPX7敲除小鼠的淋巴瘤、肺腺癌、白血病等多種腫瘤的發(fā)生率明顯增加[27]，食管腺癌組織中GPX7表達(dá)水平顯著低于正常食管組織[28]。但另有研究顯示甲狀腺癌組織中GPX7表達(dá)水平顯著升高，且其表達(dá)水平與腫瘤最大徑呈正相關(guān)[29- 30]。Guerriero等[31]研究顯示，與肝硬化對(duì)照組相比，肝癌細(xì)胞中GPX7的表達(dá)明顯升高，且在Ⅲ級(jí)肝癌細(xì)胞樣本比Ⅰ級(jí)肝癌細(xì)胞中的表達(dá)更高。GPX7過表達(dá)與羥烷基輔酶A脫氫酶表達(dá)呈正相關(guān)，而羥烷基輔酶A脫氫酶高表達(dá)的急性髓系白血病和腎透明細(xì)胞癌混著預(yù)后較差[32- 33]。本研究顯示TCGA數(shù)據(jù)庫中膠質(zhì)瘤患者的GPX7表達(dá)明顯升高，這與中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計(jì)劃數(shù)據(jù)庫中的驗(yàn)證結(jié)果一致，表明GPX7高表達(dá)是影響不同種族和地區(qū)LGG患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。筆者認(rèn)為GPX7的表達(dá)可能對(duì)腫瘤的發(fā)展具有雙重作用，需要更多的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和遷移過程中的作用及其機(jī)制。

有研究表明與正常組織相比，GPX8在胃癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與胃癌分期相關(guān)，表達(dá)水平越高的患者預(yù)后越差，而抑制GPX8的表達(dá)可以提高胃癌患者的生存率[34- 35]。在非小細(xì)胞肺癌患者中，GPX8能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，其高表達(dá)與病理分化不良、臨床分期較晚、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等造成不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素密切相關(guān)[36]。本研究GPX8在患者中呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)水平，且其高表達(dá)顯著影響LGG患者的預(yù)后，筆者推測(cè)GPX8可能通過多種途徑影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，進(jìn)而嚴(yán)重影響患者預(yù)后。

綜上，GPX7是影響LGG患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，通過降低GPX7的表達(dá)水平可能對(duì)改善患者預(yù)后發(fā)揮促進(jìn)作用。