雷公藤內(nèi)酯醇抑制LPS誘導(dǎo)小鼠ALI的生物作用機制

李婧嫻，馬飛越，孫守湖，趙慧琳，李佳齊，左言婧，呼顯生

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林 132109）

急性呼吸窘迫綜合征（Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS）是指由于各種肺內(nèi)和肺外致病因素所導(dǎo)致的急性彌漫性肺損傷，急性呼吸衰竭損傷（Acute Lung Injury，ALI）作為ARDS的早期和病程相對較輕的階段[1]，是臨床研究中經(jīng)常提到的一種急性肺水腫[2]。雷公藤內(nèi)酯醇（Triptolide，TPL）在臨床及實驗中表現(xiàn)出對胰腺炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等炎癥的抗炎作用，多項實驗證明其對白細(xì)胞介素-6（IL-6）的表達有影響[3-4]。據(jù)此設(shè)計TPL對IL-6的表達影響實驗，探究其對ALI的生理機制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

選取6～8周健康雄性BALB/c小鼠50只，使其自由采食，在適宜外界環(huán)境條件下自然飼養(yǎng)一周。實驗動物由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院實驗動物中心提供。

1.1.2 儀器與試劑

雷公藤內(nèi)酯醇，上海永葉生物科技有限公司；地塞米松（DXM）、2-硫代苯巴比妥酸，上海源葉生物科技有限公司；LPS（E. coli055: B5），北京酷來博科技有限公司；TNF-α、IL-6、GSH-Px等ELISA試劑盒，江蘇晶美生物科技有限公司；HE染液、MPO、MDA及瑞氏吉姆薩染液，北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、羧甲基纖維素鈉、二甲苯、中性樹脂片劑等，分析純，福晨化學(xué)試劑有限公司。

202-00A型恒溫箱，鶴壁市天冠儀器儀表有限公司；FA-2004型電子天平，上海邦億精密量儀有限公司；RD-315型切片機，沈陽源達鑫商貿(mào)有限公司；BS-1型立式恒溫振蕩培養(yǎng)箱，常州亞特實驗儀器有限公司；752型紫外分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性肺損傷模型建立

將50只小鼠隨機分為5組，每組10只，分別為空白對照組、LPS誘導(dǎo)組、LPS+地塞米松組（2 mg/kg）、LPS+TPL（12.5 μg/kg）組、LPS+TPL（50 μg/kg）組。實驗組小鼠連續(xù)4日按照上述劑量腹腔注射TPL或地塞米松，空白對照組與LPS誘導(dǎo)組注射等量緩沖液。最后一組注射完畢1 h后，20%烏拉坦溶液（0.2 mL/只）腹腔注射麻醉，待麻醉生效后將實驗組小鼠調(diào)整為豎直體位，從鼻部滴入100 μL的LPS（1 mg/mL）溶液，并以豎直體位旋轉(zhuǎn)1 min使LPS均勻分布于肺部組織中，誘發(fā)小鼠ALI模型，對照組小鼠使用相同方法向小鼠鼻部滴入等量PBS緩沖液。上述藥物配制溶劑均為PBS緩沖液。

1.2.2 實驗樣品采集

小心剖開胸腔并完整剝離肺臟，用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗肺組織表面血液并擦干，保存于10%福爾馬林中，存放于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

（1）制備支氣管肺泡灌洗液（BALF）。使用PBS緩沖液灌洗3次，反復(fù)抽吸小鼠肺部收集BALF。將BALF于3 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，保存于-80 ℃。

（2）制備肺組織勻漿。取肺左上葉用液氮冷凍研磨，按1∶9的體積比添加生理鹽水，轉(zhuǎn)移至離心管中，2 500 r/min條件下離心10 min，收集上清液保存于EP管中，置于-80 ℃保存。

（3）采集小鼠血液樣本。待LPS誘導(dǎo)6 h后處死小鼠，采集血液樣本在2 000 r/min條件下離心6 min，收集血清，保存于-80 ℃。

1.2.3 測定小鼠肺部干濕比（W/D）

取肺部組織右上葉，擦干表面水分，稱量并將肺組織濕重記為W，將小鼠肺部組織于60 ℃烘箱中連續(xù)烘烤24 h，再次稱量記錄肺組織干重為D，獲得小鼠肺部干濕比值（W/D）。

1.2.4 蛋白定量分析（BCA）

待肺組織勻漿恢復(fù)至室溫，將酶標(biāo)儀調(diào)節(jié)至562 nm處，預(yù)熱30 min。制備工作液，按照BCA蛋白含量測定試劑盒說明書測定。

1.2.5 髓過氧化物酶測定（MPO）

解凍BALF至2～8 ℃?zhèn)溆?，根?jù)說明書步驟檢測，并按照說明書的公式計算濃度。

1.2.6 IL-6測定

根據(jù)說明書步驟檢測，并按照說明書的公式計算濃度。

1.2.7 病理切片制作

取出小鼠左肺下葉，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗去表面血液，于10%中性福爾馬林固定48 h，固定后進行HE染色制作病理組織切片。

2 結(jié)果與分析

2.1 TPL對LPS誘導(dǎo)小鼠肺部W/D值的影響

以肺部組織濕重與干重比值作為評判肺水腫指標(biāo)[5]。如圖1所示，LPS誘導(dǎo)后小鼠肺部W/D值明顯增加，出現(xiàn)明顯肺水腫。地塞米松組與TPL低劑量治療組作用效果不明顯，TPL高劑量治療組中出現(xiàn)明顯逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象（P＜0.05）。

圖1 TPL對小鼠肺部W/D值的影響

2.2 TPL對LPS誘導(dǎo)小鼠肺部滲出蛋白質(zhì)總量的影響

在ALI中，肺微血管內(nèi)皮及肺泡上皮細(xì)胞受損，肺泡腔內(nèi)滲出富含蛋白質(zhì)的液體，因此測定蛋白濃度可以分析炎癥反應(yīng)情況。使用BCA試劑盒檢測BALF中蛋白含量，結(jié)果如圖2所示。LPS誘導(dǎo)組蛋白濃度明顯增高，地塞米松治療組與TPL治療組均出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，TPL治療組逆轉(zhuǎn)效果成劑量依賴性升高（P＜0.05）。

圖2 TPL對小鼠BALF中蛋白含量的影響

2.3 TPL對LPS誘導(dǎo)小鼠中性粒細(xì)胞的影響

急性肺損傷是一類典型炎癥反應(yīng)病癥，髓過氧化物酶表達水平可以反映動物機體內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集程度。檢測肺部組織勻漿中髓過氧化物含量，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，髓過氧化物酶表達升高，地塞米松治療組與雷公藤內(nèi)酯醇治療組表達水平顯著降低，地塞米松治療組與低劑量降低效果相似，雷公藤內(nèi)酯醇治療組降低效果呈劑量依賴性增長。各組數(shù)據(jù)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 小鼠肺部組織勻漿中MPO值

2.4 TPL對LPS誘導(dǎo)小鼠IL-6表達的影響

IL-6作為促炎性細(xì)胞因子對炎癥的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用[6]。肺部組織勻漿中IL-6表達水平如圖4所示，經(jīng)LPS誘導(dǎo)后IL-6表達水平升高，地塞米松治療組與TPL低劑量治療組對IL-6的降低效果不明顯，而TPL高劑量治療組明顯降低了IL-6的表達水平（P＜0.05）。

圖4 TPL對小鼠肺部組織勻漿中IL-6含量的影響

2.5 TPL對LPS誘導(dǎo)小鼠肺部病理變化的影響

如圖5所示，對照組肺部結(jié)構(gòu)完整清晰（A）；LPS誘導(dǎo)的肺泡壁出現(xiàn)明顯增厚（B1），肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞滲出液及血細(xì)胞（B2）；經(jīng)地塞米松及TPL治療后，肺泡壁明顯變薄，肺泡腔內(nèi)滲出物減少（C、D、E）。TPL在病理分析中對ALI表現(xiàn)出明顯的治療作用。

圖5 小鼠肺部組織病理切片

3 結(jié)論

實驗發(fā)現(xiàn)，LPS能夠造成小鼠肺部出現(xiàn)明顯的病理損傷，其主要病理特征為肺部微血管及肺泡上皮細(xì)胞受損，有大量血細(xì)胞及炎性細(xì)胞滲出，肺泡壁增厚。經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，小鼠肺部W/D值增加，BALF中蛋白濃度增加，經(jīng)TPL治療后可以明顯逆轉(zhuǎn)肺部組織病理變化。與地塞米松治療組及對照組對比，TPL治療組的治療效果呈現(xiàn)劑量依賴性。

綜上所述，本研究證實了TPL對LPS所誘導(dǎo)的ALI存在保護作用。TPL能夠抑制炎癥因子IL-6的過度表達，從而對LPS誘導(dǎo)小鼠ALI所表現(xiàn)出的過度炎癥損害有治療作用，可作為ARDS的潛在治療藥物。