黎婷玉，陳瑤瑤，張彥，熊建文，郭壯，王玉榮*

1(湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽(yáng)，441053) 2(湖北文理學(xué)院 乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽(yáng)市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 襄陽(yáng)，441053) 3(酵母功能湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 安琪紐特股份有限公司，湖北 宜昌，443003) 4(柳州工學(xué)院 柳州市螺螄粉植物源性配料研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州，545616)

酸筍是以新鮮竹筍為主要原料，經(jīng)過(guò)發(fā)酵而成的一類(lèi)傳統(tǒng)泡菜，富含纖維素和多種礦物質(zhì)元素[1]。目前，除了對(duì)其風(fēng)味物質(zhì)有研究外，部分學(xué)者還針對(duì)其微生物類(lèi)群方面展開(kāi)了研究。孫寧等[2]使用MRS培養(yǎng)基從自然發(fā)酵的酸筍中分離得到了69 株乳酸菌，分別隸屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)和鏈球菌屬(Streptococcus)；陳正培等[3]對(duì)柳州酸筍中具有降解亞硝酸鹽特性的乳酸菌展開(kāi)了篩選工作，得到了1 株亞硝酸鹽降解率達(dá)76.58%(亞硝酸鹽質(zhì)量濃度為625 mg/mL)的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)；周金沙等[4]采用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)解析廣西無(wú)鹽發(fā)酵酸筍的細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella)為優(yōu)勢(shì)菌屬。上述研究均表明酸筍中乳酸菌類(lèi)群含量較高。然而目前的研究大多僅從純培養(yǎng)方式或測(cè)序技術(shù)單方面來(lái)進(jìn)行解析，而更全面地揭示酸筍中細(xì)菌及乳酸菌類(lèi)群的研究較為少見(jiàn)。

酸筍是南寧最知名的小吃“老友粉”中必不可少的特色調(diào)味料，因而解析南寧地區(qū)酸筍的細(xì)菌類(lèi)群具有一定的代表性。當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)酸筍的做法通常是將新鮮竹筍切成塊狀、條狀或絲狀后，用涼白開(kāi)或泉水直接浸泡，不添加食鹽及其他調(diào)味料，經(jīng)過(guò)15～30 d密封發(fā)酵即可[5]。本研究在采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)南寧地區(qū)酸筍細(xì)菌類(lèi)群結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步預(yù)測(cè)其細(xì)菌類(lèi)群的功能特性，并結(jié)合純培養(yǎng)方式對(duì)酸筍中的乳酸菌菌株進(jìn)行分離、鑒定和保存。以期在相關(guān)產(chǎn)業(yè)對(duì)酸筍發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化的過(guò)程中提供參考依據(jù)和菌株支持。

1 材料與分析

1.1 材料與試劑

5 個(gè)酸筍樣品均于2019年8月采集自廣西壯族自治區(qū)南寧市(E 108°22′，N 22°49′)北湖、淡村和五里亭菜市場(chǎng)，所有樣品均為當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶(hù)手工制作，編號(hào)依次為SS1～SS5。使用無(wú)菌自封袋包裝樣品并貼上標(biāo)簽置于保溫采樣箱中運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室。

基因組提取試劑盒，德國(guó)QIAGEN公司；338F/806R和27F/1495R正反向引物，武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；DNA聚合酶、rTaq酶、10×Buffer和dNTP，寶生物工程(大連)有限公司；MRS和LB瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

Veriti FAST梯度PCR儀，美國(guó)ABI公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Protein Simple公司；Illumina MiSeq PE250高通量測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina公司；R930型機(jī)架式服務(wù)器，美國(guó)DELL公司；DG250型厭氧工作站，英國(guó)Don Whitley公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 宏基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序

酸筍宏基因組DNA的提?。?份樣品各稱(chēng)取2 g，參照提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取酸筍宏基因組DNA。

PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序：針對(duì)檢測(cè)合格的基因16S rRNA V3～V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增和清潔。為方便后續(xù)進(jìn)行序列配對(duì)，在正反引物中添加1組barcode(核苷酸標(biāo)簽，含7個(gè)堿基)，PCR擴(kuò)增體系和程序均參照王強(qiáng)等[6]的方法進(jìn)行操作，將純化后的產(chǎn)物寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測(cè)序。

1.3.2 序列質(zhì)控和生物信息學(xué)分析

參照崔夢(mèng)君等[7]的方法對(duì)測(cè)序返回的fq序列文件進(jìn)行質(zhì)控，質(zhì)控合格的序列上傳至QIIME(v1.9.1)分析平臺(tái)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。分別按照100%和97%相似度對(duì)有效序列進(jìn)行序列歸并和構(gòu)建分類(lèi)操作單元(operational taxonomic units，OTU)[8]，同時(shí)將含有嵌合體序列的OTU進(jìn)行刪除[9]，選擇余下OTU代表性序列在RDP[10]、SILVA[11]和Greengenes[12]數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，并注釋其分類(lèi)學(xué)地位。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步使用PICRUSt軟件預(yù)測(cè)酸筍細(xì)菌的基因功能[13]，參照蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)(clusters of orthologous groups of proteins，COG)進(jìn)行功能注釋[14]。

1.3.3 乳酸菌的分離鑒定

稱(chēng)取10 g粉碎后的酸筍添加到90 mL生理鹽水(高溫高壓蒸汽滅菌)中混合均勻，37 ℃，220 r/min的搖床中振蕩30 min。參照倪慧等[15]的方法對(duì)酸筍中乳酸菌菌株進(jìn)行初步分離、純化與鑒定，并對(duì)過(guò)氧化氫酶陰性且革蘭氏陽(yáng)性的菌株進(jìn)行保藏。菌株鑒定流程：(1)菌株DNA提?。?2)PCR擴(kuò)增；(3)瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物；(4)PCR產(chǎn)物清潔；(5)連接轉(zhuǎn)化；(6)挑取陽(yáng)性克隆子。將擴(kuò)增成功的陽(yáng)性克隆子送至天一輝遠(yuǎn)(武漢)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，返回的序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)[16]，并完成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2017軟件繪制曲線(xiàn)圖與柱形圖，使用R(v4.0.1)軟件繪制菌群功能熱圖，使用在線(xiàn)作圖網(wǎng)址(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)繪制Venn圖，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

納入本研究的5個(gè)酸筍樣品經(jīng)測(cè)序共得到219 111條高質(zhì)量序列，平均每個(gè)樣品含有43 822條序列。本研究首先基于香農(nóng)指數(shù)曲線(xiàn)和等級(jí)聚類(lèi)曲線(xiàn)分析了樣本測(cè)序深度及物種豐富度(圖1)。

a-香農(nóng)指數(shù)；b-等級(jí)聚類(lèi)圖1 香農(nóng)指數(shù)曲線(xiàn)和等級(jí)聚類(lèi)曲線(xiàn)Fig.1 The curves of Shannon index and rank abundance

樣品SS1～SS5分別測(cè)得48 177、34 600、45 896、38 194和52 244條高質(zhì)量序列，且當(dāng)測(cè)序深度達(dá)到10 000條左右時(shí)，所有樣品的香農(nóng)指數(shù)曲線(xiàn)就均已到達(dá)平臺(tái)期(圖1-a)，表明若測(cè)序深度繼續(xù)增加，酸筍的細(xì)菌多樣性不會(huì)再發(fā)生較大變化，說(shuō)明本研究的測(cè)序深度合理，能夠滿(mǎn)足后續(xù)分析要求。樣品SS5的曲線(xiàn)最平緩且跨度最大，樣品SS2的曲線(xiàn)最陡峭且跨度最小(圖1-b)。表明相較于其他樣品，樣品SS5的物種豐富度最高也最均勻，樣品SS2的物種豐富度最低，不同樣品在物種豐富度上呈現(xiàn)出一定的差別。

2.2 基于細(xì)菌門(mén)和屬水平細(xì)菌多樣性分析

本研究進(jìn)一步基于門(mén)和屬水平對(duì)酸筍的細(xì)菌類(lèi)群進(jìn)行分析，5個(gè)酸筍樣品中的細(xì)菌類(lèi)群共鑒定到了8個(gè)門(mén)和77個(gè)屬，其中平均相對(duì)含量>0.5%的門(mén)和屬見(jiàn)圖2。酸筍中含有2個(gè)平均相對(duì)含量>0.5%的門(mén)，分別為硬壁菌門(mén)(Firmicutes，99.05%)和放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria，0.53%)(圖2-a)。其中Actinobacteria在除SS1(0.65%)和SS5(1.74%)外的其他樣品中占比均<0.25%。顯然，F(xiàn)irmicutes為酸筍中的優(yōu)勢(shì)門(mén)。乳桿菌屬(Lactobacillus)為酸筍中唯一的平均相對(duì)含量>0.5%的細(xì)菌屬，其平均相對(duì)含量高達(dá)98.41%。除此之外，在樣品SS4中相對(duì)含量>0.5%的屬還包括魏斯代菌屬(Weissella，0.84%)，樣品SS5中包括棒狀桿菌屬(Corynebacterium，0.65%)和異常球菌屬(Deinococcus，0.58%)(圖2-b)。由此可見(jiàn)，酸筍中的細(xì)菌類(lèi)群主要為隸屬于Firmicutes的Lactobacillus。陳曉東等[17]采用第2代測(cè)序技術(shù)解析廣西壯族自治區(qū)柳州市和桂林市等6個(gè)地區(qū)的酸筍樣品時(shí)得到了類(lèi)似的結(jié)論。而鮑偉等[18]在使用同種方法解析浙江傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜(如臭冬瓜、臭莧菜梗、酸筍和酸茭白等)的微生物類(lèi)群過(guò)程中卻發(fā)現(xiàn)，酸筍汁和酸筍固形物中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬分別為克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和埃希菌屬(Escherichia)。這表明不同地域，其環(huán)境等因素的不同可能導(dǎo)致當(dāng)?shù)厮峁S中微生物類(lèi)群亦有較大的差別，因而解析不同地區(qū)的酸筍細(xì)菌類(lèi)群有助于全面認(rèn)識(shí)酸筍中的微生物種類(lèi)及特征。

a-細(xì)菌門(mén)；b-細(xì)菌屬圖2 酸筍中相對(duì)含量>0.5%的細(xì)菌門(mén)和細(xì)菌屬Fig.2 The phylum and genus with relative abundance more than 0.5% in fermented bamboo shoots

2.3 基于OTU水平細(xì)菌類(lèi)群分析

本研究進(jìn)一步從OTU水平來(lái)解析酸筍中的細(xì)菌類(lèi)群，并利用韋恩圖展示各樣品中OTU的分布情況(圖3)。檢測(cè)出的全部有效序列經(jīng)97%相似度劃分得到1 333個(gè)OTU，每個(gè)樣品平均包含533個(gè)OTU，樣品SS1～SS5中分別含有547、237、421、425和1 037個(gè)OTU，特有OTU數(shù)分別為68、9、20、92和355個(gè)，包含的序列數(shù)占總序列數(shù)的比例依次為0.39%、0.05%、0.10%、1.14%和3.95%，而5個(gè)樣品中共有的OTU數(shù)量為65個(gè)，所包含的序列數(shù)占總序列數(shù)的90.63%。由此可見(jiàn)，盡管不同樣品間共有的物種種類(lèi)并不多，但其在數(shù)量上卻占到了極大的優(yōu)勢(shì)。

圖3 各酸筍樣品中的OTU分布韋恩圖Fig.3 OTU Venn diagram of fermented bamboo shoots

所有樣品共同含有的平均相對(duì)含量>0.5%的核心OTU共有6個(gè)，分別為OTU4296、OTU5648、OTU1388、OTU220、OTU4815和OTU2404，平均相對(duì)含量分別為79.99%、1.96%、0.95%、0.78%、0.70%和0.68%(圖4)。

圖4 平均相對(duì)含量>0.5%的核心OTUFig.4 Analysis of core OTU with average relative abundance more than 0.5%

值得注意的是，上述6個(gè)OTU均隸屬于Lactobacillus，累計(jì)相對(duì)含量達(dá)85.07%，這一結(jié)果表明南寧地區(qū)酸筍中的核心細(xì)菌類(lèi)群為L(zhǎng)actobacillus。有研究指出，隸屬于Lactobacillus的部分種，例如L.plantarum所產(chǎn)生的乳酸和乙酸等能夠破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜從而產(chǎn)生抑菌效果，這一特性可能對(duì)酸筍的食用安全品質(zhì)起到了一定的積極作用[19]。

2.4 酸筍細(xì)菌類(lèi)群的功能預(yù)測(cè)分析

在對(duì)酸筍細(xì)菌類(lèi)群結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析的基礎(chǔ)上，本研究還預(yù)測(cè)了其細(xì)菌類(lèi)群所具有的潛在功能，全部有效序列通過(guò)PICRUSt預(yù)測(cè)共得到4 045個(gè)COG，分別注釋到了22個(gè)功能大類(lèi)(圖5)。酸筍中的細(xì)菌類(lèi)群除了在翻譯、轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞膜生物發(fā)生等維持細(xì)胞自身生長(zhǎng)繁殖的功能上具有較高的表達(dá)以外，在氨基酸和碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝上也具有較高表達(dá)。這可能是由于蛋白質(zhì)和糖類(lèi)常被作為微生物發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源，而微生物類(lèi)群在消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過(guò)程中會(huì)引發(fā)一系列的產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝反應(yīng)。朱照華[20]比較了新鮮與發(fā)酵過(guò)的毛竹筍(后面統(tǒng)稱(chēng)為酸筍)的營(yíng)養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)酸筍中的蛋白質(zhì)和總糖含量相對(duì)新鮮竹筍大幅減少，而膳食纖維含量有所上升，這表明酸筍中的微生物類(lèi)群對(duì)其本身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量變化有著較大的推動(dòng)作用。

圖5 不同酸筍中細(xì)菌類(lèi)群基因功能分析熱圖Fig.5 Heat map of gene function analysis of bacterial communities in different fermented bamboo shoots

2.5 乳酸菌多樣性分析

測(cè)序結(jié)果顯示酸筍中乳酸菌含量豐富，為進(jìn)一步明確其中乳酸菌類(lèi)群，本研究結(jié)合了傳統(tǒng)微生物學(xué)方法對(duì)其乳酸菌進(jìn)行了選擇性培養(yǎng)。不同分離株的菌落形態(tài)如表1所示，分離株的菌落形態(tài)均為圓形，表面光滑；過(guò)氧化氫酶多為陰性，革蘭氏染色均為陽(yáng)性，鏡檢發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞形狀均為桿狀。

從酸筍中分離的菌株SS-1、SS-2、SS-3和SS-4分別被鑒定為發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)、黑氏乳桿菌(L.hammesii)、沙克乳桿菌(L.sakei)和副蕈狀芽胞桿菌(Bacillusparamycoides)，隸屬于Lactobacillus的分離株含量占到75%(圖6)。

表1 不同分離株的形態(tài)學(xué)特征Table 1 Morphological characteristics of different strains

圖6 酸筍中分離株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of strains isolated from fermented bamboo shoots

MiSeq高通量測(cè)序結(jié)果顯示Lactobacillus在酸筍中的平均相對(duì)含量高達(dá)98.41%，但通過(guò)純培養(yǎng)卻只分離出3株乳桿菌。導(dǎo)致這種數(shù)量上的差異原因可能有2個(gè)：一是由于即使樣品基質(zhì)中的微生物已經(jīng)失去活性或者死亡，但只要其DNA沒(méi)有降解，MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)就仍可以實(shí)現(xiàn)序列擴(kuò)增[21]；另一個(gè)可能是MRS培養(yǎng)基成分中缺少了酸筍中大部分乳酸菌所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，使其無(wú)法被培養(yǎng)出來(lái)。因而在后續(xù)研究中可以考慮采用培養(yǎng)組學(xué)的方法對(duì)酸筍中乳酸菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。

除此之外，測(cè)序結(jié)果并未顯示出酸筍中含有芽胞桿菌屬，但在純培養(yǎng)過(guò)程中卻分離出了1株芽胞桿菌。原因可能為芽胞桿菌屬是空氣中的常見(jiàn)菌屬之一，樣品在預(yù)處理過(guò)程中接觸了外界空氣，從而使其進(jìn)入樣品，繼而被分離出來(lái)。

3 結(jié)論

MiSeq高通量測(cè)序結(jié)果顯示南寧地區(qū)酸筍的細(xì)菌類(lèi)群主要隸屬于Lactobacillus，且在氨基酸和碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝功能上有著較高表達(dá)；同時(shí)乳酸菌分離鑒定結(jié)果顯示分離株亦主要隸屬于Lactobacillus?？梢?jiàn)廣西南寧地區(qū)的酸筍中細(xì)菌菌群主要為乳桿菌。