開建榮，石欣，李彩虹，楊春霞，王彩艷

(寧夏農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，寧夏 銀川，750002)

寧夏中寧縣作為中國枸杞的原產(chǎn)地和道地產(chǎn)區(qū)，人工種植枸杞的歷史已達(dá)600年之久，因中寧枸杞與其他產(chǎn)地枸杞具有不同的獨(dú)特品質(zhì)，寧夏中寧縣也被譽(yù)為“中國枸杞之鄉(xiāng)”[1]，截至2018年年底，寧夏枸杞種植面積達(dá)6.67萬hm2，枸杞干果總產(chǎn)量14萬t，年綜合產(chǎn)值130億元[2]，枸杞產(chǎn)業(yè)已成為寧夏農(nóng)村經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展、農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收的重要支柱產(chǎn)業(yè)。目前，國內(nèi)已注冊的枸杞商標(biāo)除中寧枸杞外，還有靖遠(yuǎn)枸杞、瓜州枸杞、精河枸杞、柴達(dá)木枸杞等[3]，隨著枸杞地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品的增多，假冒產(chǎn)品標(biāo)識、以次充好的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者權(quán)益。

目前，產(chǎn)地溯源技術(shù)主要包括礦物元素分析技術(shù)、穩(wěn)定同位素技術(shù)、有機(jī)成分指紋溯源技術(shù)、近紅外光譜指紋溯源技術(shù)、拉曼光譜指紋溯源技術(shù)等[4]。礦物元素分析技術(shù)被認(rèn)為是植源性食品產(chǎn)地判別較為有效的方法[5-7]，已被廣泛應(yīng)用于谷物[8-9]、橄欖油[10-12]、葡萄酒[13-15]、茶葉[16-18]等的產(chǎn)地溯源。電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS)儀因具有高靈敏度、線性范圍寬、可多元素同時(shí)測定等優(yōu)勢，是目前礦物元素測定最常用的技術(shù)[19-20]。枸杞中元素含量與產(chǎn)地環(huán)境因素密切相關(guān)，形成不同地區(qū)各自的元素特征，因此，篩選枸杞中與產(chǎn)地直接相關(guān)的元素指標(biāo)作為產(chǎn)地溯源指標(biāo)是其溯源研究的關(guān)鍵。MAIONE等[21]通過檢測分析21種礦物元素對巴西大米進(jìn)行分類精度研究，結(jié)果表明3種分類模型對巴西中西部、南部地區(qū)大米的產(chǎn)地預(yù)測準(zhǔn)確度分別為93.66%、93.83%和90%；MA等[18]利用ICP-MS對洞庭碧螺春及其他綠茶樣品中37種礦物質(zhì)元素的含量進(jìn)行了測定，構(gòu)建判別模型的正確判別率為96.4%，實(shí)現(xiàn)了對相同和不同產(chǎn)地品牌綠茶的產(chǎn)地判別。

國內(nèi)外學(xué)者利用礦物元素技術(shù)進(jìn)行了大空間尺度的產(chǎn)地溯源應(yīng)用，取得了理想的判別效果。本研究以中寧小尺度區(qū)域?yàn)槔?，采用礦物元素分析技術(shù)對中寧5個(gè)小產(chǎn)區(qū)(舟塔產(chǎn)區(qū)、鳴沙洲產(chǎn)區(qū)、紅梧山產(chǎn)區(qū)、紅柳溝產(chǎn)區(qū)和清水河產(chǎn)區(qū))進(jìn)行產(chǎn)地判別分析。研究礦物元素分析技術(shù)在小尺度區(qū)域內(nèi)枸杞產(chǎn)地判別中的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，美國 Perkin Elmer公司，第1組標(biāo)準(zhǔn)溶液包括As、Ba、Bi、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Li、Mg、Mn、Ni、Pb、Rb、Se、Sr、Tl、U、Zn 21種元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(Lot#18-195 JB)，第2組標(biāo)準(zhǔn)溶液包括B、Ge、Mo、Nb、Er 5種元素(Lot#20-134 JB)，第3組標(biāo)準(zhǔn)溶液包括Ce、Dy、Eu、Gd、Ho、Nd、Pr、Sm、Tb、Th、Tm、Y、Yb 13種元素(Lot#41-48AS)；N、P、K、Hg為單標(biāo)元素，中國計(jì)量科學(xué)研究院，質(zhì)量濃度為1 000 mg/L，共計(jì)43種元素。硝酸，德國默克；鹽酸，國藥化學(xué)試劑有限公司，均為優(yōu)級純；試驗(yàn)用水為一級水。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 10047(生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)—胡蘿卜)為中國地質(zhì)科學(xué)院地球物理地球化學(xué)勘查研究所研制。

1.2 儀器與設(shè)備

ELAN DRC-e型ICP-MS 儀，美國 Perkin Elmer公司；Mars6 Xpress微波消解儀(內(nèi)置雙光路溫度控制系統(tǒng)和全罐異常壓力監(jiān)控系統(tǒng))，美國 CEM 公司；AL104型電子天平，梅特勒-托利多。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集

枸杞樣品于2018年6～10月采自寧夏中寧地區(qū)的5個(gè)小產(chǎn)區(qū)，舟塔產(chǎn)區(qū)(n=34)、鳴沙洲產(chǎn)區(qū)(n=14)、紅梧山產(chǎn)區(qū)(n=24)、紅柳溝產(chǎn)區(qū)(n=12)、清水河產(chǎn)區(qū)(n=27)。

1.3.2 樣品前處理

枸杞鮮樣曬干，置于50 ℃烘箱中烘干至粉碎時(shí)不黏壁，然后進(jìn)行充分研磨，過100目篩后備用。

枸杞樣品采用微波消解法消解，具體操作步驟：稱取0.5 g (精確到0.000 1 g) 枸杞樣品置于微波消解管中，加入硝酸10 mL，常溫靜置3 h后，放入微波消解儀中進(jìn)行樣品消解，選擇溫度控制，5 min爬升至120 ℃，保持10 min；5 min爬升至150 ℃，保持20 min；5 min爬升至190 ℃，保持30 min。消解完畢后冷卻，輕輕擰開蓋子，將微波消解管置于趕酸儀上120 ℃趕酸2 h，然后冷卻至室溫，用超純水洗至50 mL刻度試管中，并用超純水定容，搖勻；同時(shí)做試劑空白。

1.3.3 礦物元素含量測定

枸杞中N、P、K元素含量按照NY/T 2017—2011《植物中氮、磷、鉀的測定》測定，K采用火焰光度計(jì)測定，N采用凱氏定氮儀法測定，P采用鉬銻抗吸光光度法測定。枸杞其他礦物元素含量采用ICP-MS標(biāo)準(zhǔn)模式測定[22-23]。具體的工作條件為：發(fā)生器功率：1 300 W；霧化器流量：0.95 L/min；等離子炬冷卻氣流量：17.0 L/min；輔助器流量：1.20 L/min；檢測器模擬階電壓：-2 350 V；離子透鏡電壓：6.00 V。儀器測定枸杞樣品及胡蘿卜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中43種元素，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測定值在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)，儀器元素的檢出限和定量限見表1。

表1 ICP-MS儀器測定礦物元素標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限Table 1 ICP-MS instrument determination of mineral elements standard curve, detection limits and limits of quantification

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析和主成分分析；采用SPSS 25.0和SIMCA 13.0分別進(jìn)行Fisher判別分析和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)區(qū)枸杞中礦物元素含量差異分析

通過對舟塔產(chǎn)區(qū)、鳴沙洲產(chǎn)區(qū)、紅梧山產(chǎn)區(qū)、紅柳溝產(chǎn)區(qū)、清水河產(chǎn)區(qū)枸杞中43種元素含量進(jìn)行方差分析。其中Ba、Bi、Cd、Ce、Cu、Dy、Eu、Gd、Ge、Hg、Ho、Mg、Mn、Mo、Nd、Ni、Pr、Se、Sm、Sr、Tb、Th、Tm、Yb、Ca、Pb、P、Er 28種元素含量在5個(gè)產(chǎn)區(qū)間存在顯著差異(P<0.05)，元素As、B、Co、Cr、Cs、Li、Nb、Rb、Tl、U、Y、Fe、Zn、N、K 15種元素含量在產(chǎn)區(qū)間差異不顯著(P>0.05)(表2)。

舟塔產(chǎn)區(qū)的Cd、Cr、Ge、Hg、Mo、Ni、Nb、Tl、Ca、Pb、P 元素含量高于其他產(chǎn)區(qū)，Ce、Dy、Gd、Ho、Nd、Sm、Tb、Th、Tm、Y、Fe、Pr、Er元素含量低于其他產(chǎn)區(qū)；鳴沙洲產(chǎn)區(qū)的Cu、Dy、Eu、Nb、Gd、Li、Mg、Rb、Yb、U、Fe元素含量高于其他產(chǎn)區(qū)，Sr元素含量低于其他產(chǎn)區(qū)；紅柳溝產(chǎn)區(qū)的Bi、Mo、Mn、Nb、Li、Ni、P元素含量低于其他產(chǎn)區(qū)；紅梧山產(chǎn)區(qū)的Ba、Bi、Ce、Ho、Nb、Nd、Pr、Sm、Sr、Tb、Th、Tm、U、Yb、Er元素含量顯著高于其他產(chǎn)區(qū)，Cd、Cu、Ge、Hg、Ca元素含量低于其他產(chǎn)區(qū)；清水河產(chǎn)區(qū)的Co、Mn元素含量高于其他產(chǎn)區(qū)，Ba、Eu、Mg、Rb、Tl、U、Yb、Pb元素含量低于其他產(chǎn)區(qū)；中寧小尺度區(qū)域內(nèi)各產(chǎn)區(qū)枸杞中礦物元素含量有其各自的地域特征，礦物元素在小尺度相似地域之間具有較大的差異性。

表2 不同產(chǎn)區(qū)枸杞中礦物元素含量 單位：mg/kg

2.2 枸杞中礦物元素的主成分分析

主成分分析是指通過將存在相關(guān)性的變量轉(zhuǎn)換成線性不相關(guān)的變量，并提取完全沒有相關(guān)性又保留了原始數(shù)據(jù)大部分信息的幾個(gè)主成分[24-25]，本研究對中寧枸杞產(chǎn)區(qū)間存在顯著差異的36種元素進(jìn)行主成分分析，KMO統(tǒng)計(jì)量為0.809(KMO統(tǒng)計(jì)量>0.5)，各元素之間具有顯著相關(guān)性，可以進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表3。第1主成分方差貢獻(xiàn)率為30.083%，綜合了Pr、Tb、Sm、Nd、Dy、Yb、Ho、Ce、Tm、Gd、Th、Y、Eu、Bi 14種元素信息；第2主成分方差貢獻(xiàn)率為12.741%，綜合了Mo、Ge、Co元素信息；第3主成分方差貢獻(xiàn)率為7.672%，綜合了Tl、Rb、Cs元素信息；第4主成分方差貢獻(xiàn)率為5.701%，代表了Mg、Mn元素信息；第5主成分方差貢獻(xiàn)率為4.730%，代表了N、K、Li元素信息；第6主成分方差貢獻(xiàn)率為4.225%，綜合了Ca、P、Pb元素信息；第7主成分方差貢獻(xiàn)率為3.640%，代表了Zn、Cu元素信息；第8主成分方差貢獻(xiàn)率為2.798%，代表了Sr元素信息；第9主成分方差貢獻(xiàn)率為2.613%，代表了Er元素信息；第10主成分方差貢獻(xiàn)率為2.381%，代表了As元素信息；前10個(gè)主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為76.583%。篩選出Pr、Tb、Sm、Nd、Dy、Yb、Ho、Ce、Tm、Gd、Th、Y、Eu、Bi、Mo、Ge、Co、Tl、Rb、Cs、Mg、Mn、N、K、Li、Ca、P、Pb、Zn、Cu、Sr、Er、As 33種枸杞的特征礦物元素。

表3 前10個(gè)主成分的載荷矩陣及方差貢獻(xiàn)率Table 3 Loading matrix and cumulative contribution to total variance of the first ten principal components

續(xù)表3

2.3 枸杞中礦物元素的判別分析

礦物元素含量的差異揭示了不同產(chǎn)區(qū)枸杞存在差異，但不足以對枸杞產(chǎn)區(qū)進(jìn)行準(zhǔn)確判別，為了實(shí)現(xiàn)對中寧不同產(chǎn)區(qū)枸杞的產(chǎn)地判別，分別采用Fisher判別分析和OPLS-DA方法對中寧5個(gè)產(chǎn)區(qū)枸杞樣本進(jìn)行判別分析。

2.3.1 基于Fisher判別分析的枸杞產(chǎn)區(qū)判別模型

為了進(jìn)一步了解各元素含量指標(biāo)對枸杞原產(chǎn)地的判別情況，建立基于Fisher判別函數(shù)的一般判別方法對枸杞樣品進(jìn)行多變量判別分析，以43種礦物元素作為判別分析的自變量，進(jìn)行逐步判別分析，結(jié)果顯示，Cd、Ce、Co、Cu、Gd、Hg、Mg、Se、Zn、P等10種礦物元素對產(chǎn)地判別顯著的元素被引入到判別模型中。不同產(chǎn)地枸杞判別函數(shù)模型系數(shù)見表4，判別分類結(jié)果見表5。提取模型前4個(gè)典型判別函數(shù)，Willks’ Lambda檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，在α=0.05的顯著性性水平下，4個(gè)函數(shù)對分類效果均為顯著，其中判別函數(shù)1和判別函數(shù)2累積解釋判別模型能力為78.3%，且相關(guān)系數(shù)均>0.95，表明判別函數(shù)1和判別函數(shù)2對5個(gè)枸杞產(chǎn)地分類占主要貢獻(xiàn)作用，利用判別函數(shù)1和判別函數(shù)2的得分值作散點(diǎn)圖，見圖1。舟塔、紅梧山、清水河產(chǎn)區(qū)容易區(qū)分，分別位于不同空間，鳴沙洲產(chǎn)區(qū)和紅柳溝產(chǎn)區(qū)樣品有部分重疊。分類結(jié)果表明，回代檢驗(yàn)的整體正確判別率為97.3%，回代檢驗(yàn)是針對所有訓(xùn)練樣本進(jìn)行的檢驗(yàn)，樣品的錯(cuò)判率是相應(yīng)總體率的偏低估計(jì)，而留一交叉檢驗(yàn)比較真實(shí)地體現(xiàn)了模型的判別能力[26]，交叉檢驗(yàn)中舟塔產(chǎn)區(qū)各有1個(gè)和4個(gè)樣本分別誤判為紅柳溝和清水河產(chǎn)區(qū)，鳴沙洲各有2、2、1、1個(gè)樣本被誤判為舟塔、紅柳溝、紅梧山和清水河產(chǎn)區(qū)，紅柳溝各有1個(gè)樣本被誤判為舟塔和紅梧山產(chǎn)區(qū)，紅梧山各有1個(gè)和3個(gè)樣本被誤判為紅柳溝和清水河產(chǎn)區(qū)，清水河各有1個(gè)和2個(gè)樣本被誤判為舟塔和紅梧山產(chǎn)區(qū)，交叉檢驗(yàn)的整體正確判別率為82.0%，說明基于礦物元素指紋的差異可以有效鑒別不同產(chǎn)地的枸杞。

表4 不同產(chǎn)地枸杞判別函數(shù)模型系數(shù)Table 4 Distinctive L. barbarum distinguish function model coeffieient

2.3.2 基于OPLS-DA的枸杞產(chǎn)區(qū)區(qū)分模型

對5個(gè)產(chǎn)區(qū)枸杞樣本中的43種礦物元素含量進(jìn)行OPLS-DA分析，構(gòu)建溯源模型。OPLS-DA模型中，R2X(cum)與R2Y(cum)分別表示在X軸方向和Y軸方向上主成分1和主成分2對變量的解釋能力，Q2(cum)表示模型對分組的預(yù)測能力[27]，該模型中R2X(cum)、R2Y(cum)和Q2(cum)分別為0.709、0.598和0.499，說明建立的OPLS-DA模型中2個(gè)主成分能有效解釋5個(gè)產(chǎn)區(qū)之間的差異，且該模型具有一定的預(yù)測能力。

表5 不同產(chǎn)區(qū)枸杞的一般判別分析結(jié)果Table 5 General discriminant analysis of L. barbarum from different origins

圖1 不同產(chǎn)區(qū)枸杞前2個(gè)典型判別函數(shù)得分散點(diǎn)圖Fig.1 Scattering points of the first two typical discrimination functions of L. barbarum from different origins

圖2為OPLS-DA模型第1、2主成分得分圖和載荷圖。各個(gè)產(chǎn)區(qū)樣品群體內(nèi)有明顯的聚集趨勢，僅有1個(gè)紅梧山的樣本落在Hotelling T2橢圓圖外，舟塔產(chǎn)區(qū)(ZT)、鳴沙洲產(chǎn)區(qū)(MSZ)可以較好地區(qū)分開，紅柳溝產(chǎn)區(qū)(HLG)分別與清水河產(chǎn)區(qū)(QSH)和紅梧山產(chǎn)區(qū)(HWS)樣品有部分重疊。橫坐標(biāo)為第1主成分得分，通過第1主成分可以將舟塔、紅梧山與清水河產(chǎn)區(qū)樣品區(qū)分開；縱坐標(biāo)為第二主成分得分，通過第2主成分可以將清水河產(chǎn)區(qū)與鳴沙洲產(chǎn)區(qū)區(qū)分。載荷圖表示第1、2主成分中各指標(biāo)與不同產(chǎn)區(qū)的相關(guān)性大小，即圖中X變量與Y變量越靠近，其相關(guān)性越高。由圖3可知，舟塔產(chǎn)區(qū)的Ge、Ni、Ca、Cu、P、Pb、Cd、Hg元素含量較高；鳴沙洲產(chǎn)區(qū)的Gd、Yb、Nd、Y、Li、Fe、U、B、Nb、Mg元素含量較高；紅柳溝產(chǎn)區(qū)的N元素含量較高；紅梧山產(chǎn)區(qū)的Ce、Th、Sm、Tb、Pr、Th、Ho、Dy、Bi、Er、Nd、Ba、Yb、Er等元素含量較高；清水河產(chǎn)區(qū)Co、Mn元素含量相對較高，這與礦物元素含量差異的分析結(jié)果相近。

利用建立的模型對5個(gè)產(chǎn)區(qū)的枸杞樣品進(jìn)行原產(chǎn)地判別(表6)。舟塔產(chǎn)區(qū)34個(gè)樣品正確判別率為

a-得分圖；b-載荷圖圖2 OPLS-DA模型第1、2主成分得分圖和載荷圖Fig.2 Scoring plot and loading plot of first versus second components in OPLS-DA

100%；鳴沙洲產(chǎn)區(qū)14個(gè)樣品中2個(gè)誤判，正確判別率為85.71%；紅柳溝產(chǎn)區(qū)12個(gè)樣品中有2個(gè)被誤判，正確判別率為83.3%；紅梧山產(chǎn)區(qū)24個(gè)樣品中3個(gè)樣品誤判，正確判別率為87.5%；清水河產(chǎn)區(qū)27個(gè)樣品2個(gè)誤判，正確判別率為92.59%，111個(gè)樣品的整體正確判別率為91.89%。

表6 OPLS-DA模型數(shù)據(jù)判別率Table 6 Accuracy of OPLS-DA model by validation set

3 結(jié)論

通過分析寧夏中寧5個(gè)小產(chǎn)區(qū)枸杞中43種礦物元素含量的組成特征，明確了不同產(chǎn)區(qū)枸杞中28種礦物元素存在地域差異。通過主成分分析確定了Pr、Tb、Sm、Nd、Dy、Yb、Ho、Ce、Tm、Gd、Th、Y、Eu、Bi、Mo、Ge、Co、Tl、Rb、Cs、Mg、Mn、N、K、Li、Ca、P、Pb、Zn、Cu、Sr、Er、As 33種枸杞的特征礦物元素。Fisher判別分析確定了Cd、Ce、Co、Cu、Gd、Hg、Mg、Se、Zn、P 10種枸杞的有效溯源指標(biāo)。Fisher判別分析方法構(gòu)建的判別模型的回代檢驗(yàn)和交叉檢驗(yàn)的整體正確判別率分別為97.3%和82.0%，基于OPLS-DA建立的判別模型的整體正確判別率為91.89%，相比之下，OPLS-DA判別效果更好。模型的整體正確判別率較低，但綜合考慮到中寧僅為一個(gè)縣級區(qū)域，面積4 226 km2，這樣一個(gè)小尺度區(qū)域內(nèi)的枸杞產(chǎn)地正確判別率可以接受。通過多元統(tǒng)計(jì)方法基本實(shí)現(xiàn)了對小尺度區(qū)域范圍內(nèi)枸杞產(chǎn)地的有效判別。誤判率相對較高的原因可能與產(chǎn)區(qū)劃分有關(guān)，雖然實(shí)現(xiàn)了地域劃分，但5個(gè)產(chǎn)區(qū)地域距離較近；同時(shí)樣本數(shù)量不一致也是影響判別模型準(zhǔn)確率的因素之一。結(jié)合以上分析，礦物元素技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法對枸杞產(chǎn)地判別有效可行。該結(jié)果為下一步分析環(huán)境因素(土壤、水、肥料等)對枸杞礦物元素指紋信息的影響提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。該模型的建立可用于枸杞原產(chǎn)地識別，對寧夏地理標(biāo)志性產(chǎn)品及消費(fèi)者合法權(quán)益的保護(hù)提供了有效的技術(shù)支撐。