李紅強，羅 倩，楊 帥，謝瑞瑩，聶 瓊,2*

(1. 貴州大學(xué)煙草學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

煙草(Nicotiana tabacum)是重要的經(jīng)濟作物，煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)直接影響其經(jīng)濟價值。生產(chǎn)中煙草正常生長發(fā)育常受到生物或非生物脅迫干擾，從而降低煙葉品質(zhì)及產(chǎn)量[1]。干旱脅迫是煙草種植中常發(fā)生的非生物脅迫之一，會導(dǎo)致煙草生長變得緩慢、光合色素降解、細胞膜受損、活性氧(ROS)量增加以及細胞含水率下降等，抑制煙草的正常生長發(fā)育，直接導(dǎo)致煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)下降[2]。

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factor, TF)又稱反式因子，是細胞核內(nèi)一種能與靶基因啟動子區(qū)特異DNA片段(順式作用元件)發(fā)生特異性相互作用的調(diào)節(jié)蛋白。在植物生長過程中，轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與生物和非生物脅迫的應(yīng)答及生長發(fā)育調(diào)控，在植物信號傳導(dǎo)途徑中起著至關(guān)重要的作用[3]。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[4]。研究表明，過表達 MYB的轉(zhuǎn)基因作物抗旱性提高，如干旱脅迫下過表達 TaMYBsml-D 擬南芥(Arabidopsis thaliana)轉(zhuǎn)基因后代的脯氨酸含量及發(fā)芽率顯著高于野生型，葉片失水速率和 MDA含量相對于野生型有顯著下降，一些干旱脅迫響應(yīng)基因(DREB2A、P5CS1、RD29A)的表達上調(diào)[5]；超表達OsMYB55的玉米(Zea mays)轉(zhuǎn)基因株系在干旱和高溫條件下，其株高、莖粗、生物量及葉綠素含量均較野生型提高[6]；在番茄(Lycopersicon esculentum)中超表達MYB49基因使干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因株系 ROS、MDA含量及電解質(zhì)滲漏率降低，POD和SOD活性、葉綠素和脯氨酸含量、光合速率提高，表明超表達MYB49基因提高了 ROS清除能力，降低細胞膜損傷及細胞死亡，保護葉綠體等，進而提高抗逆性[7]。

本研究以NtMYB4a過表達和CRISPR/Cas9敲除株系及其野生型煙株為材料，分析三個株系在干旱脅迫和復(fù)水條件下的光合與生理指標，探討NtMYB4a應(yīng)對干旱脅迫的生理功能，為進一步解析NtMYB4a參與抵抗干旱脅迫的調(diào)控機理及其在植物抗旱基因工程中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

貴州大學(xué)煙草品質(zhì)重點實驗室自育煙草品系GDH88(WT)、NtMYB4a過表達株系(OE)、NtMYB4a敲除編輯株系(KO)。

1.2 方法

1.2.1 干旱處理

采用盆栽實驗，待煙苗長至五葉一心后選取大小一致的株系移栽至內(nèi)徑14.8 cm、高13.1 cm盆中，基質(zhì)土壤為透氣性和保水性都較好的風(fēng)干泥炭土。移栽后15 d進行干旱脅迫處理(8 d不澆水)[8]，在干旱脅迫處理當天(CK)、干旱處理的第2天、第4天、第6天、第8天和復(fù)水處理第2天，取各材料從上往下第3、4片葉和根，將葉迅速用液氮處理后放于–80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取樣時間為每天早上 9:30，每處理40株，3個重復(fù)。

1.2.2 光合作用指標測定

于上午9:00～11:00 (溫度24～28 ℃)使用便攜式光合作用儀 Li-6400(Li-COR，林肯，NE，美國)測量從上往下第三片葉的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr)，設(shè)定 CO2濃度 500 μmol·mol–1，光照強度 1500 μmol·m–2·s–1。每處理測定 3 株取平均值。

1.2.3 生理相關(guān)指標測定

葉綠素含量測定用 95%乙醇浸提法[9]。根系活力、過氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性參照蘇州格瑞思生物技術(shù)有限公司試劑盒的方法測定。脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量采用張志良等[10]的方法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用 DPS7.05軟件采用最小顯著差異法(LSD)分析差異顯著性，采用Origin2021軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下三個株系的形態(tài)變化

干旱脅迫下三個株系的外觀形態(tài)變化如圖 1。脅迫第4天，三個株系的葉片均開始表現(xiàn)出發(fā)黃、萎蔫的現(xiàn)象，隨著處理時間延長，煙葉萎蔫程度加重。干旱第6 天，KO株系葉片邊緣開始枯萎。第8天，OE株系2片葉枯萎，WT株系3片，而KO株系5片葉均枯萎。復(fù)水2 d后，OE株系所有葉片均正常展開，WT株系有3片葉恢復(fù)正常，但是恢復(fù)的葉片發(fā)黃，KO株系僅有兩片煙葉恢復(fù)正常，其余全部枯萎。對比三個株系，其抗旱能力從強到弱依次為OE株系、WT株系、KO株系。

圖 1 干旱及復(fù)水條件下三個株系的形態(tài)變化Fig. 1 Morphological changes of three strains under drought stress and rehydration conditions

2.2 干旱及復(fù)水條件下根系活力和葉綠素含量變化

如圖 2A所示，各株系根系活力隨干旱脅迫時間延長呈先升高后降低的趨勢，脅迫第2天三個株系的根系活力都達到峰值后開始下降，復(fù)水2 d后，各株系的根系活力又顯著提高。在脅迫前后 OE株系的根系活力均顯著高于 WT株系。脅迫前期KO株系的根系活力顯著高于WT株系，隨著脅迫時間的延長，KO株系的根系活力逐漸低于對照。

如圖2B所示，隨著干旱脅迫時間延長，OE和WT株系的葉綠素含量均呈持續(xù)下降趨勢，而敲除突變株系則呈現(xiàn)先降低后升高的現(xiàn)象，但KO株系下降幅度均高于OE和WT株系。復(fù)水2 d后，各株系葉綠素含量均得到較好的恢復(fù)。

2.3 干旱及復(fù)水條件下的光合變化

如圖3A所示，處理0 d，OE株系的凈光合速率(Pn)顯著高于KO和WT株系，而KO和WT株系之間無顯著性差異。隨著干旱時間延長，三個株系的Pn都呈持續(xù)下降趨勢，且第8 d達最低值。復(fù)水后OE株系的Pn恢復(fù)至正常水平，而KO和WT株系未完全恢復(fù)。

如圖3B所示，干旱處理0 d，OE株系蒸騰速率(Tr)和KO株系之間無顯著差異，WT株系顯著低于突變株系。隨著干旱脅迫程度加劇，各株系Tr都呈持續(xù)下降趨勢。三個株系Tr在第8天達最低值。復(fù)水2 d后各株系Tr均恢復(fù)到正常水平。

圖 2 根系活力和葉綠素含量變化Fig. 2 Changes of root activity and chlorophyll content

如圖3C所示，干旱處理0 d，OE株系氣孔導(dǎo)度(Gs)顯著低于KO和WT株系，KO株系Gs最大。隨著干旱脅迫程度加劇，三個株系的Gs變化趨勢與Tr和Pn一致，都呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢，三個株系Gs在第8天達最低值，且在復(fù)水2 d后恢復(fù)至正常水平。

圖 3 干旱及復(fù)水條件下的光合特征動態(tài)變化Fig. 3 Dynamic changes of photosynthetic characteristics under drought and rehydration conditions

2.4 干旱及復(fù)水條件下MDA和Pro含量變化

如圖 4A所示，正常生長下，OE、KO和 WT株系的 MDA含量無明顯差異，隨著干旱脅迫時間延長，三個株系的 MDA含量都呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在干旱處理第6天達到峰值，復(fù)水2 d后MDA含量降低。OE株系的MDA含量在脅迫任何時期都顯著低于KO株系，表明過表達NtMYB4a可以減少干旱脅迫對細胞膜的損傷。

如圖4B所示，隨著干旱脅迫時間延長，三個株系的Pro含量均顯著增加，且OE株系的Pro含量增加幅度最大，KO株系和WT株系的Pro含量則無明顯差異。

2.5 干旱及復(fù)水條件下抗氧化酶活性變化

如圖5所示，在干旱處理0天時，OE、KO株系的 SOD、POD 活性與WT株系無顯著差異，但隨著脅迫時間的延長 SOD、POD 活性增加，且增加幅度OE株系＞W(wǎng)T株系＞KO株系；復(fù)水2 d后SOD、POD 活性下降。干旱處理0天時，OE株系CAT活性顯著高于KO株系，在脅迫第2天三個株系之間 CAT活性無顯著差異，隨著脅迫時間延長OE株系的 CAT活性增加幅度最大。表明過表達NtMYB4a可以顯著增加煙株在干旱脅迫下的抗氧化能力。

圖 4 干旱及復(fù)水條件下MDA和Pro含量的變化Fig. 4 Changes of MDA and Pro contents under drought and rehydration conditions

圖 5 干旱及復(fù)水條件下抗氧化酶活性變化Fig. 5 Changes of antioxidant enzyme activities under drought and rehydration conditions

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫嚴重影響煙草的生長發(fā)育，表現(xiàn)在形態(tài)、光合能力等諸多方面。本研究中，三個煙草株系在自然干旱8 d后，煙葉對干旱脅迫的敏感程度不同，KO株系葉片接近死亡，對干旱脅迫較為敏感，而 OE株系葉片僅呈現(xiàn)發(fā)黃萎蔫的狀態(tài)，對干旱脅迫相對不敏感。

根系活力反映植物吸收土壤中營養(yǎng)物質(zhì)和水分的能力[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫第2天，3個株系的根系活力均顯著提高，這與張杰等[12]研究結(jié)果一致，說明適度的干旱脅迫能夠刺激根系生長。隨著脅迫程度增加，各株系根系活力逐漸降低，且在復(fù)水后都得到提高，但各時期 OE株系的根系活力均顯著高于WT株系，而KO株系的根系活力低于WT株系。

葉綠素是植物在生長發(fā)育過程中形成光合產(chǎn)物必不可少的成分，其含量可以反映葉片生理活性變化[13]。有研究表明，植物葉綠素含量會隨著干旱脅迫程度的增加而逐漸下降[14]，本研究中各株系在干旱脅迫后葉綠素含量均呈現(xiàn)下降，但是 OE株系的葉綠素含量在干旱脅迫下相較于其他兩種株系均能保持更高的水平。這與霍永錦等[15]的研究結(jié)果一致，說明抗旱性強的品種在干旱脅迫條件下能夠維持較高的葉綠素含量。

植物的光合生理特征受干旱程度和干旱時間的影響[16]。凈光合速率(Pn)是判斷植物有機物累積速度快慢的重要指標之一，植物對逆境的耐受能力與凈光合速率呈正相關(guān)關(guān)系。此外，蒸騰速率(Tr)和氣孔導(dǎo)度(Gs)是衡量植物葉片保水能力的主要指標，植物葉片保水能力與蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度呈負相關(guān)關(guān)系。研究表明，植物受到干旱脅迫會導(dǎo)致葉片氣孔關(guān)閉，使胞間CO2濃度升高，進而降低Pn及Tr[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著干旱脅迫時間延長，三個株系的Pn、Gs及Tr顯著降低，而OE株系在干旱脅迫處理過程中Pn顯著高于WT株系，說明OE株系對干旱的耐受能力更強，能夠更好地維持植株生長。同時OE株系的Gs及Tr相對較低，其保水性能可能較好。

干旱脅迫會引起植物體內(nèi)活性氧(ROS)形成，使膜脂質(zhì)過氧化，積累丙二醛(MDA)[18]，損傷植物細胞膜。脯氨酸(Pro)作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對細胞的滲透調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵作用[19]。由于抗氧化脅迫性常被用來判斷植物抗旱能力[20]，植物自身可通過產(chǎn)生如SOD、POD和CAT等抗氧化酶來清除活性氧。增強植物的抗氧化防御能力可以提高植物對不同脅迫因子的耐受性[21]。本研究表明，在干旱脅迫條件下，OE株系的MDA含量顯著低于WT株系，Pro含量顯著高于WT株系，且隨著脅迫時間延長，OE株系相較于WT株系始終具有更高的SOD、POD和CAT活性，而KO株系的SOD、POD和CAT活性相較于WT株系更低。這說明OE株系遭受的膜損傷更小，且干旱處理后細胞膜更穩(wěn)定。

綜上所述，NtMYB4a過表達的株系在受到干旱脅迫時，其煙葉枯萎程度低，光合能力和根系活力更強，抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性更高，細胞膜損傷也較小，在復(fù)水后相關(guān)生理指標的恢復(fù)程度也更好。表明過表達 NtMYB4a基因可以增強煙草抗旱能力。